Summary
वीर्य द्रवीकरण के लिए आवश्यक है शुक्राणु को लाभदायक जेल से मुक्ति । यह अध्ययन महिला प्रजनन पथ पोस्ट-सहवास से वीर्य एकत्रित करने के लिए प्रक्रियाओं को प्रदान करता है, और वीर्य द्रवीकरण समय को मापने ।
Abstract
चूहों में, बोल पड़ना वीर्य गर्भाशय में जमा हो जाता है. स्खलन के बाद, वीर्य जेल से संगति-जैसे पानी के लिए, एक प्रक्रिया द्रवीकरण बुलाया बदल जाता है । इस अध्ययन में, हम एक माउस मॉडल में महिला प्रजनन पथ से पोस्ट-बोल-पड़ना वीर्य इकट्ठा करने के लिए कैसे दिखा. सबसे पहले, मद अवस्था में वयस्क मादा चूहे एक पुरुष के पिंजरे में रात भर घर में रहती थीं. अगली सुबह, शयन योनि खोलने में copulatory प्लग की उपस्थिति से पुष्टि की थी । copulatory प्लग के साथ महिला चूहों euthanized थे, और एक प्रजनन मार्ग एक पूरे के रूप में एकत्र किया गया था (योनि, गर्भाशय, oviducts, अंडाशय), एक बंद व्यवस्था सुनिश्चित करने के लिए वीर्य को नियंत्रित. प्रजनन पथ एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में रखा गया था, और योनि के लिए ट्यूब में वीर्य को रिहा करने के लिए काट दिया गया था । विश्लेषण के लिए अधिकतम वीर्य की मात्रा सुनिश्चित करने के लिए, दांत संदंश को डिंबग्रंथि अंत से योनि अंत निष्कासित शेष वीर्य को गर्भाशय के सींग निचोड़ करने के लिए इस्तेमाल किया गया । इसके बाद पूरे जनन तंत्र को छोड़ दिया गया । वीर्य से युक्त ट्यूब संक्षेप में नीचे की प्रकाता थी. एक 25 μL केशिका पिपेट ट्यूब में १८० ° कोण (ट्यूब दीवार के समानांतर) में रखा गया था । 25 μL लाइन के लिए केशिका ट्यूब को भरने के लिए इस्तेमाल समय की मात्रा दर्ज की गई । एक सिद्ध पुरुष ब्रीडर से वीर्य आमतौर पर एक 25 μL केशिका ट्यूब भरने के लिए लगभग 60-180 एस लेता है । यह वीर्य संग्रह तकनीक भी अन्य बहाव अनुप्रयोगों में ऐसे शुक्राणु इमेजिंग और गतिशीलता विश्लेषण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
मादा प्रजनन पथ ऊपरी और निचले इलाकों में शामिल है । ऊपरी प्रजनन पथ फैलोपियन ट्यूब, गर्भाशय, और endocervix शामिल हैं । लोअर प्रजनन पथ ectocervix और योनि शामिल हैं । मनुष्यों में, बोल पड़ना वीर्य योनि के पूर्वकाल दीवार पर जमा है, ectocervix1के बगल में । चूहों में, तथापि, वीर्य2संभोग के बाद मिनट के भीतर गर्भाशय में बह रहा है ।
वीर्य स्खलन के सेकंड के भीतर जम जाता है कि लाभदायक जेल होता है, जिससे शुक्राणु फंस और मैटीरियल3हो जाता है । द्रवीकरण ने वीर्य को जेल से बदलकर मैटीरियल शुक्राणुओं को रिलीज किया-जैसे कि पानी में संगति करना । शुक्राणु गतिशीलता और स्तनधारी प्रजनन के लिए यह प्रक्रिया जरूरी है । वीर्य द्रवीकरण का ज्ञान अधिकांशतः इन विट्रो अध्ययनों पर आधारित होता है जहाँ वीर्य एक कल्चरल डिश में तरलीकृत हो जाता है. मनुष्यों में, प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन या पीएसए के एंजाइमी गतिविधि (भी kallikrein-संबंधित peptidase 3 या KLK3 के रूप में जाना जाता है) द्रवीकरण के hydrolysis के माध्यम से semenogelins के लिए प्रमुख योगदानकर्ता है (जेल बनाने प्रोटीन वीर्य में मौजूद)4 ,5,6. semenogelins का क्षरण शुक्राणु को लाभदायक रक्तकण से मुक्त कर, शुक्राणु गतिशीलता को बढ़ाते हैं । मुक्त शुक्राणु फैलोपियन ट्यूब की ओर तैरने के लिए अंडे खाद । द्रवीकरण (या वीर्य चिपचिपापन) परीक्षण प्रजनन क्लिनिक में वीर्य विश्लेषण के लिए मानक प्रारंभिक प्रदर्शनों में से एक के लिए पुरुष प्रजनन7का आकलन कर रहे हैं ।
हाल ही में प्रकाशित एक लेख से पता चलता है कि प्राथमिक द्रव का विश्लेषण महिला माउस प्रजनन पथ से एकत्र के बाद संभोग द्रवीकरण में एक कमी है कि बाद में प्रजनन दोष8का कारण बन सकता वर्णन किया जा सकता है । दोषपूर्ण द्रवीकरण जैसे वीर्य hyperviscosity में पुरुषों में ऊसर मामलों के 11.8-32.3% योगदान करता है9, सुझाव है कि सामान्य द्रवीकरण स्तनधारी प्रजनन के लिए अपरिहार्य है । हालांकि, अध्ययन और द्रवीकरण दोषों के उपचार विशेष रूप से पुरुष7पर ध्यान केंद्रित किया है । संभावना है कि महिला प्रजनन पथ वीर्य द्रवीकरण में एक भूमिका निभाता है पता नहीं लगाया गया है । इसलिए, वीर्य संग्रह और मापने द्रवीकरण समय के लिए तरीकों शोधकर्ताओं एक उपंयास नैदानिक उपकरण के लिए निर्धारित है कि क्या द्रवीकरण ब्याज की मॉडल जीव में बांझपन के कारणों में से एक हो सकता है प्रदान करेगा ।
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Protocol
इस अध्ययन में प्रयुक्त सभी जानवरों और प्रक्रियाओं को वॉशिंगटन स्टेट यूनिवर्सिटी (WSU) पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों और WSU-अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल #4702 और #4735 के अनुपालन में के अनुसार संभाला गया था ।
1. चूहों
-
मानक C57BL/6J वयस्क पुरुष चूहों या ब्याज की अन्य उपभेदों का उपयोग करें । पानी और भोजन के विज्ञापन libitum पहुंच के साथ, एक तापमान और आर्द्रता नियंत्रित वातावरण के तहत पशुओं को बनाए रखें ।
- 8 सप्ताह पुराने 10 महीने पुराने से लेकर पुरुष प्रजनकों का उपयोग करें । प्रयोगों में केवल सिद्ध प्रजनकों का उपयोग करें ।
-
प्रजनन पथ एस्ट्रोजन रिसेप्टर α के एक ऊतक चयनात्मक विलोपन के साथ वयस्क मादा चूहों का प्रयोग करें ( Esr1 जीन द्वारा इनकोडिंग) उपकला कोशिकाओं में10 (Wnt7aCre/ Esr1f/f, जिसे पीटकर या "KO" कहा जाता है) और नियंत्रण littermates (Esr1f/f, जिसे "CTRL" कहा जाता है) इस अध्ययन में ।
- 8 सप्ताह पुरानी महिलाओं का प्रयोग करें । ब्याज के प्रयोग के आधार पर विभिंन महिलाओं की उंर ।
- सुबह 08 बजे मद चक्र के चरणों का निर्धारण: ज । चक्र के मद चरण में केवल महिलाओं का प्रयोग करें । योनि धब्बा और कोशिकाविज्ञान विश्लेषण के विस्तृत तरीकों के लिए, पहले से प्रकाशित प्रक्रियाओं को देखें11.
2. सहवास और Copulatory प्लग का आकलन
- मद (16: ज) के दिन, एक पुरुष के पिंजरे में महिला घर ।
- अगली सुबह (08: ज), पुरुष माउस से महिला अलग ।
- संभोग के एक संकेत के रूप में एक योनि या copulatory प्लग की उपस्थिति या अनुपस्थिति का उपयोग करने के लिए पहले से प्रकाशित विधि12 के एक अनुकूलन का उपयोग करें ।
- पूंछ के आधार से महिला माउस पकड़ो संक्षेप में हिंद अंग उठा ।
- एक दंर्तखोदनी का उपयोग कर योनि खोलने पर एक बंद सफेद लाभदायक रक्तकण की उपस्थिति से copulatory प्लग का पता लगाएं । अगर copulatory प्लग मौजूद है तो दंर्तखोदनी को योनि नहर में नहीं डाला जा सकेगा ।
3. ऊतक संग्रह से पहले तैयारी
- Leibovitz के एल के 10 मिलीलीटर तैयार 15 मीडिया, 1% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक (L15 मीडिया + 1% FBS कहा जाता है) एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में । एक waterbath में 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर मीडिया की मशीन ।
- बहाव अनुप्रयोगों के लिए ऊतक और शुक्राणु की व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए, aliquot ऊतक संग्रह के लिए एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में पूर्व गर्म L15 मीडिया के 2 मिलीलीटर + 1% FBS ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए stereomicroscope के चरण गर्म । ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए हीट ब्लॉक सेट और ब्लॉक में एक खाली १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब जगह है ।
- यदि बहाव अनुप्रयोगों शुक्राणु गतिशीलता के इमेजिंग की आवश्यकता होती है, ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गिलास स्लाइड गर्म ।
4. ऊतक संग्रह
- ऊतक संग्रह क्षेत्र के लिए पूर्व गर्म L15 मीडिया + 1% FBS aliquot लाओ ।
- Euthanize मादा (~ 08:30h) का उपयोग कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन के बाद ।
नोट: यह लगभग 8 है संभोग के बाद एच, यह सोचते है कि संभोग आधी रात में जगह लेता है । - उदर क्षेत्र को बेनकाब करने के लिए एक लापरवाह स्थिति में पशु प्लेस ।
- हिंद अंगों के पास पेट पर ७०% शराब का छिड़काव ।
- निचली पेट की त्वचा पर एक छोटा-सा कट (~ 1 सेमी) बनाने के लिए विदारक कैंची का प्रयोग करें ।
- प्रमुख हाथ का उपयोग करने के लिए पूंछ (और हिंद अंग यदि आवश्यक खींच), जबकि गैर प्रमुख हाथ विपरीत दिशा में त्वचा खींचती है (सिर की ओर) को पेट की मांसपेशी बेनकाब । इस विधि से आंत के अंगों को बाल संदूषण की मात्रा को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
- पेट, योनि से सटे, आंत अंगों को बेनकाब करने के आधार पर एक वी आकार में पेट की मांसपेशी में कटौती ।
- प्रजनन तंत्र को बेनकाब करने के पक्ष में आंतों और पेट की चर्बी ले जाएँ ।
- बंद मूत्राशय और योनि क्षेत्र के ऊपर अंय ऊतकों ट्रिम कर दीजिए ।
- जघन symphysis कटौती के अलावा योनि ऊतक तक पहुंच प्राप्त करने के लिए ।
- योनि खोलने पर योनि ऊतक लिफ्ट और कैंची का उपयोग करने के लिए गुदा ऊतक से योनि नहर अलग ।
- ध्यान से वसंत कैंची का उपयोग कर गर्भाशय के दोनों ओर से mesenteric वसा ट्रिम कर दीजिए ।
सावधानी: गर्भाशय अंदर वीर्य के साथ बहुत नाजुक होता है । सावधान रहो गर्भाशय पंचर नहीं है, वरना वीर्य खो जाएगा । - कम प्रजनन मार्ग लिफ्ट और दोनों पक्षों के बंद डिंबग्रंथि वसा पैड में कटौती ।
- पूरे प्रजनन पथ के ट्यूब में स्थानांतरण पूर्व गर्म है Leibovitz एल 15 मीडिया + 1% FBS ।
5. गर्भाशय सामग्री संग्रह से वीर्य द्रवीकरण (चिपचिपापन) का मापन
- stereomicroscope की गर्म अवस्था पर, ऊतकों को ३५ मिमी बाँझ ऊतक संस्कृति ३.५ मिलीलीटर पूर्व गर्म एल के साथ भरा पकवान में स्थानांतरण-15 मीडिया + 1% FBS रक्त और अन्य दूषित पदार्थों के ऊतकों को साफ करने के लिए ।
सावधानी: जबकि धोने, वसा, नहीं गर्भाशय के ऊतकों को पकड़ो । इस बिंदु पर, वीर्य की उंमीद है गर्भाशय के अंदर बरकरार है । - दाग प्रयोगशाला पोंछे का उपयोग अतिरिक्त मीडिया के ऊतकों ।
- योनि अंत में ऊतक पकड़ो, जबकि पूर्व गरम microcentrifuge ट्यूब में डिंबग्रंथि समाप्त होता है रखकर । जबकि योनि अंत धारण, गर्भाशय के आधार पर गर्भाशय सींग में कटौती, गर्भाशय सींग microcentrifuge ट्यूब में गिर करने की अनुमति ।
- वीर्य को गर्भाशय के सींगों से बाहर निकाल कर ट्यूब में प्रवाहित कर दें । दांत संदंश का प्रयोग करें धीरे डिम्बग्रंथि अंत से योनि अंत तक गर्भाशय के सींग निचोड़, बाहर बचे हुए वीर्य को निष्कासित ।
- जला के ऊतकों को छोड़ दें ।
- संक्षेप में एक minicentrifuge में वीर्य नीचे स्पिन (~ 1-2 s) ।
- ट्यूब, गर्म मंच के समानांतर रखना-वीर्य बाहर नहीं फैल जाएगा ।
- टाइमर तैयार है और ' गिनती अप ' के लिए निर्धारित किया है ।
- एक १८० ° कोण पर वीर्य के नमूने में एक 25 µ एल केशिका ट्यूब डालें (ट्यूब दीवार के समानांतर) । यह विभिन्न कोणों पर केशिका ट्यूब पकड़ से प्रत्येक अन्वेषक के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए है.
- जैसे ही केशिका ट्यूब वीर्य के साथ संपर्क बनाता है टाइमर दबाएँ ।
- रिकॉर्ड समय (ओं) के लिए यह वीर्य 25 µ एल लाइन तक पहुंचने के लिए लेता है ।
- जब माप समाप्त हो गया है, तुरंत आगे कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सूखी गर्मी ब्लॉक में वीर्य युक्त ट्यूब डाल, ऐसे शुक्राणु गतिशीलता के वीडियो इमेजिंग के रूप में ।
- 20 मिनट के लिए 10% ब्लीच समाधान में ट्यूब डुबो और sharps कंटेनर में केशिका ट्यूब त्यागना द्वारा वीर्य युक्त केशिका ट्यूब को संक्रमित ।
6. शुक्राणु गतिशीलता की वीडियो इमेजिंग
- माइक्रोस्कोप और वीडियो इमेजिंग सॉफ्टवेयर चालू करें ।
- पूर्व-उष्ण काँच की स्लाइड पर बचे हुए वीर्य के पिपेट २० µ एल, जबकि काँच की स्लाइड को गरम मंच पर रखा गया है.
- एक गिलास coverslip के साथ कवर ।
- स्लाइड coverslip ओर माइक्रोस्कोप पर रखें ।
- ब्याज के क्षेत्र को खोजने के लिए 20X उद्देश्य लेंस का उपयोग करें ।
- वीडियो इमेजिंग के लिए 100X उद्देश्य लेंस को बदलें ।
- 30 एस के लिए 12 फ्रेम/एस (एफपीएस) पर वीडियो रिकॉर्ड ।
- बेतरतीब ढंग से जानवरों के प्रति अलग से कम 3 विभिन्न क्षेत्रों में वीडियो रिकॉर्ड.
- इमेजिंग जल्दी से प्रदर्शन और स्लाइड के लिए प्रकाश जोखिम को कम करने के क्रम में शुक्राणु गतिशीलता और व्यवहार्यता को बनाए रखने ।
नोट: यह इमेजिंग प्रक्रिया 2-3 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए । - पहले वर्णित8के रूप में ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए डेटा विश्लेषण करें ।
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Representative Results
वीर्य को ctrl और KO मादाओं से लगभग 8 ज उपजाऊ CTRL पुरुषों के साथ संभोग के बाद एकत्र किया गया था । द्रवीकरण (या वीर्य चिपचिपापन) वीर्य के साथ २५ μL केशिका ट्यूब को भरने के लिए लिया गया समय से मात्रा है. वीर्य से एकत्र CTRL uteri लिया २.०६ ± ०.१२ मिनट (मतलब ± एस. ई. एम, n = 5) केशिका ट्यूब (चित्रा 1) को भरने के लिए । हालांकि, KO uteri से एकत्र वीर्य ६० मिनट से अधिक समय लिया (६०.० ± ०.०, मतलब ± एस. ई. एम, प्रयोगात्मक समय के n = 5) । इन आंकड़ों का सुझाव है कि वीर्य काफी अधिक तरलीकृत या को KO uteri की तुलना में कम चिपचिपा है CTRL ।
महिला प्रजनन पथ से वीर्य इकट्ठा करने के बहाव अनुप्रयोगों में से एक को समझाने के लिए, शुक्राणु गतिशीलता वीडियो इमेजिंग का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. CTRL uteri से एकत्र वीर्य सूक्ष्म क्षेत्र के भीतर स्वतंत्र रूप से तैराकी शुक्राणु दिखाया, चित्रा 2aमें स्नैपशॉट में प्रतिनिधित्व किया. KO uteri से एकत्र वीर्य से पता चला है कि शुक्राणु के बहुमत के साथ एक साथ संकुल थे ंयूनतम गतिशीलता (चित्रा बी) । इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि संभोग के बाद मादा प्रजनन पथ 8 ज से एकत्र वीर्य आगे शुक्राणु विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
चित्र 1 : माउस uteri से एकत्र वीर्य से द्रवीकरण समय (वीर्य चिपचिपापन). द्रवीकरण समय के चित्रमय प्रतिनिधित्व (मिन) वीर्य के CTRL और KO uteri से एकत्र लगभग 8 ज संभोग के बाद । डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± S.E.M., n = 5 मिहला/जीनोटाइप. p < 0.001, ख़राब छात्र t-test. अनुमति के साथ पहले से प्रकाशित परिणाम 8 से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : शुक्राणु के प्रतिनिधि छवियों से एकत्र वीर्य के भीतर माउस uteri. (क) CTRL और (B) KO uteri से एकत्र किए गए वीर्य में शुक्राणुओं के 1000X आवर्धन पर ली गई वीडियो इमेजिंग से प्रतिनिधि स्नैपशॉट्स । अनुमति के साथ पहले से प्रकाशित परिणाम8 से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
माउस uteri से वीर्य का संग्रह पूर्व के रूप में वीर्य और मादा प्रजनन पथ से स्राव के बीच शारीरिक बातचीत वर्णन कर सकते हैं के रूप में इन विट्रो में अधिक से अधिक लाभ प्रदान कर सकते हैं। इस अध्ययन में प्रस्तुत तकनीक शोधकर्ताओं वीर्य की गुणवत्ता के साथ ही शुक्राणु व्यवहार्यता और आदर्श शारीरिक स्थितियों में गतिशीलता निर्धारित करने के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, वहां विभिंन अनुप्रवाह विश्लेषण कि uteri से एकत्र वीर्य का उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, शुक्राणु के लिए वास्तविक शुक्राणु गर्भाशय में प्रवेश संख्या और शुक्राणु भी गतिशीलता परख के लिए imaged किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए गिना जा सकता है । निषेचन की क्षमता के लिए वीर्य एकत्र करने के लिए आदर्श समय बिंदु 1 से 2 के भीतर होना चाहिए1संभोग के बाद एच ।
पहले बताया गया बहाव अनुप्रयोगों के अलावा, जांचकर्ताओं का भी अवरोधकों के प्रभाव का मूल्यांकन कर सकते है/शुक्राणु परिवहन प्रक्रियाओं पर ब्याज की, जैसे वीर्य द्रवीकरण (या वीर्य चिपचिपापन), पथ में शुक्राणु संख्या, शुक्राणु गतिशीलता, या शुक्राणु महिला प्रजनन पथ के विभिंन क्षेत्रों में प्रवास । यौगिकों महिला प्रजनन मार्ग में लागू किया जा सकता है8संभोग से पहले । इसके बाद, उन अवरोधकों/यौगिकों के वीर्य का नमूना पोस्ट-सहवास से मूल्यांकन किया जा सकता है. इन तरीकों को गर्भनिरोधक दवाओं है कि शुक्राणु परिवहन को बाधित की व्यावहारिकता का परीक्षण करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।
वीर्य संग्रह और द्रवीकरण/चिपचिपापन माप के लिए विचार के महत्वपूर्ण अंक शुक्राणु की संवेदनशीलता और केशिका ट्यूब के कोण हैं । शुक्राणु तापमान परिवर्तन के प्रति संवेदनशील होते हैं । यदि शुक्राणु समारोह और गतिशीलता के बहाव का विश्लेषण प्रयोगात्मक परिणामों के लिए आवश्यक है, ऊतक और वीर्य को हर समय ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए, प्रकाश के लिए ंयूनतम जोखिम के साथ । कई महिलाओं से इकट्ठा करने के लिए अनेक नमूने हैं, तो इंतजार को कम करने के लिए एक समय में एक जानवरों euthanize । द्रवीकरण माप के लिए, केशिका ट्यूब के विभिन्न कोणों द्रवीकरण समय में विसंगतियों उत्पन्न करते हैं । इसलिए, जांचकर्ताओं के लिए ट्यूब दीवार के समानांतर केशिका ट्यूब पकड़ है (एक १८० ° कोण पर) प्रत्येक अन्वेषक द्वारा बनाई गई परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए. वीर्य का नमूना 09: ज से बाद में एकत्र नहीं किया जाना चाहिए, यह गर्भाशय में द्रव पुनर्अवशोषण के कारण है । जांचकर्ता द्रवीकरण माप के लिए पर्याप्त द्रव सामग्री प्राप्त नहीं हो सकता है ।
यह स्थापित है कि वीर्य द्रवीकरण मुख्य रूप से प्रोस्टेट ग्रंथि13से स्रावित पीएसए के एंजाइमी गतिविधि द्वारा मध्यस्थता है । हालांकि, vivo द्रवीकरण प्रोसेस8 में दौरान महिला प्रजनन तंत्र की भूमिकाओं को निर्धारित करने के लिए सीमित अध्ययन कर रहे हैं । इसलिए, महिला प्रजनन पथ से वीर्य का संग्रह vivo मेंद्रवीकरण प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है, वीर्य के बाद महिला प्रजनन पथ14से स्राव के लिए उजागर किया गया है. अंत में, बाद में बोल-पड़ना वीर्य द्रवीकरण/चिपचिपापन माप शोधकर्ताओं वीर्य और मादा प्रजनन पथ के बीच एक साथ खेलना समझने के लिए अनुमति देता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम कॉलेज ऑफ पशु चिकित्सा (WSU) स्टार्ट-अप फंड को WW करने के लिए सपोर्ट करता है । लेखक इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए सिएरा ऑलसेन (WSU) धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
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