Summary
Meni الرسالة sperm seminal jel--dan özgür olmak için gereklidir. Bu çalışma yordamları kadın üreme sistemi sonrası cinsel birleşme sperm toplama ve meni الرسالة Süre ölçümünü sağlar.
Abstract
Farelerde, boşalmış sperm rahim içinde yatırılır. Boşalma sonra meni değiştirir tutarlılık jel benzeri için sulu, adı verilen işlem الرسالة. Bu çalışmada, kadın üreme sistemi bir fare modeli sonrası ejaculated meni toplamak için nasıl gösterir. İlk, yetişkin dişi fareler içinde estrus sahne bir erkeğin kafeste gecede yer. Ertesi sabah, birleşme vajinal açılışında çiftleşme fiş varlığı tarafından doğrulandı. Çiftleşme tıkacı ile dişi fareler euthanized ve üreme her yolu (vajina, rahim, oviducts, yumurtalık), bir bütün olarak toplanan meni içerecek şekilde kapalı bir sistem sağlamak. Vajina meni tüpün içine serbest bırakmak için kesilmiş ve üreme yolu bir 1.5 mL microcentrifuge tüp yerleştirildi. En fazla sperm cilt analizi için emin olmak için dişsiz forseps vajinal sona kalan meni kovma yumurtalık ucundan boynuzları rahim sıkmak için kullanılmıştır. Tüm üreme yolu sonra atıldı. Meni içeren tüp kısaca aşağı bükülmüş. 25 μL kapiller pipet 180 ° açıyla (tüp duvara paralel) tüp içine yerleştirilmiştir. Kılcal Boru 25 μL hattına doldurmak için kullanılan süreyi kaydedildi. Meni--dan a kanıtlanmış erkek doğurmak genellikle yaklaşık 60-180 s 25 μL kılcal tüp doldurmak için alır. Bu sperm toplama tekniği de sperm görüntüleme ve motilite analizi gibi aşağı akım diğer uygulamalarda kullanılabilir.
Introduction
Kadın üreme yolu alt ve üst yolları oluşur. Üst üreme yolu fallop tüpleri, rahim ve endocerviks içerir. Alt üreme sistem ectocervix ve vajina içerir. İnsanlarda, vajina, ectocervix1' e komşu ön duvara ejaculated meni yatırılır. Farelerde, ancak, sperm rahim içine2çiftleşme sonra dakika içinde süpürüldü.
Sperm boşalma, sperm entrapped neden zarfında katılaşmış ve3immobilize seminal jel içerir. الرسالة immobilize sperm meni bir jel gibi sulu bir tutarlılık değiştirerek serbest bırakır. Sperm motilitesi ve memeli üreme için gerekli bir süreçtir. Meni الرسالة bilgisine nerede meni bir kültür tabak içinde sıvılaştırılmış olur vitro çalışmalar çoğunlukla dayanmaktadır. İnsanlarda, enzimatik aktivite Prostat spesifik antijen veya PSA (olarak da bilinen kallikrein ilgili peptidaz 3 veya KLK3) semenogelins (meni mevcut proteinler jel şekillendirme)4 hidroliz ile الرسالة için büyük katkıda bulunuyor. ,5,6. Semenogelins bozulma sperm sperm hareketliliği artan seminal coagulum, dan özgür kılar. Sperm yüzmek fallop tüpü yumurtayı döllemek için doğru serbest. الرسالة (ya da meni viskozite) bir erkek üreme7değerlendirmek için doğurganlık klinikleri semen analizi için standart ilk gösterimleri testlerdir.
Kısa bir süre önce bir makale dişi fare üreme yolu sonrası çiftleşme üzerinden toplanan meni analizi daha sonra doğurganlık kusurları8neden olabilir الرسالة bir eksikliği göstermek için kullanılabileceğini gösterir. Meni hiperviskozite gibi arızalı الرسالة infertil erkek9normal الرسالة memeli üreme için vazgeçilmez olduğunu düşündüren, durumlarda 11,8 32.3 oranında katkıda bulunur. Ancak, çalışmalar ve الرسالة kusur tedavisinde sadece erkek7üzerinde odaklanmıştır. Kadın üreme sistemi meni الرسالة içinde bir rol oynar olasılığını araştırdı değil. Bu nedenle, sperm toplama ve الرسالة zaman ölçme yöntemleri araştırmacılar الرسالة ilgi model organizma olarak infertilite nedenlerinden biri olabilir olup olmadığını belirlemek için yeni bir tanı aracı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvanlar ve bu çalışmada kullanılan yordamlar Washington State Üniversitesi (WSU) hayvan bakım ve kullanım Komitesi esaslarına göre ve WSU onaylı hayvan iletişim kuralları #4702 ve #4735 uygun olarak ele.
1. fareler
-
Standart C57BL/6J yetişkin erkek fareler veya ilgi diğer suşların kullanın. Hayvanlar altında ad libitum erişim su ve gıda ile sıcaklık ve nem kontrollü bir ortam sağlamak.
- 8 hafta eski 10 aylık arasında değişen erkek doğurmak kullanabilirsiniz. Sadece kanıtlanmış doğurmak deneylerde kullanın.
-
Üreme yolu östrojen reseptör α ( Esr1 gen tarafından kodlanmış) bir doku seçici silme ile yetişkin dişi fareler içinde epitel hücreleri10 kullanın (Wnt7aCre / +; Esr1nakavt veya "KO" adı verilenf/f,) ve kontrol littermates ("CTRL" denilenEsr1f/f,) Bu çalışmada.
- 8 hafta-yaşlı kadın kullanın. Yaş kadın faiz deney bağlı olarak çeşitli.
- Sabah saat 08:00 h estrous döngüsünün aşamaları belirlemek. Sadece kadın döngüsünün estrus aşamasında kullanın. Vajinal bulaşması ve saytolojik analiz ayrıntılı yöntemleri için daha önce yayımlanmış yordamlar11' e bakın.
2. çiftleşme ve çiftleşme tıkacı değerlendirilmesi
- Kadın bir erkeğin kafes içinde estrus (16:00 h) gün ev.
- Ertesi sabah (08:00 h), dişi erkek fare ayırın.
- Daha önce yayımlanmış yöntemi12 bir uyarlaması varlığı ya da yokluğu bir vajinal veya çiftleşme fiş çiftleşme bir göstergesi olarak erişmek için kullanın.
- Kısa bir süre arka bacaklarda kaldırmak için kuyruk tabanından kadın fareyi tutun.
- Çiftleşme Tak bir kürdan kullanarak vajinal açılışında bir off-beyaz seminal coagulum varlığı bulun. Çiftleşme fiş varsa, kürdan vajinal kanala eklenecek mümkün olmayacaktır.
3. doku toplama öncesi hazırlık
- 10 mL % 1 fetal sığır serum ile desteklenmiş iyi'nın L-15 medyanın hazırlamak (denilen L15 medya + % 1 FBS) 15 mL tüp içinde. Bir waterbath içinde 15 dakika 37 ° C'de medya kuluçkaya.
- Doku ve aşağı akım uygulamaları için sperm canlılığı korumak için Önceden ısıtılmış L15 medya + % 1 aliquot 2 mL 2 mL microcentrifuge FBS dokusu toplamalarında tüp.
- 37 ° c stereomicroscope sahne sıcak 37 ° C ısı-taş ayarla ve bir boş 1.5 mL microcentrifuge tüp bloğunda yer.
- Aşağı akım uygulamaları sperm motilitesi görüntüleme gerektiriyorsa, cam slayt 37 ° c sıcak
4. doku koleksiyonu
- Önceden ısıtılmış L15 medya + % 1 FBS aliquot doku toplama alanına getirin.
- Dişi ötenazi (~ 08: 30h) karbon dioksit boğulma kullanarak takip tarafından servikal çıkığı.
Not: varsayarak çiftleşme gerçekleşir gece yarısı yaklaşık 8 h çiftleşme sonra bu. - Hayvanın karın bölgesi ortaya çıkarmak için sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
- % 70 alkol karın arka bacaklarda yakınındaki sprey.
- Diseksiyon makası alt karın cilt üzerinde küçük bir kesim (~ 1 cm) yapmak için kullanın.
- Dominant el kuyruk (ve arka bacaklarda gerekirse) çekmek için kullanın sigara dominant el cilt (doğru kafa) ters yönde karın kas ortaya çıkarmak için çeker iken. Bu yöntem saç kirlenme visseral organlara en aza indirmek için kullanılır.
- Karın kas bir V-viseral organlar ortaya çıkarmak için şekil içinde karın, vajina için bitişik temelini kesti.
- Bağırsak ve karın yağ üreme yolu ortaya çıkarmak için kenara çek.
- Mesane ve diğer dokular vajinal bölgede yukarıda kapalı döşeme.
- Kasık symphysis vajinal doku erişmek için ayrı kesti.
- Vajinal doku vajinal açılışında kaldırın ve vajinal kanal rektal dokusundan ayırmak için makas kullanarak.
- Dikkatle bahar makas kullanırken rahim her iki taraftan Mezenterik yağı kırpın.
Dikkat: Rahim içinde sperm ile çok kırılgandır. Rahim delik değil dikkatli olun yoksa meni kaybolacak. - Alt üreme sistem kaldırın ve her iki kapalı yumurtalık yağ yastığı kesti.
- Önceden ısıtılmış iyi'nın L-15 medya + % 1 tüp içine tüm üreme yolu aktarım FBS.
5. rahim içerik koleksiyonundan meni الرسالة (viskozite) ölçümü
- Stereomicroscope ısıtmalı sahnede bir 35 mm steril doku kültürü çanak içine belgili tanımlık doku dolu ile 3,5 mL transfer önceden sıcak L-15 medya + % 1 FBS dokuların kan ve diğer kirleri temizlemek için.
Dikkat: yıkama sırasında dokuların yağ tarafından değil rahim al. Bu noktada, meni bekleniyor rahim içinde sağlam olmalı. - Laboratuvar mendil kullanarak aşırı medya dokuların leke.
- Doku vajinal sonunda Önceden ısıtılmış microcentrifuge tüpte yumurtalık biter yerleştirerek süre tutun. Vajinal sonuna tutarken, temelini microcentrifuge tüp içine düşmek rahim boynuzları sağlayan rahim, rahim boynuzları kesti.
- Meni izin tüp içine rahim boynuzları dışarı akışı. Dişsiz forseps yavaşça kalan meni kovma vajinal sonuna yumurtalık sonundan itibaren boynuzları rahim sıkmak için kullanın.
- Biohazard çanta ve dokularda atın ve yakıp kül.
- Kısaca bir minicentrifuge meni aşağı spin (~ 1-2 s).
- Tüp, ısıtmalı sahneye paralel lay - meni dışarı dökülecek değil.
- Hazır çekim var ve 'saymak için ' set.
- Meni örneği (tüp duvara paralel) 180 ° açıyla bir 25 µL kılcal tüp takın. Kılcal tüp farklı açılarda holding üzerinden her araştırmacı arasında değişkenlik en aza indirmek için bu.
- Kılcal Boru yapar zamanlayıcıyı basın meni ile temas.
- Meni 25 µL çizgisine ulaşmak gereken süreyi (s) kaydedin.
- Ölçüm bittiğinde hemen geri daha fazla fonksiyonel analiz, sperm motilitesi video görüntüleme gibi kuru sıcak blok meni içeren tüp koymak.
- 20 dk için % 10 çamaşır suyu çözüm tüpte çeker tarafından meni içeren kılcal tüp dezenfekte ve kılcal tüp "Sharps" kap içinde atın.
6. Sperm motilitesi video görüntüleme
- Mikroskop ve video görüntüleme yazılımını açın.
- Sahne Alanı'nda ısıtmalı cam slayt yerleştirilir iken, Önceden ısıtılmış cam slayt üzerine kalan meni 20 µL pipet.
- Bir cam coverslip ile kapak.
- Slayt coverslip yan mikroskobunun yerleştirin.
- 20 X objektif lens ilgi alanı bulmak için kullanın.
- 100 X objektif lens için video görüntüleme için değiştirin.
- Video: 12 kare/s (fps) 30 kayıt s.
- Rastgele videolar hayvan başına en az 3 farklı alanlarda kaydedin.
- Görüntüleme gerçekleştirmek hızlı bir şekilde ve sperm motilitesi ve canlılığı korumak için slayda ışık pozlandırmayı en aza indirmek.
Not: Görüntüleme bu yordamı 2-3 dakika içinde yapılmalıdır. - ImageJ yazılım yukarıda açıklanan8olarak kullanarak veri çözümlemesi gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Meni ile verimli CTRL erkek çiftleşme sonra CTRL ve KO kadın yaklaşık 8 h dan toplanmıştır. 25 μL kılcal tüp meni ile doldurmak için geçen süre tarafından الرسالة (ya da meni viskozite) sayılabilir. CTRL uteri toplanan meni aldı 2.06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) kılcal tüp (şekil 1) doldurmak için. Ancak, KO uteri toplanan meni 60 dk uzun sürdü (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) deneysel zaman. Bu veriler meni önemli ölçüde daha fazla dizel veya daha az CTRL viskoz KO uteri karşılaştırıldığında öneririz.
Bir kadın üreme arazisinden sperm toplama aşağı akım uygulamaları göstermek için sperm motilitesi video Imaging'i kullanma değerlendirildi. Meni şekil 2Aanlık görüntüdeki temsil mikroskobik alanın içinde serbestçe yüzen sperm gösterdi CTRL uteri toplanan. KO uteri toplanan meni, sperm çoğunluğu en az hareketlilik (2B rakam) ile birlikte kümelenmiş gösterdi. Bu bulgular sonra çiftleşme daha fazla sperm analizi için kullanılabilir meni kadın üreme arazisinden 8 h toplanan göstermektedir.
Resim 1 : الرسالة zaman semen (meni viskozite) toplanan fare uteri. Meni الرسالة süresi (dk), grafik gösterimini CTRL ve KO uteri yaklaşık 8 saat çiftleşme sonra toplanan. Verileri temsil eden mean±S.E.M., n = 5 kadın/genotip. p < 0,001, unpaired bir öğrenci t -testi. Daha önce yayımlanmış sonuçları8 izniyle uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Sperm meni içinde temsilcisi görüntüleri toplanan fare uteri. Temsilcisi anlık görüntülerini 1000 X büyütme sperm meni içinde çekilen video görüntüleme (A) CTRL ve (B) KO uteri toplanan. Daha önce yayımlanmış sonuçları8 izniyle uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meni ve kadın üreme yolu. salgılar arasındaki fizyolojik etkileşimler eski gösterdiği gibi fare uteri sperm toplama semen analizi vitro avantajları sağlayabilir Bu çalışmada sunulan teknikleri araştırmacılar sperm kalitesi hem de sperm canlılığı ve motilite ideal fizyolojik koşullarda belirlemek için izin verir. Ayrıca, uteri toplanan sperm kullanılarak gerçekleştirilen çeşitli aşağı akım analizleri, örneğin, sperm rahim ve sperm girme gerçek sperm sayısı ayrıca hareketliliği deneyleri için yansıması belirlemek için sayılabilir. Meni döllenme yeteneği için toplamak için ideal zaman noktası içinde 1-2 h1çiftleşme sonra olmalıdır.
Daha önce bahsedilen aşağı akım uygulamaları ek olarak, müfettişler Ayrıca inhibitörleri/bileşikler ilgi etkileri sperm aktarımında değerlendirebilir işler, meni الرسالة (veya meni viskozite) gibi sperm sayısı sistem, sperm hareketliliği, ya da sperm göç-e doğru farklı alanlarda kadın üreme sistemi. Bileşikleri8çiftleşme önce kadın üreme sistem uygulanabilir. O zaman, o inhibitörleri/bileşikler etkisini sonrası çiftleşme. sperm örneğinden tespit edilebilir Bu yöntemler sperm taşıma inhibe kontraseptif ilaçlar pratiklik test etmek yararlı olabilir.
Sperm duyarlılığını ve Kılcal Boru açısı dikkate sperm toplama ve الرسالة/viskozite ölçümler için çok önemli noktalarıdır. Sperm için ortam sıcaklığı duyarlıdır. Sperm fonksiyonu ve motilite aşağı akım analizi için deneysel sonuçlar, doku esastır ve meni 37 ° C'de hiç tutulması gerekiyorsa, en az ışığa maruz kalma ile kez gösterilmiştir. Birden fazla kadın toplamak için çeşitli örnekleri varsa, bir hayvan bekle en aza indirmek için teker teker ötenazi. الرسالة ölçüm için kılcal tüp farklı açılarını الرسالة zaman içinde tutarsızlıkları üretir. Bu nedenle, müfettişlerin kılcal tüp tüp duvara paralel (bir 180 ° açıyla) her araştırmacı tarafından oluşturulan değişkenlik en aza indirmek için tutmak zorunda. Meni örnek saat 09:00 h'dan sonra toplanmalıdır değil, bu rahim içinde sıvı emiliminin kaynaklanmaktadır. Araştırmacı الرسالة ölçüm için yeterli sıvı malzeme elde.
Meni الرسالة esas olarak PSA prostat bezi13salgılanan enzimatik aktivite tarafından aracılık ettiği kuruldu. Ancak, in vivo الرسالة işlemi8sırasında kadın üreme sistemi rolleri belirlemek için sınırlı çalışma vardır. Bu nedenle, kadın üreme yolu sperm meni14kadın üreme sistemi için salgıları maruz sonra الرسالة eğitim için çok önemli bir avantaj vivo içindeişler sağlar. Sonuç olarak, meni ve kadın üreme sistemi arasındaki etkileşimi deşifre araştırmacılar sonrası Ejaküle meni الرسالة/viskozite ölçüm sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser WW veteriner tıp Koleji (WSU) başlangıç fon tarafından desteklenmektedir. Yazarlar Sierra Olsen (WSU) bu el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H.
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , Cambridge, MA (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
