Summary
Sæd flydendegørelse kræves for sæd for at blive befriet fra den skelsættende gel. Denne undersøgelse indeholder procedurer for indsamling af sæd fra den kvindelige forplantningsorganerne efter coitus, og måling af sæd flydendegørelse tid.
Abstract
I mus, er udbrød sæd deponeret i livmoderen. Efter ejakulation, sæden ændrer konsistens fra gel-lignende til rindende, en proces kaldet fortætning. I denne undersøgelse viser vi hvordan man skal indsamle post udbrød sæd fra den kvindelige forplantningsorganerne i en musemodel. Første, voksne hunmus i estrus scenen har været opstaldet i en mandlig bur natten over. Den næste morgen, blev samleje bekræftet ved tilstedeværelsen af copulatory plug på vaginal åbning. Hunmus med copulatory stik blev aflivet, og hver forplantningsorganerne blev indsamlet som helhed (vagina, livmoderen, æggelederne, æggestokkene), at sikre et lukket system til at indeholde sæd. Forplantningsorganerne blev placeret i en 1,5 mL microcentrifuge rør, og skeden var afskåret for at frigive sæden ind i røret. For at sikre maksimal sædmængde for analyse, blev tandløs pincet brugt til at presse de uterine horn fra æggestokkene ende til vaginal ende udvisning resterende sæd. Hele forplantningsorganerne blev derefter kasseres. Sæd-holdige røret var kortvarigt spundet ned. 25 μL kapillær pipette blev sat ind i røret i en 180° vinkel (parallel til rørvæggen). Mængden af tid, der bruges til at fylde kapillarrør til linjen 25 μL blev indspillet. Sæd fra et gennemprøvet mandlige opdrætter tager normalt ca. 60-180 s til at fylde en 25 μL kapillarrør. Denne sæd samling teknik kan også bruges i andre downstream applikationer såsom billedbehandling og motilitet sædanalyse.
Introduction
Den kvindelige forplantningsorganerne består af de øvre og nedre skrifter. Den øverste forplantningsorganerne omfatter æggelederne, livmoderen og endocervix. Den lavere forplantningsorganerne omfatter ectocervix og skeden. Hos mennesker, er udbrød sæd deponeret på den forreste væg af skeden, støder op til ectocervix1. I mus, dog er sæden fejet ind i livmoderen inden for minutter efter parring2.
Sæd indeholder skelsættende gel, der er størknet inden for sekunder efter ejakulation, forårsager sperm at blive fanget og immobiliseret3. Flydendegørelse frigiver immobiliseret sæd ved at ændre sæd fra en gel-lignende til en vandig konsistens. Denne proces er afgørende for sperm motilitet og pattedyr reproduktion. Viden om sæd flydendegørelse er hovedsagelig baseret på in vitro- undersøgelser hvor sæd bliver flydende i en kultur parabol. Hos mennesker er den enzymatiske aktivitet af prostata specifikt antigen eller PSA (også kendt som kallikrein-relaterede peptidase 3 eller KLK3) den største bidragyder til flydendegørelse gennem hydrolyse af semenogelins (gel-dannende proteiner til stede i sædvæsken)4 ,5,6. Nedbrydning af semenogelins frigiver sæd fra den skelsættende koagel, øge sperm mobilitet. Frigjort sædceller svømme mod æggelederen til at befrugte ægget. Fortætning (eller sæd viskositet) test er en af de standard indledende screeninger for sædanalyse i fertilitetsklinikker at vurdere mandlige fertilitet7.
En nyligt offentliggjort artikel viser, at analyse af skelsættende væske indsamlet fra den kvindelige mus forplantningsorganerne efter parring kan bruges til at illustrere en mangel ved fortætning, der efterfølgende kan forårsage frugtbarhed defekter8. Defekte flydendegørelse såsom sæd Hyperviskositet bidrager til 11,8-32.3% af ufrugtbar sager i mænd9, tyder på, at normale flydendegørelse er uundværlig for pattedyr reproduktion. Men, undersøgelser og behandling af flydendegørelse defekter har fokuseret udelukkende på den mandlige7. Muligheden for, at den kvindelige forplantningsorganerne spiller en rolle i sæd flydendegørelse er ikke blevet undersøgt. Metoder til tyrestationer og måling af flydendegørelse tid vil derfor tildele forskere en roman diagnostisk redskab for at afgøre, om flydendegørelse kunne være en af årsagerne til infertilitet hos model organisme af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr og procedurer, der anvendes i denne undersøgelse blev håndteret ifølge Washington State University (WSU) dyrs pleje og brug Udvalget retningslinjer og i overensstemmelse med WSU-godkendte animalske protokoller #4702 og #4735.
1. mus
-
Brug standard C57BL/6J voksne mandlige mus eller andre stammer af interesse. Vedligeholde dyr under en temperatur og luftfugtighed kontrolleret miljø, med ad libitum adgang til vand og mad.
- Brug mandlige opdrættere spænder fra 8 uger gammel til 10 måneder gammel. Brug kun gennemprøvede opdrættere i eksperimenter.
-
Bruge voksne hunmus med en væv selektiv sletning af forplantningsorganerne østrogen receptor α (kodet af Esr1 gen) i epitelceller10 (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, kaldet knockout eller "KO") og styre littermates (Esr1f/f, kaldet "CTRL") i denne undersøgelse.
- Bruge 8 uger gamle hunner. Aldre af hunner varierede afhængigt af forsøget med interesse.
- Bestemme faser af estrous cyklus i morgen klokken 08:00 h. Brug kun hunner på stadiet estrus cyklus. Detaljerede metoder til vaginal udtværing og cytologiske analyse, henvise til den tidligere udgivne procedurer11.
2. parring og vurdere Copulatory stik
- På dagen for estrus (16:00 h), hus kvinde i en mandlig bur.
- Den næste morgen (08:00 h), adskille kvindelige fra den mandlige mus.
- Bruge en tilpasning af en tidligere offentliggjorte metode12 adgang til tilstedeværelsen eller fraværet af en vaginal eller copulatory plug som en indikation af parring.
- Hold den kvindelige mus fra bunden af halen kort ophæve hind lemmer.
- Find den copulatory plug af tilstedeværelsen af en off-white skelsættende koagel ved vaginal åbning ved hjælp af en tandstik. Hvis den copulatory plug er til stede, vil tandstikker ikke kunne blive indsat i vaginal kanalen.
3. forberedelse før væv samling
- Forberede 10 mL af Leibovitz's L-15 medier, suppleret med 1% føtal bovint serum (kaldet L15 medier + 1% FBS) i en 15 mL tube. Inkuber medier ved 37 ° C i 15 min i et vandbad.
- For at bevare levedygtigheden af væv og sæd til downstream applikationer, alikvot 2 mL af pre varmede L15 medier + 1% FBS i et 2 mL microcentrifuge tube for væv samling.
- Varm fase af stereomikroskopet til 37 ° C. Angiv den varme-blok til 37 ° C og læg en tom 1,5 mL microcentrifuge tube i blokken.
- Hvis downstream-applikationer kræver imaging af sædkvalitet, varme glas dias til 37 ° C.
4. væv samling
- Bringe pre varmede L15 medier + 1% FBS delprøve til området væv samling.
- Aflive kvindelige (~ 08: 30h) ved hjælp af kuldioxid kvælning efterfulgt af cervikal dislokation.
Bemærk: Dette er ca 8 h efter parring, antages det, at parringen finder sted ved midnat. - Placere dyret i en liggende stilling at eksponere maveregionen.
- Spray 70% alkohol på maven i nærheden af hind lemmer.
- Bruge dissekere saksen til at gøre en lille snit (~ 1 cm) på huden af den nederste del af maven.
- Brug den dominerende hånd for at trække den hale (og hind benene om nødvendigt) mens ikke-dominerende hånd trækker huden i den modsatte retning (mod hovedet) for at udsætte den mavemuskel. Denne metode bruges til at minimere mængden af hår kontaminering til de indre organer.
- Skær den mavemuskel i en V-form i bunden af maven, støder op til skeden, at udsætte de viscerale organer.
- Flytte tarme og abdominal fedt til side til at eksponere forplantningsorganerne.
- Trim off blæren og andre væv over det vaginale område.
- Skære pubica fra hinanden for at få adgang til vaginal væv.
- Løft den vaginal væv ved skedeåbningen og ved hjælp af saks til at adskille den vaginale kanal fra den rektal væv.
- Omhyggeligt trim off mesenteriallymfeknuderne fedt fra begge sider af livmoderen med foråret saks.
Forsigtig: Livmoderen er meget skrøbelig med sæd inde. Pas på ikke at punktere livmoderen, ellers sæden vil gå tabt. - Løft den nederste forplantningsorganerne og skære den æggestokkene fedt pad ud af begge sider.
- Overføre hele forplantningsorganerne ind i røret på forhånd varmede Leibovitz L-15 media + 1% FBS.
5. målingen af sæd fortætning (viskositet) fra uterus indhold samling
- På stadiet opvarmet af stereomikroskopet overførsel væv i en 35 mm sterile vævskultur skål fyldt med 3,5 mL pre varmede L-15 media + 1% FBS at rense væv af blod og andre forurenende stoffer.
Forsigtig: Mens vask, grab væv af fedt, ikke i livmoderen. På dette tidspunkt sæden forventes være intakt inde i livmoderen. - DUP væv af overskydende medier ved hjælp af laboratoriet klude.
- Holde væv for vaginal enden samtidig med at placere de æggestokkene ender i forvarmet microcentrifuge røret. Mens du holder vaginal slutningen, skæres de uterine horn i bunden af livmoderen, gør det muligt uterin horn at falde ind i microcentrifuge røret.
- Lad sæden flow ud af de uterine horn ind i røret. Bruge tandløse tang til at forsigtigt klemme de uterine horn fra æggestokkene udgangen til vaginal slutningen, udvise ud sidesten sæd.
- Kassér væv i biohazard taske og forbrænde.
- Kort spin ned sæd i en minicentrifuge (~ 1-2 s).
- Lægge røret, parallelt med den opvarmede fase - sæd vil ikke løber ud.
- Intervalur klar og indstillet til 'tælle '.
- Indsæt en 25 µL kapillarrør i sædprøven i en 180° vinkel (parallelt med rørvæggen). Dette er for at mindske variabiliteten mellem hver investigator fra bedriften den kapillarrør i forskellige vinkler.
- Tryk på timer, så snart den kapillarrør gør kontakt med sæden.
- Registrere tid (s), det tager for sæden at nå 25 µL linje.
- Når målingen er færdig, straks lægge røret indeholder sæd tilbage i den tørre varme blok for yderligere funktionel analyse, såsom video billeddannelse af sperm motilitet.
- Desinficere kapillarrør indeholdende sæd ved at nedsænke røret i 10% blegemiddelopløsning i 20 min. og kassér kapillarrør i objektbeholderen klid.
6. video billeddannelse af sædkvalitet
- Tænde mikroskopet og video billedbehandlingsprogrammer.
- Der afpipetteres 20 µL af den resterende sæd diaset pre varmede glas mens glas dias er placeret på den opvarmede scene.
- Dække med et glas coverslip.
- Placer slide coverslip side ned på mikroskopet.
- Bruge 20 X mål linse for at finde interesseområde.
- Ændre til 100 X mål linse til video billeddannelse.
- Optage video på 12 rammer/s (fps) for 30 s.
- Tilfældigt optage videoer i mindst 3 forskellige områder pr. dyr.
- Udføre imaging hurtigt og minimere lys eksponering til diaset for at bevare sædkvalitet og levedygtighed.
Bemærk: Denne billeddannelse procedure bør ske inden for 2-3 min. - Udføre dataanalyse ved hjælp af ImageJ software som tidligere beskrevet8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sæd er indsamlet fra CTRL og KO hunner ca 8 h efter parring med frugtbar CTRL hanner. Fortætning (eller sæd viskositet) er kvantificeret ved den tid, det tager at fylde 25 μL kapillarrør med sæd. Sæd opsamlet fra CTRL livmoder benyttede 2.06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) at fylde kapillarrør (figur 1). Dog sæden indsamlet fra KO livmoder tog længere end 60 min. (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) eksperimentelle tid. Disse data tyder på, at sæden er væsentligt mere flydende eller mindre tyktflydende i CTRL i forhold til KO livmoder.
For at illustrere en af de efterfølgende applikationer til opkrævning af sæd fra den kvindelige forplantningsorganerne, blev sperm motilitet vurderet ved hjælp af video billeddannelse. Sæd, der opsamles fra CTRL livmoder viste frit-svømning sæd inden for feltet mikroskopiske, repræsenteret i snapshot i figur 2A. Sæd opsamlet fra KO livmoder viste, at størstedelen af sæden var grupperet sammen med minimal mobilitet (figur 2B). Disse resultater viser, at sæd, der opsamles fra den kvindelige forplantningsorganerne 8 h efter parring kan bruges til yderligere sædanalyse.
Figur 1 : Flydendegørelse tid (sæd viskositet) fra sæd opsamlet fra mus livmoder. Grafisk repræsentation af flydendegørelse tid (min) af sæd opsamlet fra CTRL og KO livmoder ca 8 timer efter parring. Data repræsenterer mean±S.E.M., n = 5 hunner/genotype. p < 0,001, uparrede Student t -test. Tilpasset fra tidligere offentliggjorte resultater8 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant billeder af sæd inden sæden indsamlet fra mus livmoder. Repræsentative snapshots fra den video imaging taget ved 1000 X forstørrelse af sædceller i sædvæsken indsamlet fra (A) CTRL og (B) KO livmoder. Tilpasset fra tidligere offentliggjorte resultater8 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indsamling af sæd fra mus livmoder kan give fordele over sæd analyse in vitro- som den tidligere kan illustrere fysiologiske samspillet mellem sæd og sekret fra den kvindelige forplantningsorganerne. De teknikker præsenteret i denne undersøgelse giver forskere til at bestemme sædkvalitet samt sæd levedygtighed og motilitet under ideelle fysiologiske forhold. Desuden er der forskellige downstream analyser, der kan udføres ved hjælp af sæd opsamlet fra livmoder, for eksempel sæden kan regnes for at bestemme den faktiske sperm nummer ind i livmoderen og sæd kan også være afbildet for motilitet assays. Den ideelle tidspunkt til at indsamle sæd til befrugtning kapacitet bør være inden for 1 til 2 timer efter parring1.
Ud over de tidligere nævnte downstream applikationer, efterforskere kan også vurdere virkningerne af hæmmere/forbindelser af interesse på sæd transport processer, såsom sæd fortætning (eller sæd viskositet), sperm antallet i tarmkanalen, sperm motilitet, eller sæd migration til forskellige områder af den kvindelige forplantningsorganerne. Stofferne kan anvendes i den kvindelige forplantningsorganerne inden parringen8. Derefter, virkningen af disse hæmmere/forbindelser kan vurderes ud fra sædprøven efter parring. Disse metoder kan være nyttige til at teste den praktiske gennemførlighed af svangerskabsforebyggende medicin, der hæmmer sperm transport.
Afgørende punkter med hensyn til sæd samling og fortætning/viskositet målinger er følsomheden af sæd og vinklen på de kapillarrør. Sædceller er følsomme over for temperaturforandringer. Hvis downstream analyse af sperm funktion og motilitet er afgørende for eksperimentelle resultater, vævet og sæd skal holdes ved 37 ° C på alle tidspunkter, med minimal udsættelse for lys. Hvis der er flere prøver til at indsamle fra flere hunner, aflive dyr én ad gangen for at minimere ventetiden. Til flydendegørelse måling generere forskellige vinkler af de kapillarrør uoverensstemmelser i fortætning tid. Efterforskerne skal derfor holde den kapillarrør parallelt med rørvæggen (i en 180° vinkel) til at minimere den variabilitet, lavet af hver investigator. Sædprøven skal ikke afhentes senere end 09:00 h, dette skyldes den flydende reabsorption i livmoderen. Investigator kan ikke skaffe tilstrækkelig væske materiel til flydendegørelse måling.
Det er fastslået, at sæd flydendegørelse hovedsagelig er medieret af enzymaktivitet af PSA udskilles fra prostata13. Der er dog begrænsede undersøgelser for at bestemme rollerne af kvindelige forplantningsorganerne under i vivo flydendegørelse processen8. Opsamling af sæd fra den kvindelige forplantningsorganerne giver derfor en afgørende fordel at studere flydendegørelse processer i vivo, efter sæd har været udsat for sekret fra den kvindelige forplantningsorganerne14. Afslutningsvis giver post udbrød sæd flydendegørelse/viskositets måling forskerne til at afkode samspillet mellem sæd og den kvindelige forplantningsorganerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af kollegium af veterinærmedicin (WSU) start-up fonden til WW. Forfatterne takke Sierra Olsen (WSU) for kritisk læsning af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H.
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , Cambridge, MA (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
