En simpel cellebaserede immunofluorescens Assay at opdage autoantistof mod N-Methyl-D-aspartat (NMDA) Receptor i blod
Summary
Vi udtrykte ectopically NR1 underenhed af NMDA-receptor markeret med grønt fluorescerende protein i humane embryonale celler (HEK293) som antigen til at opdage autoantistoffer mod NMDA receptor i blodet hos patienter mistænkt med autoimmun encephalitis. Denne enkle metode kan være egnet til screening i klinisk indstillinger.
Abstract
Tilstedeværelsen af anti-NMDA receptor autoantistof kan forårsage forskellige neuropsykiatriske symptomer hos de berørte patienter, kaldt anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis. Påvisning af specifikke autoantistof mod NMDA-receptor i blod eller cerebrospinalvæske (CSF) er afgørende for den præcise diagnose af denne betingelse. NMDA-receptor er en ion-kanal protein kompleks der indeholder fire underenheder, herunder to obligatoriske NMDA receptor subunit 1 (NR1) og en eller to NMDA-receptor subunit 2A (NR2A), NMDA receptor subunit 2B (NR2B), NMDA-receptor underenhed 2C (NR2C), eller NMDA receptor subunit 2D (NR2D). Epitop af anti-NMDA receptor autoantistof blev rapporteret til at være til stede i den ekstracellulære N-terminale domæne af NR1 subunit af NMDA-receptor. Målet med denne undersøgelse er at udvikle en enkel cellebaserede immunofluorescens assay, der kan bruges som en screeningstest til påvisning af forekomst af autoantistoffer mod NR1 underenhed af NMDA-receptor i blodet til at fremme den kliniske og grundlæggende forskning i anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis.
Introduction
Anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis er en nyligt anerkendt sygdom enhed, der kan forekomme hos patienter i alle aldre, og påvirker overvejende kvindelige patienter1,2. Det er en af de hyppigst diagnosticerede hjernebetændelse blandt patienter med indledende ukendt ætiologi af hjernebetændelse3. Patienter, der lider med anti-NMDA receptor encephalitis normalt har prodromale symptomer på en hovedpine eller feber, efterfulgt af en hurtig udvikling af bevidsthed niveau forandring og en række akutte neuropsykiatriske symptomer, herunder agitation, irritabilitet , angst, søvnløshed, hallucinationer, vrangforestillinger, aggression, bizar adfærd, bevægelse abnormaliteter, autonome dysregulering og beslaglæggelse angreb4,5. Tidlig erkendelse af denne betingelse og rettidig behandling med immunterapi er vigtige for et bedre resultat og endda fuld helbredelse i berørte patienter6. Det foreslås derfor, at anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis bør betragtes som en vigtig differentialdiagnose af patienter med akut eller ny-debut psykotiske træk7,8.
Udover kliniske funktioner er påvisning af autoantistof mod NMDA-receptor i blod eller CSF afgørende for den præcise diagnose af anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis9. De fleste af de immunologiske tests for at påvise anti-NMDA receptor autoantistof er tilgængelige i et par forskning laboratorier10,11, og der er kun et kommercielt tilgængelige cellebaserede immunofluorescens assay for screening af anti-NMDA receptor autoantistoffer12. Målet med denne undersøgelse er at udvikle en enkel in-house cellebaserede immunofluorescens assay, der bekvemt kan bruges i laboratoriet til at screene tilstedeværelsen af anti-NMDA receptor autoantistoffer til at lette den kliniske forskning af anti-NMDA receptor autoimmun encephalitis. NMDA-receptor er en heterotetramer ion-kanal proteinkompleks især udtrykt i hjernen. Det er lavet af to obligatoriske NR1 underenheder, og kombinationen af en eller to underenheder af NR2A, NR2B, NR2C eller NR2D13. En tidligere undersøgelse rapporterede, at de vigtigste epitop målrettet af antistoffer var på domænet ekstracellulære N-terminalen af NR1 subunit5. Derfor, i denne protokol, vi udtrykke den menneskelige rekombinant NR1-subunit protein af NMDA-receptor markeret med grønt fluorescerende proteiner (NGL) i den menneskelige embryonale nyre epitelcelle linje (HEK293) og udvikle en celle-baserede immunofluorescens assay til påvisning IgG-klasse af anti-NMDA receptor autoantistoffer i blodet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere cellebaserede immunologiske assays til skærmen forekomst af autoantistoffer mod NMDA receptor rapporteret i litteraturen, herunder levende celle-baserede immunofluorescens assay11, fast cellebaserede immunofluorescens assay9 , og flow flowcytometri-baserede assay14. Den levende celle-baserede immunofluorescens assay bør udføres kort efter udarbejdelsen af celler, der ectopically udtrykker NR1 protein, mens strømmen flowcytometri-base…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Chang Gung medicinsk Foundation (grant nummer CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 og CMRPG3E0633).
Materials
| GRIN1 (GFP-tagged) – Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
- Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
- Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
- Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
- Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
- Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
- Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
- Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
- Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
- Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
- Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
- Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).
