Summary
精液液状精液のゲルから解放される精子に必要です。この研究は、女性の生殖器官の後膣から精液を収集し、精液液状化時間を測定するための手順を提供します。
Abstract
マウス子宮内射精精液を堆積します。射精後精液がゲル状から一貫性を変更水、プロセスという液状化。本研究ではマウス モデルにおける女性の生殖管から射精後の精液を収集する方法を紹介します。発情期の雌マウスを最初、大人は一晩男性の檻の中で収容されました。次の朝、交尾は、膣の開口部にみられる交尾栓の存在によって確認されました。交尾のプラグとメスのマウスを安楽死させ、(膣、子宮、卵管、卵巣)、全体として各生殖器を集めた精液を格納するクローズド システムを確保します。生殖器官は 1.5 mL 遠心チューブに置かれた、膣管に精液を解放する切断されました。分析のための最大の精液量を確保するため、歯の鉗子を用いた膣に終わり残り精液を追放する卵巣端から子宮角を圧迫します。全体の生殖器は、破棄されます。精液を含むチューブは簡単にスピンダウンだった。25 μ L キャピラリー ピペットは、180 ° の角度 (管壁に平行) で管に置かれました。25 μ L ラインにキャピラリー チューブを埋めるために使用時間数を記録しました。実績のある男性ブリーダーから精液は、通常 25 μ L キャピラリー チューブに合わせて約 60-180 秒をかかります。この精液コレクション手法は、精子のイメージングと運動解析など他の下流のアプリケーションで使用できます。
Introduction
女性の生殖器官は、上部と下部の管で構成されます。上部の生殖器では、卵管、子宮、コルポを含まれています。下部生殖管には、子宮頸膣部と膣が含まれています。ヒトでは、射精された精液は膣、子宮頸膣部1に隣接しての前方の壁に堆積されています。ただし、マウスでは、精液が子宮に流さ交配2分以内。
精液には、はめられる精子を引き起こしている射精の秒以内に固化し、3を固定化ゲル種子にはが含まれています。液状化は、ゲル状から水様の一貫性に精液を変更する、固定化した精子を解放します。このプロセスは、精子の運動性および哺乳動物の生殖に不可欠です。精液液状化現象の知識ほとんど、精液になる培養皿で液状化したところの in vitro研究に基づいています。ヒトでは、前立腺特異抗原 PSA (として知られているカリクレイン関連ペプチダーゼ 3 または KLK3) の酵素活性は semenogelins (ゲル化蛋白質精液に存在)4 の加水分解による液状化の主な要因、5,6。Semenogelins の劣化精子の移動性を高める、精液 coagulum から精子を解放します。精子、卵を受精させる卵管に向かって泳ぐを解放しました。液状化 (または精液の粘度) テストは男性の豊饒7を評価するために不妊治療クリニックに精液の分析の標準的な初期上映の一つ。
最近発行された記事は、不妊欠陥8を引き起こす可能性がその後液状化の欠乏を説明するために雌マウスの生殖管の後交配から収集された精嚢液の分析が使えることを示しています。欠陥のある液状精液過粘稠度などは、不妊症の男性で9、通常の液状化は哺乳類の生殖に不可欠なないことを示唆しての 11.8 32.3% に貢献します。ただし、研究と液状化欠陥の治療は男性7排他的に焦点を当てています。女性の生殖器官が精液液状化で役割を果たしている可能性は検討されていません。したがって、精液採取と液化反応時間測定法、液状化が関心のモデル有機体の不妊の原因の一つかもしれないかどうかを決定するための新しい診断ツール研究者を提供します。
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Protocol
すべての動物と本研究で使用されるプロシージャは、ワシントン州立大学 (WSU) 動物のケアおよび使用委員会のガイドラインによると、動物のプロトコルの WSU 承認 #4702 と #4735 に準拠して処理されました。
1. マウス
-
標準 c57bl/6 j 大人男性マウスまたは興味の他の系統を使用します。温度・湿度制御環境、食糧および水の自由アクセスの下で動物を維持します。
- 生後 8 週間から生後 10 ヶ月に至るまで男性のブリーダーを使用します。実験では実績のあるブリーダーのみを使用します。
-
上皮細胞10 ( Esr1遺伝子によってエンコードされた) の生殖管エストロゲン受容体 α の組織選択削除と成熟雌マウスを使用 (Wnt7aCre/+;Esr1f/f、ノックアウトまたは"KO"と呼ばれる) と本研究で同腹子 (Esr1f、「ctrl キー」と呼ばれる) を制御します。
- 8 週齢の雌を使用します。女性の年齢は興味の実験によって異なります。
- 朝 8:00 h の発情周期の段階を決定します。周期の発情期女性のみを使用します。膣スミアと細胞学的分析の詳細な方法は、以前に発行された手順11を参照してください。
2. 交尾、交尾のプラグを評価します。
- 発情 (16:00 h) の日、オスのケージにメスを家します。
- 次の朝 (8:00 h)、雄マウスから女性を区切ります。
- 以前に発行された方法12の適応を使用して、膣または交尾プラグの存在有無を交配の指標としてアクセスします。
- 後肢を簡単に持ち上げることの尾の根元から雌マウスを保持します。
- つまようじを使用して膣口でオフホワイト精液 coagulum の存在にみられる交尾栓を見つけます。みられる交尾栓が存在する場合、つまようじは膣に挿入することができません。
3. 組織の採取前に、の準備
- リーボビッツの L-15 メディア、1% 牛胎児血清を添加した 10 mL を準備 (と呼ばれる L15 メディア + 1 %fbs) 15 mL チューブに。実験で 15 分間 37 ° C でメディアを孵化させなさい。
- 組織と下流のアプリケーションのための精子の生存率を維持するために予め温めておいた L15 メディア + 1% の分注 2 mL FB 2 mL 遠心機の管組織コレクション。
- 37 ° c. に実体顕微鏡のステージをウォーム アップします。熱ブロックを 37 ° C に設定し、空の 1.5 mL 遠心チューブをブロックに配置します。
- 下流のアプリケーションでは、精子の運動性のイメージングを必要とする場合暖かい 37 ° c. にスライド ガラス
4. 組織の採取
- 組織コレクション領域に予め温めておいた L15 メディア + 1 %fbs 因数をもたらします。
- 女性を安楽死させる (~ 08:30 h) 頚部転位続いて二酸化炭素の窒息を使用します。
注: これは約 8 時間、交尾後深夜に交配が行われると仮定すると。 - 腹部領域を公開する仰臥位に動物を配置します。
- 手足をハインドに近い腹部に 70% アルコールをスプレーします。
- 解剖はさみを使用して、下腹部の皮膚に小さなカット (~ 1 cm) を行います。
- 利き手を使って、尾 (および必要に応じて手足をハインド) を引く一方、非利き手は、腹部の筋肉を公開する (頭) に向かって逆方向に皮膚を引っ張る。このメソッドを使用して、内臓器官への汚染の髪の量を最小限に抑える。
- 腹部の筋肉を内臓器官を公開する、膣に隣接する腹部の基部に V 形にカットします。
- 腸や腹部の脂肪を生殖器官を公開する側に移動します。
- 膀胱と膣の領域の上に他の組織を切り落とします。
- 膣の組織へのアクセスを得るために離れて恥骨をカットします。
- 膣口に膣組織を持ち上げて、膣管を直腸の組織から分離するはさみを使用しています。
- 春のはさみを使って子宮の両側から腸間膜の脂肪を慎重に切り落とします。
注意: 子宮内精液と非常に壊れやすいです。子宮をパンクしないように、または他の精液は失われます。 - 下部生殖管を持ち上げ、両側の卵巣の脂肪パッドをカットします。
- 予め温めておいたリーボビッツの L-15 メディア + 1% のチューブに生殖器全体を移す政府短期証券。
5. 子宮コンテンツ コレクションから精液液状化 (粘度) の測定
- 個人差の加熱ステージ上 35 mm 滅菌培養皿に組織に満ちて 3.5 mL 転送予め加温 L-15 メディア + 1 %fbs 血と他の汚染物質の組織をきれいにします。
注意: 洗濯中には、脂肪、子宮ではなくによって組織をつかみます。精液を期待するこの時点で、子宮の中そのままにします。 - 研究室のワイプを使用して余分なメディアの組織をしみ。
- 事前に加熱された遠心チューブに卵巣の両端を配置しながら膣の端に組織を保持します。膣の端を押しながら遠心チューブに落ちる子宮角をできるように子宮の下部の子宮角をカットします。
- 精液子宮角からチューブへの流れ。そっと膣に最後に、残った精液を追放するのに卵巣から子宮角を圧迫するのに歯の鉗子を使用します。
- バイオハザード バッグで組織を破棄し、焼却します。
- 簡単にスピン ・ ダウン、minicentrifuge の精液 (1 ~ 2 秒)。
- チューブを加熱ステージと平行に置く - 精液のうち流出は致しません。
- 準備ができてのタイマーを持っている、'カウント' に設定。
- (管の壁に平行) 180 ° の角度で精液サンプルに 25 μ L キャピラリー チューブを挿入します。これは、異なる角度でキャピラリー チューブを保持してから調査員間のばらつきを最小限に抑えることです。
- キャピラリー チューブを作るとすぐに、タイマーを押すと精液の接触。
- 精液 25 μ L ラインに到達するためにかかる時間 (秒) を記録します。
- 測定が終了したら、すぐに精液に精子の運動のビデオ イメージングなど、更なる機能解析用乾熱ブロックを格納筒を置きます。
- 10% の漂白剤溶液中 20 分間でチューブを浸すことによって精液を含むキャピラリー チューブを消毒し、シャープス コンテナーのキャピラリー チューブを破棄します。
6 精子の運動のビデオ画像
- 顕微鏡とビデオ イメージング ソフトウェアを入れます。
- 予め温めておいたガラス スライド上に残りの精液の 20 μ L のピペット ガラス スライドが加熱ステージに配置されます。
- ガラス基板とカバーします。
- 顕微鏡のスライド coverslip 側を置きます。
- 20 X 対物レンズを使用すると、興味の領域を見つけます。
- ビデオ画像の 100 倍対物レンズに変更します。
- 30 の 12 フレーム/秒 (fps) でビデオを記録 s。
- ランダムに動物あたりの少なくとも 3 つのエリアで動画を記録します。
- イメージングを実行すぐに精子の運動性および生存率を維持するためにスライドを光の露出を最小限に抑える。
注: このイメージの作成手順は、2-3 分以内されるべきであります。 - 前述8として ImageJ ソフトウェアを用いたデータ解析を実行します。
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Representative Results
精液は、肥沃な CTRL 男性と交尾後 ctrl キーと KO の女性約 8 h から採取しました。液状化 (または精液の粘度) は、精液で 25 μ L キャピラリー チューブを入力するのにかかる時間によって定量化されます。CTRL 子宮から精液が 2.06 ± 0.12 min を要しました (mean±S.E.M, n = 5) キャピラリー チューブ (図 1) を記入します。ただし、KO 子宮から収集した精液は 60 分より長くかかった (60.0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) 実験時間の。これらのデータは、精液は液化より大きく、KO 子宮に ctrl キーで粘性が低く比較をお勧めします。
女性の生殖器官から精液を収集のダウン ストリーム アプリケーションの 1 つを示すためには、ビデオ画像を用いた精子の運動性を評価しました。図 2 aのスナップショットで表される顕微鏡のフィールド内で自由に泳ぎの精子を示した CTRL 子宮から精液が収集しました。KO 子宮から精液は、精子の大半で最小限の移動 (図 2 b) と共にクラスター化されたことを示した。さらに精子分析に使用することができます交配後 8 h 女性の生殖器官から精液が収集されたことが示唆されました。
図 1: マウス子宮から収集した精液から液状化時刻 (精液の粘度).精液の液状化時間 (分) のグラフィカルな表現は交尾後約 8 h を ctrl キーと KO の子宮から採取します。データを表す mean±S.E.M., n = 5 女性/遺伝子型。p < 0.001、対になっていないt検定。アクセス許可を以前に公開した結果8から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マウス子宮から精液内の精子の代表的な画像を収集します。精液中の精子の 1000 倍の倍率で撮影したビデオ画像からの代表的なスナップショットは ctrl キー (A)と(B)の KO 子宮から収集されます。以前に公開した結果8許可を得てから適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
前者は、精液と.女性の生殖器官から分泌の生理学的な相互作用を説明することが、精液分析培養上の利点を提供できるマウス子宮から精液を収集本論文で示した技術は、精液性状と同様に精子の生存率と理想的な生理的条件での運動性を決定する研究者を許可します。また、子宮から精液を使用して実行できる各種の下流解析があります、たとえば、精子は子宮と精子を入力実際精子数も運動アッセイの視覚化されるを決定する数えることができます。受精能力精液を集めるための理想的な時間ポイントは1を交尾後 1 ~ 2 時間内ではずです。
前述のように下流のアプリケーションに加えて調査官は評価精子輸送に及ぼす阻害剤/化合物金利の精液の液状化 (または精液の粘度) など、道内、精子精子数のプロセス運動、または女性の生殖管の異なる領域に精子移行。化合物は、8を勘合させる前に女性の生殖器官に適用できます。後.を交配精液サンプルからのこれらの阻害剤/化合物の影響の評価、これらのメソッドは、精子輸送を阻害する経口避妊薬の実用性をテストすることができます。
精液コレクションおよび液状化/粘度測定のための考察の重要なポイントは、精子の感度とキャピラリー チューブの角度です。精子は温度変化に敏感です。精子機能と運動のストリーム分析は実験成果、組織に不可欠な精液が 37 ° C で、すべてに保持する必要がある場合は、光に最小限の露出で。複数の女性から収集するいくつかのサンプルがある場合時待ち時間を最小限に抑えるために安楽死させる動物 1 つ。液状化測定用キャピラリー チューブのさまざまな角度は液状化時で不整合を生成します。したがって、調査官が保持しているキャピラリー チューブ管の壁に平行 (180 ° の角度) で各調査官によって作成された可変性を最小限に抑えます。精液サンプルは 9:00 h 以降に収集すべきではない、これは子宮内の体液の再吸収のためです。調査官は、液状化の測定のための十分な流体材料を受けることができません。
精液液状化の媒介主に13の前立腺から分泌される PSA の酵素活性を設立します。しかし、生体内で液化プロセス8女性の生殖器官の役割を決定する限られた研究があります。したがって、女性の生殖器官からの精液の採取は、液状化を検討する重要な利点処理生体内で精液が女性の生殖管14から分泌物にさらされた後を提供します。結論としては、射精後精液液状化/粘度測定には、精液と女性の生殖器官間の相互作用を解読する研究者ことができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、WW に獣医の大学 (WSU) スタートアップ資金によってサポートされます。著者は、この原稿の批判的読解のシエラ ・ オルセン (WSU) をありがとうございます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
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