Summary
ניזול זרע נדרש הזרע להשתחרר הג'ל הזרע. מחקר זה מספק את נהלי איסוף זרע מן באיברי הרבייה הנקביים שלאחר ההזדווגות, ומדידת זמן ניזול זרע.
Abstract
בעכברים, פלטה הזרע החודר לתוך הרחם. לאחר השפיכה, הזרע משתנה עקביות דמוי ג'ל כדי דומעות, תהליך הנקרא ניזול. במחקר זה, נראה כיצד לאסוף את הזרע פוסט-ejaculated באיברי הרבייה הנקביים במודל של עכברים. עכברים הנשי הראשון, מבוגרים על הבמה ייחום שוכנו לכלוב של הזכר בן לילה. למחרת בבוקר, הזדווגות אושר על ידי הנוכחות של הכנס copulatory בפתח הנרתיק. עכברים נקבה עם תקעים copulatory היו מורדמים, נאסף כל באיברי הרבייה בכללותה (הנרתיק, הרחם, oviducts, השחלות), המבטיח מערכת סגורה כדי להכיל את הזרע. מערכת הרבייה הונח צינור microcentrifuge 1.5 mL, הנרתיק חתכו אותה כדי לשחרר את הזרע לתוך הצינור. כדי להבטיח נפח הזרע המרבי עבור ניתוח, מלקחיים חסר שיניים שימשו כדי לסחוט את הקרניים הרחם השחלות מקצה לקצה הנרתיק גירוש הזרע שנותרו. מערכת הרבייה לגמרי ואז אבדו. הצינור המכיל זרע היה טוו בקצרה למטה. פיפטה נימי 25 μL הונח לתוך הצינור בזווית של 180 מעלות (במקביל לקיר tube). כמות הזמן נהגו למלא את צינור קפילרי לקו μL 25 הוקלט. זרע מן המגדל זכר מוכחת בדרך כלל לוקח כ 60-180 s כדי למלא צינור קפילר 25 μL. טכניקה זו של אוסף זרע יכול לשמש גם ביישומים אחרים במורד הזרם כגון הדמיה וניתוח תנועתיות הזרע.
Introduction
מערכת הרבייה הנשית מורכבת ספינלי העליון והתחתון. מערכת הרבייה העליון כולל החצוצרות, הרחם endocervix. מערכת הרבייה נמוכה יותר כולל את ectocervix הנרתיק. בבני אדם, הזרע ejaculated הופקד אצל הקיר הקדמי של הנרתיק, הסמוך ectocervix1. בעכברים, עם זאת, הזרע הוא נסחף לתוך הרחם תוך דקות לאחר ההזדווגות2.
הזרע מכיל ג'ל הזרע הוא פני השטח למוצק בתוך שניות של שפיכה, גורם את הזרע כדי להיות לכודים,3. מרותק למיטה. ניזול משחרר את הזרע קיבוע על-ידי שינוי זרע מדמוי ג'ל מימית עקביות. תהליך זה הוא חיוני תנועתיות הזרע ורביה יונקים. הידע של זרע ניזול מבוססת בעיקר על במבחנה מחקרים שבו זרע הופך מעובה בקערה תרבות. בבני אדם, הפעילות האנזימטית מתרחשת של הערמונית אנטיגן ספציפי או ה-PSA (הידוע גם kallikrein הקשורות peptidase 3 או KLK3) הוא התורם העיקרי עבור ניזול באמצעות הידרוליזה של semenogelins (יוצרי ג'ל חלבונים המצויים הזרע)4 ,5,6. השפלה של semenogelins משחררת את הזרע של coagulum הזרע, הגדלת ניידות זרע. פריד זרע לשחות לעבר החצוצרה כדי להפרות את הביצית. ניזול (או זרע צמיגות) בדיקות הם אחד הקרנתם הראשונית סטנדרטי עבור בדיקת זרע במרפאות פוריות כדי להעריך את פוריות הגבר7.
מאמר שפורסם לאחרונה מראה כי ניתוח של נוזל הזרע שנאסף את העכבר הנשי באיברי הרבייה שלאחר ההזדווגות יכולה לשמש להמחשת חוסר ניזול שיכולים לגרום לאחר מכן ליקויי פוריות8. ניזול פגומים כגון לרטרו זרע תורם 11.8-32.3% מהמקרים עקרה גברים9, רומז ניזול נורמלי הוא הכרחי עבור רבייה יונקים. עם זאת, מחקרים וטיפול של פגמים ניזול התמקדו אך ורק זכר7. האפשרות כי באיברי הרבייה הנקביים ממלאת תפקיד הזרע ניזול לא נחקרו. לכן, שיטות איסוף זרע ומדידת זמן ניזול יספק לחוקרים כלי אבחון הרומן כדי לקבוע אם ניזול יכול להיות אחד הגורמים לאי פוריות באורגניזם מודל עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל בעלי החיים, הליכים המשמשים במחקר זה מטופל בהתאם להנחיות אכפת לי חיה אוניברסיטת מדינת וושינגטון (WSU) והוועדה שימוש ובציות שאושרו על-ידי WSU בעלי חיים פרוטוקולים #4702, #4735.
1. עכברים
-
שימוש רגיל C57BL/6J למבוגרים זכר עכברים או זנים אחרים של ריבית. לשמור על חיות תחת סביבת טמפרטורה, לחות-מבוקרת, עם ad libitum גישה של מים ומזון.
- השתמש מגדלים זכר ועד בן 8 שבועות בן 10 חודשים. השתמש רק מוכח מגדלים בניסויים.
-
השתמש למבוגרים נקבה עכברים עם רקמת מחיקה סלקטיבית של באיברי הרבייה α של קולטן אסטרוגן (מקודד על ידי ג'ין Esr1 ) לתאי האפיתל10 (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, הנקרא "קו" או נוק) ולשלוט הארנבונים מאותה (Esr1f/f, שנקרא "CTRL") במחקר זה.
- השתמש נקבות בת שבוע 8. הגילאים של נקבות מגוונות בהתאם הניסוי של ריבית.
- לקבוע את שלבי ייחום בבוקר בשעה 08:00 h. השתמש רק נקבות בשלב ייחום של המחזור. עבור שיטות מפורט של מריחת הנרתיק וניתוח cytological, להפנות הנהלים שפורסמו בעבר11.
2. ההזדווגות והערכה תקעים Copulatory
- ביום של ייחום (h 16:00), בית הנקבה לכלוב של הזכר.
- למחרת בבוקר (08:00 h), להפריד את הנקבה מהעכבר זכר.
- להשתמש עיבוד של שיטת שפורסמו בעבר12 כדי לגשת נוכחות או היעדרות של פקק הנרתיק או copulatory כאינדיקציה של ההזדווגות.
- החזק את העכבר הנשי מבסיס של הזנב להרים בקצרה את הגפיים האחוריות.
- למצוא את התקע copulatory על ידי הנוכחות של coagulum הזרע תפר חוט רקמה אופווייט בפתח הנרתיק בעזרת קיסם. אם התקע copulatory, הקיסם לא תהיה אפשרות להכנסה לתוך תעלת הנרתיק.
3. הכנה לפני איסוף הרקמה
- להכין 10 מ"ל של התקשורת L-15 של ליבוביץ, בתוספת 1% סרום שור עוברית (נקרא L15 מדיה + 1% FBS) צינור 15 מ"ל. דגירה התקשורת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות waterbath.
- על מנת לשמר את הכדאיות של רקמות, זרע ליישומים במורד הזרם, aliquot 2 מ"ל של טרום ומחוממת L15 מדיה + 1% FBS ב microcentrifuge 2 מ"ל צינור לאיסוף רקמות.
- לחמם את השלב של stereomicroscope ל- 37 מעלות צלזיוס. מוגדר הבלוק החום 37 ° C ומניחים על צינור microcentrifuge mL 1.5 ריק בבלוק.
- אם היישומים במורד הזרם מחייבים הדמיה של תנועתיות הזרע, לחמם שהשקופית זכוכית 37 מעלות צלזיוס.
4. רקמות אוסף
- להביא אזור הרקמה אוסף המדיה L15 מראש ומחוממת + 1% FBS aliquot.
- המתת חסד הנקבה (~ 08: 30h) באמצעות פחמן דו-חמצני חנק ואחריו נקע בצוואר הרחם.
הערה: זה כ 8 שעות לאחר ההזדווגות, בהנחה ההזדווגות מתקיים בחצות. - מקם את החיה במצב פרקדן לחשוף את אזור הבטן.
- תרסיס אלכוהול 70% על הבטן ליד הגפיים האחוריות.
- להשתמש את המספריים ויבתר לעשות חתך קטן (~ 1 ס מ) על העור של הבטן התחתונה.
- להשתמש ביד הדומיננטית למשוך את הזנב (ואת הגפיים האחוריות במידת הצורך) בעוד היד האחרת מושך את העור בכיוון ההפוך (לכיוון הראש) כדי לחשוף את שריר הבטן. שיטה זו משמשת כדי למזער את כמות השיער זיהום אל האברים מהבטן.
- חותכים את שריר הבטן בצורת V-בבסיס הבטן, סמוך הנרתיק, כדי לחשוף את האיברים מהבטן.
- העבר והמעיים שומן בבטן בצד כדי לחשוף את מערכת הרבייה.
- חתוך את שלפוחית השתן ואת רקמות אחרות מעל אזור הנרתיק.
- שיחתכו הערווה symphysis כדי לקבל גישה רקמת הנרתיק.
- הרם את רקמת הנרתיק בפתח הנרתיק, באמצעות מספריים כדי להפריד בין תעלת הנרתיק לבין הרקמה רקטלי.
- בזהירות לקצץ את השומן מצע המעי העליון משני צדי הרחם באמצעות מספריים האביב.
התראה: הרחם שביר מאוד עם הזרע בתוך. להיזהר לא ניקוב הרחם, אחרת הזרע יאבדו. - הרם את מערכת הרבייה נמוכה וחותכים כרית השומן השחלות את שני הצדדים.
- להעביר את באיברי הרבייה כל לתוך הצינור של ליבוביץ ומחוממת מראש L-15 מדיה + 1% FBS.
5. מדידה של זרע ניזול (צמיגות) מאוסף תוכן הרחם
- על הבמה stereomicroscope מחוממת, העברת הרקמות לתוך תבשיל תרביות רקמה סטרילי 35 מ מ מלא 3.5 מ ל להתחמם מראש L-15 מדיה + 1% FBS לנקות רקמות דם, מזהמים אחרים.
התראה: בעת הכביסה, לתפוס את הרקמות על ידי השומן, לא את הרחם. בשלב זה, הזרע הוא צפוי להיות שלמים בתוך הרחם. - כתם רקמות עודף מדיה באמצעות מעבדה מגבונים.
- החזק את הרקמה בקצה הנרתיק בעת הצבת את הקצוות השחלות בצינור microcentrifuge מחומם מראש. בעוד אתה מחזיק שבסוף וגינלי, לחתוך את הקרניים הרחם בבסיס של הרחם, המאפשר את הקרניים הרחם ליפול לתוך הצינור microcentrifuge.
- תן הזרע זרימה החוצה הקרניים הרחם לתוך הצינור. להשתמש מלקחיים חסר שיניים לסחוט בעדינות את הקרניים הרחם מהקצה השחלות כדי שבסוף וגינלי, לסלק את שאריות הזרע.
- למחוק את הרקמות בתיק חומרים מסוכנים, לשרוף.
- בקצרה ספין למטה הזרע minicentrifuge (~ 1-2 s).
- להניח את הצינור, מקביל לשלב מחוממת - זרע לא ישפך החוצה.
- יש לי את שעון העצר מוכן ולהגדיר לספור ''.
- צינור קפילר 25 µL מכניס דגימת הזרע בזווית של 180 מעלות (מקבילה לקיר tube). זה כדי למזער את מידת ההשתנות בין כל חוקר כשאני מחזיק את צינור קפילרי בזוויות שונות.
- הקש את הטיימר ברגע הופך צינור קפילרי מגע עם הזרע.
- רשום את הזמן (s) שלוקח לזרע להגיע לקו 25 µL.
- עם סיום המדידה, מיד לשים את הצינור המכיל זרע בחזרה בבלוק חום יבש לצורך ניתוח פונקציונאלי נוסף, כגון הדמיה וידאו של תנועתיות הזרע.
- לחטא את צינור קפילרי המכיל זרע במועט הצינור ב- 10% מלבין פתרון עבור 20 דקות וזורקים את צינור קפילרי בתוך המיכל שרפ.
6. וידאו הדמיה של תנועתיות הזרע
- הפעל את המיקרוסקופ ואת תוכנת הדמיה וידאו.
- פיפטה 20 µL של הזרע שנותרו על גבי השקופית זכוכית ומחוממת מראש, בעוד השקופית זכוכית מושם על הבמה מחוממת.
- מכסים עם coverslip זכוכית.
- הנח את הצד coverslip ' שקופית ' למטה על המיקרוסקופ.
- השתמש 20 X עדשה המטרה כדי למצוא תחומי עניין.
- לשנות ל- 100 X עדשה המטרה עבור הדמיה וידאו.
- להקליט הוידאו ב- 12 מסגרות לשנייה (fps) ב-30 s.
- באופן אקראי להקליט קטעי וידאו בתחומים שונים לפחות 3 לכל חיה.
- ביצוע ההדמיה במהירות למזער חשיפה קלה השקופית כדי לשמר את תנועתיות הזרע ואת הכדאיות.
הערה: הליך זה הדמיה צריך להיעשות תוך 2-3 דקות. - לבצע ניתוח הנתונים באמצעות תוכנת ImageJ כמו שתואר לעיל8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זרע נאסף מן CTRL וקו h נקבות כ 8 לאחר ההזדווגות עם זכרים CTRL פורייה. ניזול (או זרע צמיגות) הוא לכמת על ידי לוקחים את הזמן כדי למלא 25 קפילר μL זרע. הזרע שנאסף CTRL uteri לקח 2.06 דקות ±0.12 (mean±S.E.M, n = 5) כדי למלא את צינור קפילרי (איור 1). עם זאת, הזרע שנאסף KO uteri לקח יותר מ 60 דקות (60.0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) של זמן הניסוי. נתונים אלה מציעים הזרע באופן משמעותי מעובה יותר או פחות צמיגה ב- CTRL לעומת קו uteri.
כדי להמחיש את אחד היישומים במורד הזרם של איסוף זרע של מערכת הרבייה הנשית, תנועתיות הזרע הוערכה באמצעות הדמיה וידאו. הזרע שנאסף uteri CTRL הראה בחופשיות שחייה זרע בתוך השדה מיקרוסקופיים, ייצג את התמונה איור2 א. הזרע שנאסף על uteri KO הראו כי הרוב המכריע של הזרע היו מקובצים יחד עם ניידות מינימלית (איור 2B). ממצאים אלה מצביעים על כי הזרע שנאסף באיברי הרבייה הנקביים 8 שעות לאחר ההזדווגות יכול לשמש לניתוח זרע נוסף.
איור 1 : ניזול זמן (זרע צמיגות) מן הזרע שנאסף העכבר uteri. ייצוג גרפי של הזמן ניזול (דקות) של הזרע שנאסף CTRL ו KO uteri כ 8 שעות לאחר ההזדווגות. נתונים מייצגים mean±S.E.M., n = 5 נקבות/גנוטיפ. p < אינטראקצית 0.001, סטודנט t -test. הותאם התוצאות שפורסמו בעבר8 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : להחליפן בתמונות של זרע בתוך הזרע שנאסף העכבר uteri. תמונות נציג של ההדמיה וידאו שצולמו 1000 X הגדלה של זרע בהזרע שנאסף uteri KO CTRL (א) ו- (B) . הותאם התוצאות שפורסמו בעבר8 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
איסוף זרע מן העכבר uteri יכול לספק יתרונות על פני הזרע ניתוח במבחנה כפי לשעבר יכול להמחיש את האינטראקציות פיזיולוגי בין הזרע לבין הפרשות באיברי הרבייה הנקביים. טכניקות שהוצגו במחקר זה מאפשר לחוקרים לקבוע את איכות תאי הזרע וכן הכדאיות הזרע, תנועתיות בתנאים פיזיולוגיים אידיאלי. יתר על כן, ישנם ניתוחים במורד הזרם שונים שניתן לבצע באמצעות הזרע שנאסף על uteri, לדוגמה, ניתן לספור את הזרע כדי לקבוע את המספר הממשי זרע הזנת את הרחם ואת הזרע יכול גם לדימות עבור מבחני תנועתיות. נקודת זמן אידיאלי כדי לאסוף את הזרע על יכולת ההפריה צריך להיות בתוך 1-2 שעות לאחר ההזדווגות1.
בנוסף ליישומים במורד הזרם כאמור, החוקרים ניתן גם להעריך את ההשפעות של מעכבי/תרכובות של ריבית על הזרע תחבורה תהליכים, כגון זרע ניזול (או צמיגות זרע), הזרע מספר במערכת העיכול, זרע תנועתיות, או זרע הגירה לאזורים שונים של מערכת הרבייה הנשית. תרכובות יכול להיות מיושם במערכת הרבייה הנקבה לפני ההזדווגות8. . אז, ההשפעה של מעכבי/התרכובות הללו יכול להידרש זרע מדגם שלאחר ההזדווגות. שיטות אלה יכול להיות שימושי לבדוק את המעשיות של תרופות למניעת הריון לעכב את הזרע תחבורה.
נקודות קריטי של שיקול למדידות ניזול/צמיגות ואוסף זרע הן הרגישות של הזרע ואת זווית צינור קפילרי. זרע רגישים שינוי הטמפרטורה. אם ניתוח במורד הזרם של תנועתיות ותפקוד זרע הוא חיוני עבור תוצאות הניסוי, הרקמה זרע צריך להישמר ב 37 מעלות צלזיוס בכל עת, עם החשיפה מינימלית לאור. אם קיימים מספר דגימות לאסוף מן הנקבות מרובים, המתת חסד החיות אחת בכל פעם כדי למזער את המתנה. עבור המידה ניזול, מזוויות שונות צינור קפילרי ליצור חוסר עקביות בזמן ניזול. לכן, החוקרים חייבים להחזיק את צינור קפילרי מקבילה לקיר צינור (בזווית של 180 מעלות) כדי למזער את מידת ההשתנות שנוצרו על-ידי כל חוקר. צריך זרע מדגם ייאספו לא יאוחר מ- h: 09:00, זאת בשל התחדשות נוזל ברחם. החוקר להשיג מספיק חומר נוזל עבור המידה ניזול.
זה נקבע כי ניזול זרע בעיקר מתווך על ידי הפעילות האנזימטית מתרחשת של PSA המופרשים בלוטת הערמונית13. עם זאת, ישנם מחקרים מוגבלת כדי לקבוע את התפקידים של באיברי הרבייה הנקביים במהלך ויוו ניזול תהליך8. לכן, אוסף של הזרע של מערכת הרבייה הנשית מספק יתרון מכריע ללמוד ניזול את תהליכי ויוו, לאחר הזרע נחשף הפרשות מן באיברי הרבייה הנקביים14. לסיכום, פוסט-פלטה זרע ניזול/צמיגות המדידה מאפשרת החוקרים לפענח את יחסי הגומלין בין הזרע לבין מערכת הרבייה הנשית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי קרן הזנק במכללה לרפואה וטרינרית (WSU) WW. המחברים מודים סיירה אולסן (WSU) על קריאה ביקורתית של כתב היד הזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H.
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , Cambridge, MA (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
