Summary
Sperman kondensering krävs för spermierna att bli befriade från seminal gelen. Denna studie ger förfarandena för insamling av sperma från de kvinnliga fortplantningsorganen efter samlag, och sperma kondensering mättid.
Abstract
Hos möss deponeras ejakulerad sperma i livmodern. Efter utlösning, sperman ändrar konsistens från gel-liknande till vattnig, en process som kallas liquefaction. I denna studie visar vi hur man samlar in efter ejakulerad sperma från kvinnliga fortplantningsorganen i en musmodell. Första, vuxen honmöss i brunst scenen var inrymt i en manlig buren över natten. Nästa morgon, bekräftades parning av närvaron av copulatory plug på slidöppningen. Honmöss med copulatory pluggar var euthanized, och varje fortplantningsorganen samlades som helhet (slidan, livmodern, oviducts, äggstockarna), säkerställa ett slutet system innehåller sperman. Fortplantningsorganen placerades i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, och slidan var avskuren för att släppa sperman i röret. För att säkerställa maximal sperma volym för analys, användes tandlös pincett klämma uterin hornen från äggstockarna slutet till vaginal slutet utvisa kvarvarande sperma. Hela fortplantningsorganen var sedan kasseras. Sperma-innehållande röret knoppades kort ner. 25 μL kapillär pipett placerades in i röret i 180° vinkel (parallell till rörväggen). Mängden tid som används för att fylla kapillärröret till raden 25 μL spelades. Sperma från en bevisad manliga uppfödare tar normalt ca 60-180 s att fylla ett 25 μL kapillärrör. Denna sperma samling teknik kan också användas i andra nedströms tillämpningar såsom spermier imaging och motilitet analys.
Introduction
De kvinnliga fortplantningsorganen består av de övre och nedre skrifter. Övre fortplantningsorganen inkluderar äggledarna, livmodern och livmoderhalskanalens. Lägre fortplantningsorganen ingår i ectocervix och slidan. I människor sätts ejakulerad sperma på den främre väggen av vagina, angränsande till ectocervix1. I möss, men sveps sperman in i livmodern inom minuter efter parning2.
Sperma innehåller banbrytande gel som är stelnat inom sekunder efter utlösning, orsakar spermierna att bli anhållna och orörlig3. Kondensering släpper immobiliserade spermier genom att ändra sperma från en gel-liknande en vattnig konsistens. Denna process är nödvändigt för spermiernas rörlighet och däggdjur reproduktion. Kunskap om sperma kondensering är mestadels baserade på in vitro- studier där sperma blir flytande i en kultur maträtt. I människor är den enzymatiska aktiviteten av prostataspecifikt antigen eller PSA (kallas även kallikrein-relaterade-hämmare 3 eller KLK3) den största bidragsgivaren för kondensering genom hydrolys av semenogelins (gelbildande proteiner finns i sperma)4 ,5,6. Nedbrytning av semenogelins frigör spermier från seminal koaglet, öka spermier rörlighet. Frigörs spermier simma mot äggledaren att befrukta ägget. Kondensering (eller sperma viskositet) tester är en av standard första visningarna för spermaanalys i fertilitetskliniker att bedöma manlig fertilitet7.
En nyligen publicerad artikel visar att analys av sädesvätskan samlas in från den kvinnliga mus fortplantningsorganen efter parning kan användas för att illustrera en brist i kondensering som därefter kan orsaka fertilitet defekter8. Defekt kondensering såsom sperma hyperviskositet bidrar till 11,8-32,3% av infertila män9, tyder på att normal kondensering är oumbärlig för däggdjur reproduktion. Dock har studier och behandling av kondensering defekter fokuserat på den manliga7. Möjligheten att de kvinnliga fortplantningsorganen spelar en roll i sperma kondensering har inte undersökts. Därför är metoder för seminstation och kondensering mättid ger forskare en roman diagnostiskt verktyg för att avgöra huruvida kondensering kan vara en av orsakerna till infertilitet i modell organismen av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur och förfaranden som används i denna studie sköttes enligt Washington State University (WSU) djur vård och användning kommittén riktlinjer och i enlighet med WSU-godkända djur protokoll #4702 och #4735.
1. möss
-
Använd standard C57BL/6J vuxna manliga möss eller andra stammar av intresse. Upprätthålla djur under en temperatur - och luftfuktighet-kontrollerad miljö, ad libitum tillgång av vatten och mat.
- Använda manliga uppfödare alltifrån 8 veckor till 10 månader gammal. Använd endast beprövade uppfödare i experimenten.
-
Använda vuxna kvinnliga möss med en vävnad selektiv radering av fortplantningsorganen östrogen receptor α (kodad av Esr1 gen) i epitelceller10 (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, kallas knockout eller ”KO”) och styra littermates (Esr1f/f, kallas ”CTRL”) i denna studie.
- Använd 8 veckor gamla Honor. Åldrar kvinnor varierade beroende på experiment av intresse.
- Fastställa stadier av östruscykel på morgonen vid 08:00 h. Använd endast honor i brunst skede av cykeln. För detaljerade metoder för vaginal smetar och Cytologisk analys, se tidigare publicerade förfaranden11.
2. parning och bedöma Copulatory pluggar
- Vid dagen för brunst (16:00 h), hus honan i en manlig bur.
- Nästa morgon 08:00 h, separat honan från manliga musen.
- Använda en anpassning av en tidigare publicerade metod12 komma åt närvaron eller frånvaron av en vaginal eller copulatory plugg som en indikation på parning.
- Håll den kvinnliga musen från basen av svansen kort lyfta bakbenen.
- Hitta den copulatory pluggen av närvaron av en benvit seminal koagulatet vid slidöppningen med hjälp av en tandpetare. Om copulatory kontakten är närvarande, kommer tandpetare inte att kunna införas i den vaginala kanalen.
3. förberedelser innan vävnad samling
- Förbereda 10 mL Leibovitzs l-15 media, kompletteras med 1% fetalt bovint serum (kallas L15 media + 1% FBS) i en 15 mL tub. Inkubera media vid 37 ° C under 15 minuter i ett vattenbad.
- För att bevara livskraften av vävnad och spermier för nedströms tillämpningar, alikvotens 2 mL före värmde L15 media + 1% FBS i en 2 mL mikrocentrifug rör för vävnad samling.
- Värma arrangera av stereomikroskopet till 37 ° C. Värme-blocket till 37 ° C och placera en tom 1,5 mL mikrocentrifug rör i blocket.
- Om de efterföljande program kräver avbildning av spermiernas rörlighet, varma glas bilden till 37 ° C.
4. vävnad samling
- Ta pre värmde L15 media + 1% FBS alikvot till området vävnad samling.
- Euthanize honan (~ 08: 30h) använder koldioxid kvävning följt av cervikal dislokation.
Obs: Detta är cirka 8 h efter parning, förutsatt att parningen sker vid midnatt. - Placera djuret i ryggläge att exponera buken.
- Spray 70% alkohol på buken nära bakbenen.
- Använda dissekera saxen för att göra ett litet snitt (~ 1 cm) på huden på nedre delen av buken.
- Använd den dominerande handen dra svansen (och bakbenen vid behov) medan icke-dominanta hand drar huden i motsatt riktning (mot huvudet) för att exponera bukmuskeln. Denna metod används för att minimera mängden hår förorening till viscerala organ.
- Skär magmuskelstation i V-form vid basen av buken, intill slidan, att exponera de viscerala organ.
- Flytta tarmar och bukfett åt sidan för att exponera fortplantningsorganen.
- Trimma bort urinblåsan och andra vävnader ovanför underlivet.
- Skär blygdbenssammanfogningen isär för att få tillgång till den vaginala vävnaden.
- Lyft den vaginala vävnaden vid slidöppningen och använda sax för att separera den vaginala kanalen från rektal vävnaden.
- Försiktigt trimma bort mesenterica fettet från båda sidor av livmodern med våren sax.
FÖRSIKTIGHET: Livmodern är mycket bräcklig med sperma inuti. Var noga med att inte punktera livmodern, annars sperman kommer att gå förlorade. - Lyft den nedre genitalia och skär cystor fettet pad från båda sidor.
- Överför hela fortplantningsorganen i röret före värmde Leibovitzs l-15 media + 1% FBS.
5. mätning av sperma kondensering (viskositet) från livmodern innehållssamling
- På uppvärmd scenen av stereomikroskopet, värmde överföring vävnader i en 35 mm steril vävnadsodling skål fylld med 3,5 mL före l-15 media + 1% FBS att rengöra vävnader i blod och andra föroreningar.
FÖRSIKTIGHET: Medan tvätt, greppa vävnader av fett, inte i livmodern. Vid denna punkt, sperman förväntas vara intakt inne i livmodern. - Blot vävnader i överskott media med laboratorium våtservetter.
- Håll vävnaden i vaginal slutet medan placera cystor ändarna i den förvärmda mikrocentrifug rör. Medan du håller vaginal slutet, skär livmoderns horn vid basen av livmodern, vilket gör att livmoderns horn falla i mikrocentrifug röret.
- Låt sperman flöde ur livmodern hornen i röret. Använd tandlös pincett att försiktigt pressa livmoderns horn från äggstockarna slutet till vaginal slutet, utvisa ut överblivna sperma.
- Kassera vävnaderna i biohazard väska och förbränna.
- Kort snurra ner sperman i en minicentrifuge (~ 1-2 s).
- Lägg röret, parallellt med uppvärmd scenen - sperma kommer inte spilla ut.
- Har timern redo och inställd på 'räkna '.
- Infoga ett 25 µL kapillärrör i sperma provet i 180° vinkel (parallellt med rörväggen). Detta är att minimera variabiliteten mellan varje utredare från att hålla kapillärröret i olika vinklar.
- Tryck på timer så snart kapillärröret gör kontakt med sperma.
- Registrera den tid (s) som det tar för sperman att nå 25 µL linje.
- När mätningen är klar omedelbart lägga röret som innehåller sperma tillbaka i torr värme block för ytterligare funktionell analys, t ex video imaging av spermiernas rörlighet.
- Desinficera den kapillärrör innehållande sperma doppa röret i 10% blekmedel lösning för 20 min och kassera kapillärröret i behållaren för vassa föremål.
6. video avbildning av spermiernas rörlighet
- Slå på mikroskopet och video avbildningsprogrammet.
- Överför med pipett 20 µL av kvarvarande sperma in i pre värmda glas bilden, medan glasskiva placeras på den uppvärmda scenen.
- Täck med ett täckglas.
- Placera bilden täckglas sidan nedåt på mikroskopet.
- Använd 20 X objektiv för att hitta intresseområde.
- Ändra till 100 X objektiv för video avbildning.
- Spela in video på 12 bildrutor/s (fps) för 30 s.
- Slumpmässigt spela in videor i minst 3 olika områden per djur.
- Utföra imaging snabbt och minimera ljusexponering till bild för att bevara spermier motilitet och.
Obs: Denna avbildning förfarande bör göras inom 2-3 min. - Utföra dataanalys med ImageJ programvara som tidigare beskrivits8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sperman samlats från CTRL och KO honor ca 8 h efter parning med bördiga CTRL hanar. Kondensering (eller sperma viskositet) kvantifieras i den tid det tar att fylla 25 μL kapillärrör med sperma. Sperma som samlats från CTRL livmödrar tog 2.06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) att fylla i kapillärrör (figur 1). Den sperma som samlats från KO livmödrar tog dock längre än 60 min (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) experimentell tid. Dessa data tyder på att sperman är betydligt mer kondenserad eller mindre trögflytande i CTRL jämfört med KO livmödrar.
För att illustrera en av de efterföljande program för insamling av sperma från kvinnliga fortplantningsorganen, bedömdes spermierörlighet med hjälp av video imaging. Sperman som samlats från de CTRL livmödrar visade fritt-simning spermier inom fältet mikroskopiska representerade i ögonblicksbilden i figur 2A. Sperma som samlats in från de KO livmödrarna visade att majoriteten av spermier var grupperade tillsammans med minimal rörlighet (figur 2B). Dessa fynd tyder på att sperman som samlats från kvinnliga fortplantningsorganen 8 h efter parning kan användas för ytterligare spermier analys.
Figur 1 : Kondensering tid (sperma viskositet) från sperma som samlats in från mus livmödrar. Grafisk representation av kondensering tiden (min) av sperma som samlats från CTRL och KO livmödrar ca 8 h efter parning. Uppgifterna representerar mean±S.E.M., n = 5 honor/genotyp. p < 0,001, oparade Student t -test. Anpassad från tidigare publicerade resultat8 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa bilder av spermier i sädesvätskan samlas in från mus livmödrar. Representativa ögonblicksbilder från video bildtagning på 1000 X förstoring av spermier i sädesvätskan samlas in från (A) CTRL och B KO livmödrar. Anpassad från tidigare publicerade resultat8 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Insamling av sperma från mus livmödrar kan ge fördelar över sperma analys i vitro som den förstnämnda kan illustrera de fysiologiska interaktioner mellan sperman och sekret från kvinnliga fortplantningsorganen. De tekniker som presenteras i denna studie kan forskare avgöra sperma kvalitet samt spermier livskraft och motilitet i idealisk fysiologiska förhållanden. Dessutom finns det olika nedströms analyser som kan utföras med den sperma som samlats från livmödrarna, exempelvis spermier kan räknas för att bestämma antalet faktiska spermier kommer in i livmodern och spermier kan också avbildas för motilitet analyserna. Den perfekta tidpunkten att samla sperma för befruktning kapacitet bör vara inom 1 till 2 h efter parning1.
Förutom de tidigare nämnda nedströms tillämpningarna, utredare kan också utvärdera effekterna av hämmare/föreningar av intresse på sperma transport processer, såsom sperma kondensering (eller sperma viskositet), spermier nummer i tarmkanalen, sperma motilitet, eller spermier migration till olika områden av kvinnliga fortplantningsorganen. Föreningarna kan tillämpas i de kvinnliga fortplantningsorganen före parning8. Då kan effekterna av dessa hämmare/föreningar bedömas från sperma provet efter parning. Dessa metoder kan vara bra att testa praktiskhet i preventivmedel läkemedel som hämmar sperma transport.
Avgörande punkter av vederlag för sperma insamling och kondensering/viskositet mätningar är känsligheten hos spermier och vinkeln på kapillärröret. Spermier är känsliga för temperaturförändringar. Om efterföljande analys av spermier funktion och motilitet är viktigt för experimentella resultat, vävnaden och sperman måste hållas vid 37 ° C på alla gånger, med minimal exponering för ljus. Om det finns flera prover att samla in från flera honor, euthanize djuren en samtidigt för att minimera väntan. För kondensering mätning generera olika vinklar av kapillärröret inkonsekvenser i kondensering tid. Därför har utredarna att hålla kapillärröret parallellt med rörväggen (i 180° vinkel) för att minimera variabiliteten skapad av varje utredare. Spermaprov bör inte samlas in senare än 09:00 h, detta beror på att vätska reabsorption i livmodern. Utredaren kan inte få tillräckligt flytande material för kondensering mätning.
Det är fastställt att sperma kondensering medieras främst av den enzymatiska aktiviteten av PSA utsöndras från prostatakörteln13. Det finns dock begränsade studier att fastställa rollerna för kvinnliga fortplantningsorganen under i vivo kondensering processen8. Samlingen av sperma från kvinnliga fortplantningsorganen ger därför en avgörande fördel att studera kondensering processer i vivo, efter sperma har varit utsatt för sekret från de kvinnliga fortplantningsorganen14. Sammanfattningsvis kan efter ejakulerad sperma kondensering/viskositet mätning forskarna att dechiffrera samspelet mellan sperma och kvinnliga fortplantningsorganen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av College av Veterinary Medicin (WSU) startfonden till WW. Författarna vill tacka Sierra Olsen (WSU) för kritisk läsning av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H. Cell biology of semenogelin. Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , Cambridge, MA (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
