Summary
Семен сжижения необходим для спермы, чтобы освободиться от семенных геля. Это исследование содержит процедуры для сбора спермы от женского репродуктивного тракта после полового акта и Семен сжижения время измерения.
Abstract
В мышей которое преодолевает эякулированное семя осаждается в матке. После эякуляции, Семен изменяет последовательность с гель как водянистые, процесс называется сжижение. В этом исследовании мы покажем, как собрать после которое преодолевает эякулированное семя от женского репродуктивного тракта в мышиной модели. Во-первых, взрослых самок мышей в стадии эструса были размещены в клетке мужчина на ночь. Следующим утром, совокупление было подтверждено наличие копулятивного вилку на влагалище. Самок мышей с копулятивного вилки были умерщвлены, и каждый репродуктивного тракта была собрана в целом (влагалища, матки, яйцеводов, яичников), обеспечение закрытой системы содержат спермы. Репродуктивного тракта был помещен в пробки microcentrifuge 1,5 мл, и влагалища был отрезан выпустить спермы в трубу. Для обеспечения максимальной спермы тома для анализа, беззубый щипцы были использованы для выжать матки рога из яичников конца для вагинального конца изгнания оставшихся спермы. Весь репродуктивного тракта был затем отбрасывается. Семен содержащих трубки был кратко вращаться вниз. 25 мкл капиллярной пипеткой был помещен в трубу под углом 180° (параллельно стенкам трубки). Количество времени, используемый для заполнения капиллярную трубку к линии 25 мкл был записан. Сперма из проверенных мужской заводчик обычно занимает около 60-180 s для заполнения 25 мкл капиллярной трубки. Этот метод сбора спермы может также использоваться в других нисходящие приложения, такие как анализ изображений и подвижности спермы.
Introduction
Женского репродуктивного тракта состоит из верхней и нижних участков. Верхняя репродуктивного тракта включает фаллопиевы трубы, матка и эндоцервикса. Нижняя репродуктивного тракта включает в себя ectocervix и влагалище. В организме человека которое преодолевает эякулированное семя осаждается на передней стенке влагалища, прилегающих к ectocervix1. В мышей однако, Семен заметен в полость матки в течение нескольких минут после спаривания2.
Семен содержатся семенных гель, который затвердевает в течение нескольких секунд семяизвержение, вызывая спермы, чтобы быть в ловушке и иммобилизованные3. Сжижение выпускает подвижности сперматозоидов, изменив спермы с гель как к водянистой консистенцией. Этот процесс имеет важное значение для сперматозоидов и mammalian воспроизведение. Знание Семен сжижения основана главным образом на в vitro исследования где спермы становится сжиженные в культуры блюдо. В организме человека Ферментативная активность Простатоспецифический антиген или PSA (также известный как калликреин связанных пептидаза 3 или KLK3) является основным донором для разжижения путем гидролиза semenogelins (гелеобразующий белков, присутствующих в сперме)4 ,5,6. Деградации semenogelins освобождает спермы от семенных сгусток, увеличение подвижности сперматозоидов. Освободил спермы плавать к маточной трубе, чтобы оплодотворить яйцеклетку. Сжижение (или вязкость спермы) тесты являются одним из стандартных первоначальный показы для анализа спермы в рождаемость клиники для оценки фертильности мужчин7.
Недавно опубликованные статьи показывает, что анализ семенной жидкости, собранные от репродуктивного тракта женский мыши после спаривания может использоваться для иллюстрации дефицит сжижения, которые впоследствии могут вызвать плодородие дефекты8. Дефектные разжижения таких Семен повышенной способствует 11,8-32,3% случаев бесплодных мужчин9, о том, что нормальный сжижения незаменимым для млекопитающих размножения. Однако исследования и лечения дефектов сжижения были сосредоточены исключительно на мужчин7. Возможность, что женского репродуктивного тракта играет определенную роль в Семен сжижения не изучены. Таким образом методы для сбора спермы и сжижение время измерения обеспечит исследователи романа диагностический инструмент для определения ли сжижения может быть одной из причин бесплодия в организме модель интерес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные и процедуры, используемые в данном исследовании были обработаны согласно Вашингтон государственного университета (Вашингтон) животное уход и использование Комитетом руководящих принципов и в соответствии с WSU утвержденных животных протоколы #4702 и #4735.
1. мышь
-
Использование стандартных взрослых самцов мышей C57BL/6J или другие штаммы интерес. Сохранить животных под контролем температуры и влажности среды, с доступом ad libitum воды и пищи.
- Использование мужского заводчиков, начиная от 8 недель до 10 месяцев. Используйте только проверенные селекционеров в экспериментах.
-
Использовать в эпителиальных клеток10 взрослых самок мышей с выборочного удаления ткани репродуктивного тракта эстроген рецептор α (кодируется геном Esr1 ) (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, называется нокаут или «Ко») и контролировать однопометники (Esr1f/f, под названием «CTRL») в этом исследовании.
- Используйте 8 недели старый женщин. Возраст женщин варьируется в зависимости от эксперимента интерес.
- Определите этапы эстрального цикла утром в 08:00 ч. Используйте только самки на стадии эструса цикла. Для подробных методов вагинальная смазка и цитологического анализа обратитесь к ранее опубликованным процедурам11.
2. спаривания и оценки копулятивного вилки
- В день течки (16:00 h) дом девушки в клетке мужчины.
- Утром следующего дня (08:00 h), отдельные женщины от мужчины мыши.
- Используйте адаптация опубликованных ранее метод12 для доступа наличие или отсутствие вагинальный или копулятивного вилка как признак спаривания.
- Держите женского мышь от основания хвоста кратко поднять задних конечностей.
- Найти вилку копулятивного наличием беловатого семенных сгусток на влагалище с помощью зубочистки. Если присутствует копулятивного вилка, зубочистка не будет возможность быть вставлен в вагинальный канал.
3. Подготовка перед ткани коллекции
- Подготовка 10 мл Лейбовиц L-15 СМИ, дополнена плода бычьим сывороточным 1% (называется L15 СМИ + 1% FBS) в 15 мл. Инкубируйте СМИ при 37 ° C 15 мин в капилляре.
- Для того, чтобы сохранить жизнеспособность тканей и спермы для нисходящие приложения, аликвота 2 мл подогретым L15 СМИ + 1% FBS в 2 мл microcentrifuge трубки для коллекции тканей.
- Теплый этап стереомикроскопом до 37 ° C. Установка тепло блок до 37 ° C и место пробки microcentrifuge пустой 1,5 мл в блоке.
- Если нисходящие приложения требуют изображений сперматозоидов, теплое стекло слайд 37 ° C.
4. ткани коллекции
- Принесите подогретым L15 СМИ + 1% Алиготе FBS в область коллекции тканей.
- Усыпить самка (~ 08: 30h) с использованием двуокиси углерода удушение следуют шейки матки дислокации.
Примечание: Это около 8 ч после спаривания, предполагая, что спаривание происходит в полночь. - Место животного в лежачем положении, чтобы разоблачить брюшной области.
- Spray 70% спирта на животе возле задних конечностей.
- Используйте рассечения ножницы сделать небольшой надрез (~ 1 см) на кожу нижней части живота.
- Используйте доминирующей рукой тянуть хвост (и задних конечностей при необходимости) в то время как недоминирующих руку тянет кожи в противоположном направлении (в сторону головы) подвергать брюшной мышцы. Этот метод используется для сведения к минимуму количество волос загрязнения внутренних органов.
- Вырежьте V-образной формы на базе органов брюшной полости, прилегающей к влагалища, подвергать висцеральных органов брюшной мышцы.
- Двигаться в сторону, чтобы разоблачить репродуктивного тракта кишечника и брюшной жир.
- Обрежьте мочевого пузыря и другие ткани выше вагинальной области.
- Разрежьте лобковой симфиза получить доступ к вагинальной ткани.
- Поднимите вагинальной ткани на влагалище и используя ножницы для разделения вагинальный канал от ректального ткани.
- Осторожно обрежьте брыжеечных жира с обеих сторон матки с помощью ножниц весной.
Предупреждение: Матки очень нестабильна с спермы внутри. Будьте осторожны, чтобы не пункции матки, или же спермы, будут потеряны. - Поднимите нижний репродуктивного тракта и вырезать яичников жировой ткани с обеих сторон.
- Передача всей репродуктивного тракта в трубу L-15 СМИ + 1% подогретым Лейбовиц FBS.
5. Измерение сжижение (вязкость) спермы из матки содержимого коллекции
- На сцене с подогревом стереомикроскопом, передачи тканей в 35 мм стерильные тканевой культуры блюдо заполнены с 3,5 мл предварительно разогретую L-15 СМИ + 1% FBS очистить ткани крови и других загрязнений.
ВНИМАНИЕ: Во время стирки, захватите ткани, жир, не матки. На данный момент, Семен ожидается быть неповрежденной внутри матки. - Пятно тканей избыток средств массовой информации, с использованием лабораторных салфетки.
- Удерживая ткани влагалища конце размещение яичников заканчивается в предварительно нагретой microcentrifuge трубки. Придерживая конец влагалища, вырежьте маточные рожки на базе матки, позволяя маточные рожки попасть в пробки microcentrifuge.
- Пусть спермы поток из рога матки в трубу. Используйте беззубый щипцами Осторожно выжать матки рога из яичников конца до конца влагалища, изгнав из остатки спермы.
- Отменить ткани в биологической мешок и сжигать.
- Кратко вращаться вниз спермы в minicentrifuge (~ 1-2 s).
- Положите трубку, параллельно с подогревом стадии - Семен не будет проливаться.
- Есть таймер готов и установить «подсчитать».
- Вставьте 25 мкл капиллярной трубки в образца спермы под углом 180° (параллельно стенкам трубки). Это должно минимизировать изменчивость между каждого следователя от проведения капиллярную трубку под разными углами.
- Нажмите таймер, как только капиллярной трубки делает контакт с спермы.
- Рекордное время (s), он принимает для спермы до 25 мкл линии.
- По окончании измерения немедленно положите трубку, содержащие сперму обратно в блоке сухого тепла для дальнейшего функционального анализа, таких как видео изображений сперматозоидов.
- Продезинфицируйте капиллярной трубки, содержащие сперму, погружая трубку в раствор 10% отбеливателя для 20 мин и отбросить капиллярной трубки в Шарпс контейнер.
6. видео изображений сперматозоидов
- Включите в микроскоп и видео изображений программное обеспечение.
- Пипетка 20 мкл оставшиеся спермы на слайд подогретым стекла, в то время как стеклянное скольжение помещается на сцене с подогревом.
- Крышка с coverslip стекла.
- Место на стороне coverslip слайд вниз на микроскопе.
- Используйте 20 X объектив, чтобы найти области интереса.
- Изменить на 100 X объектив для видео изображения.
- Запись видео на 12 кадров в секунду (fps) для 30 s.
- Случайно Запишите видео в по крайней мере 3 различных областях на животное.
- Выполнение визуализации быстро и сведения к минимуму воздействия света на слайд с целью сохранения сперматозоидов и жизнеспособности.
Примечание: Эта процедура обработки изображений должно быть сделано в течение 2-3 мин. - Выполните анализ данных, с помощью ImageJ программного обеспечения, как описано выше8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сперма была собрана из CTRL и KO самок около 8 ч после спаривания с плодородной CTRL мужчины. Сжижение (или вязкость спермы) количественно, время, необходимое для заполнения 25 мкл капиллярной трубки с спермы. Семен, собранные из матки CTRL взял 2.06 мин ±0.12 (mean±S.E.M, n = 5) для заполнения капиллярную трубку (рис. 1). Однако, Семен, собранных от KO матки занимает больше времени, чем 60 мин (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) экспериментальной времени. Эти данные позволяют предположить, что сперма значительно более сжиженный или менее вязкой в CTRL по сравнению с KO матки.
Чтобы проиллюстрировать один из нисходящие приложения сбора спермы от женского репродуктивного тракта, сперматозоидов оценивалась с использованием видео визуализации. Сперма собраны из матки CTRL, показал сперматозоиды свободно купание в микроскопическом поле, представлены в моментальный снимок на рисунке 2A. Семен, собранные из матки KO показал, что большинство спермы были сгруппированы вместе с минимальной мобильности (Рисунок 2Б). Эти результаты показывают, что сперма собраны из женского репродуктивного тракта 8 ч после спаривания могут быть использованы для дальнейшего анализа спермы.
Рисунок 1 : Время сжижения (Семен вязкость) от спермы собраны от мыши матки. Графическое представление сжижения время (мин) спермы собраны из CTRL и KO матки приблизительно 8 ч после спаривания. Данные представляют собой mean±S.E.M., n = 5 самок/генотипа. p < 0,001, непарные студент t -теста. Взято из ранее опубликованные результаты8 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель изображения сперматозоидов в сперме, собранных от мыши матки. Представитель снимки из видео изображений, принятых на 1000 X увеличение сперматозоидов в сперме собранные от CTRL (A) и (B) KO матки. Адаптировано из ранее опубликованные результаты8 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сбор спермы от мыши матки может предоставить преимущества над Семен анализ в пробирке , как первый можно проиллюстрировать физиологические взаимодействий между спермы и выделениями из женского репродуктивного тракта. Методы, представленные в настоящем исследовании позволяют исследователям определить качество спермы, а также жизнеспособность спермы и подвижности в идеальных физиологических условиях. Кроме того существуют различные течению анализы, которые могут быть выполнены с использованием спермы, собранные из матки, например, сперматозоиды могут быть подсчитаны для определения фактической спермы номер, введя матки и спермы также может быть imaged для анализов подвижности. Точка идеальное время для сбора спермы для оплодотворения система должна быть в пределах 1-2 ч после спаривания1.
В дополнение к ранее упомянутых нисходящие приложения, следователи также можно оценить эффекты ингибиторов/соединений интерес на спермы процессов, например Семен сжижения (или вязкость спермы), количество спермы в урочище, спермы подвижность, или миграции сперматозоидов в различные области женского репродуктивного тракта. Соединения могут быть применены в женского репродуктивного тракта до спаривания8. Затем можно оценить воздействие этих ингибиторов/соединений из образца спермы после спаривания. Эти методы могут быть полезны для тестирования практичности противозачаточные препараты, которые подавляют транспорт спермы.
Чувствительность спермы и угол капиллярной трубки принципиальных моментов рассмотрения для измерения коллекции и сжижение/вязкость спермы. Спермы чувствительны к изменению температуры. Если течению анализ спермы функция и моторики имеет важное значение для экспериментальных результатов, ткани и Семен должны храниться при 37 ° C на всех времен, с минимальным воздействием на свет. Если есть несколько образцов для сбора от нескольких самок, усыпить животных один на время, чтобы свести к минимуму ожидание. Для разжижения измерения различные углы капиллярной трубки генерировать несоответствия в время разжижения. Таким образом следователи должны провести параллельно стенкам трубки капиллярной трубки (под углом 180°) для сведения к минимуму изменчивость, созданные каждой следователь. Образца спермы следует собирать не позднее 09:00 h, это из-за жидкости реабсорбции в матке. Следователь не может получить достаточное количество жидкости материала для сжижения измерения.
Установлено, что Семен сжижения преимущественно опосредовано Ферментативная активность PSA, выделяется из предстательной железы13. Однако существуют ограниченные исследования для определения роли женского репродуктивного тракта во время в естественных условиях процесс сжижения8. Таким образом коллекция спермы от женского репродуктивного тракта обеспечивает критическое преимущество для изучения разжижения процессы в естественных условиях, после того, как сперма подвергается выделениями из женского репродуктивного тракта14. В заключение, после которое преодолевает эякулированное семя сжижения/вязкость измерения позволяет исследователям расшифровать взаимодействие между спермы и женского репродуктивного тракта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается Фондом Колледжа ветеринарной медицины (WSU) запуска для WW. Авторы благодарят Сьерра Олсен (WSU) для критических чтении этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H. Cell biology of semenogelin. Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , Cambridge, MA (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
