Summary
Wij hebben ectopically NR1 subeenheid van NMDA receptor gelabeld met groen fluorescent proteïne in menselijke embryonale cellen (HEK293) als antigeen te detecteren autoantilichamen tegen NMDA receptor in het bloed van patiënten verdacht met auto-immune encefalitis. Deze eenvoudige methode kan geschikt voor screeningonderzoek in klinische instellingen zijn.
Abstract
De aanwezigheid van anti-NMDA receptor autoantibody kan verschillende neuropsychiatrische symptomen veroorzaken in de betrokken patiënten, genoemd anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis. Opsporing van de specifieke autoantibody tegen de NMDA-receptor in het bloed of de cerebrospinale vloeistof (CSF) is essentieel voor de accurate diagnose van deze aandoening. De NMDA-receptor is een ion kanaal eiwit complex dat vier subeenheden bevat, waaronder twee verplichte NMDA receptor subeenheid 1 (NR1) en één of twee NMDA receptor subeenheid 2A (NR2A), NMDA receptor subeenheid 2B (NR2B), NMDA receptor subeenheid 2C (NR2C), of NMDA receptor subeenheid 2D (NR2D). De epitoop van anti-NMDA receptor autoantibody werd gemeld om aanwezig te zijn bij het extracellulaire N-terminale domein van de NR1 subeenheid van de NMDA-receptor. Het doel van deze studie is het ontwikkelen van een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie-test die kan worden gebruikt als een screeningtest voor het detecteren van de aanwezigheid van Autoantilichamen tegen NR1 subeenheid van de NMDA-receptor in het bloed te vergemakkelijken van de klinische en fundamentele onderzoek van anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis.
Introduction
Anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis is een nieuw herkende ziekte-entiteit die kan optreden bij patiënten van alle leeftijden, en beïnvloedt overwegend vrouwelijke patiënten1,2. Het is een van de meest frequent gediagnosticeerde encefalopathie bij patiënten met eerste onbekende etiologie van encefalitis3. Patiënten getroffen met anti-NMDA receptor encefalitis meestal hebben prodromal symptomen van een hoofdpijn of koorts, gevolgd door de snelle ontwikkeling van de wijzigingen in bewustzijn en een verscheidenheid aan acute neuropsychiatrische symptomen, met inbegrip van agitatie, prikkelbaarheid , angst, slapeloosheid, hallucinaties, wanen, agressie, bizar gedrag, afwijkingen van de beweging, autonome disregulatie en inbeslagneming aanvallen4,5. Vroege erkenning van deze aandoening en tijdige behandeling met immunotherapie zijn belangrijk voor een beter resultaat en zelfs volledig herstel in getroffen patiënten6. Vandaar, wordt voorgesteld dat de anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis moet worden beschouwd als een belangrijke differentiële diagnose van patiënten met acute of nieuwe-onset psychotische kenmerken7,8te presenteren.
Naast klinische eigenschappen is detectie van autoantibody tegen de NMDA-receptor in het bloed of LIQUOR essentieel voor de accurate diagnose van anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis9. De meeste van de immunologische tests voor de opsporing van de anti-NMDA receptor autoantibody zijn beschikbaar in een paar onderzoek laboratoria-10,11, en er is slechts één verkrijgbare cel-gebaseerde immunofluorescentie assay voor screening de anti-NMDA receptor autoantilichamen12. Het doel van deze studie is het ontwikkelen van een eenvoudige in-house cel-gebaseerde immunofluorescentie-bepaling die op het scherm van de aanwezigheid van anti-NMDA receptor autoantilichamen ter vergemakkelijking van het klinische onderzoek van anti-NMDA receptor gunstig in het laboratorium kan worden gebruikt auto-immune encefalitis. De NMDA-receptor is een heterotetramer ion kanaal eiwit complex specifiek uitgedrukt in de hersenen. Het bestaat uit twee verplichte NR1 subeenheden, en de combinatie van een of twee subeenheden van NR2A, NR2B, NR2C of NR2D13. Een eerdere studie gemeld dat de belangrijkste epitoop door de antilichamen gericht op het extracellulaire N-terminale domein van de NR1 subeenheid5 was. Vandaar, in dit protocol, we uiten het menselijke recombinante eiwitten van de NR1-subunit van NMDA receptor gelabeld met groen fluorescente proteïne (GFP) in de menselijke embryonale nier epitheliale cellijn (HEK293), en ontwikkelen van een cel-gebaseerde immunofluorescentie assay te detecteren de IgG-klasse van anti-NMDA receptor autoantilichamen in het bloed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd goedgekeurd door de institutionele Review Board van Chang Gung Memorial Hospital in Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3).
1. bereiding van de NR1-GFP expressie plasmide
- Mix 10 ng van NR1-GFP plasmide met 100 µL van Escherichia coli bevoegde cellen stam DH5α in een steriele 1,5 mL Centrifugeer buis, Pipetteer het mengsel voorzichtig omhoog en omlaag 4 - 6 keer, en de buis op ijs gedurende 20 minuten uit te broeden.
- Incubeer de buis bij 42 ° C gedurende 1 minuut in een waterbad, verwijderen van de buis van het waterbad, voeg 1 mL lysogenie Bouillon (LB) medium in de buis en Incubeer de buis bij 37 ° C in een broedmachine met schudden 1 h.
- Verspreid 50 µL van het mengsel op een LB agar bord met ampicilline (0,1 mg/mL), en na een nacht bebroeden de LB agarplaat bij 37 ° C in een broedstoof.
- Kies een één kolonie van de overnachting LB agarplaat met behulp van een steriele tip, en swirl van de tip in een in een buis van de bacteriële cultuur met 5 mL van LB medium en ampicilline (0,1 mg/mL). Incubeer de buis bij 37 ° C in een broedmachine met 's nachts te schudden.
- Aliquot 3 mL van de overnachting bacteriecultuur in een maatkolf van 500 mL met 250 mL steriele LB medium en ampicilline (0,1 mg/mL). Incubeer de kolf bij 37 ° C met schudden. Controleer regelmatig de optische dichtheid (OD) van de bacteriecultuur bij golflengte van 600 nm met behulp van een spectrometer, totdat de OD600 0.6-1.0 bereikt.
Opmerking: Meng goed 800 µL van de overnachting bacteriële cultuur met 200 µL glycerol bereiden de voorraad van glycerol en de glycerol voorraad tot-80 ° C voor toekomstig gebruik opslaan. - Bereiden NR1-GFP expressie plasmide van de bacteriecultuur 250 mL
- De cellen verzamelen door centrifugeren bij 6.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet bacteriën in 10 mL resuspensie buffer met RNase A; Vortex grondig totdat geen klomp wordt gezien.
- Voeg toe 10 mL lysis-buffermengsel aan de bacteriële suspensie zachtjes omkeren van het mengsel 4 - 6 maal en Incubeer de lysate bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.
- Voeg toe 10 mL pre gekoeld neerslag buffer aan de lysate, voorzichtig omkeren het mengsel 4 - 6 keer.
- Giet de lysate in de loop van een filterelement met het GLB op; wachten op 10 min op RT.
- Verwijder de dop van de cartridge outlet mondstuk, een zuiger invoegen de cartridge en druk zachtjes op de plunjer. Verzamelen de gefilterde lysate in een tube van 50 mL.
- 2,5 mL merkgebonden buffer van de fabrikant om de gefilterde lysate toevoegen, meng het mengsel door het omkeren van de buis ongeveer 10 keer en laat het mengsel op het ijs gedurende 30 minuten inwerken.
- Breng het gefilterde lysate mengsel op een filter kolom die vooraf werd geëquilibreerd met 10 mL evenwichtsinstelling buffer. Laat de kolom voor de afvoer door de zwaartekracht.
- Was de kolom met 30 mL was buffer tweemaal en elueer DNA uit de kolom met 15 mL elutie buffer.
- 10,5 mL (0.7 volumes) isopropanol en toevoegen aan de eluted DNA-buffer, meng goed en Centrifugeer het mengsel bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Giet het supernatant zorgvuldig wassen van de DNA-pellet met 5 mL endotoxine-gratis 70% ethanol eenmaal en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 10 minuten.
- De bovendrijvende vloeistof decanteren, droog de pellet gedurende 5-10 min. in een chemische kap, en los van de pellet in 300-500 µL van endotoxinen-vrije buffer.
- Bepaal de concentratie van de plasmide door het meten van de absorptie van de oplossing bij UV 260/280 nm met behulp van een spectrofotometer.
Opmerking: Bereiden de expressie plasmide GFP hetzelfde protocol gebruiken.
2. de transfectie van HEK293 cellen met NR1-GFP expressie plasmide
- Aliquoot 200 µL van 2% gelatine oplossing voor elk goed van een 48-well cultuur-plaat en de plaat bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten uit te broeden.
- De oplossing van de gelatine van de cellen in 200 µL van cel kweekmedium dat 10% foetale runderserum (FBS) in elk putje goed en zaad 5 x 104 HEK293 gecombineerd. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een bevochtigde incubator geleverd met 5% CO2 's nachts.
Opmerking: De cellen werden geteld met behulp van een hemocytometer. - Op de volgende dag, vervangen door het gebruikte kweekmedium 200 µL van verse kweekmedium dat 10% FBS per putje.
- Voor elke single Nou, bereid oplossing A door het mengen van 100 ng van NR1-tGFP plasmide met 20 µL cultuurmedium en oplossing B door het mengen van 0.8 µL transfectiereagens met 20 µL cultuurmedium. Vermenigvuldig het aantal putten die nodig zijn ter voorbereiding van het totale volume van elk experiment.
- Bereid oplossing C door het mengen van oplossing A en B-oplossing, en het mengsel op RT voor 20-30 min uit te broeden.
- Aliquoot 40 µL van oplossing C aan elk putje met de cellen van de HEK293, zachtjes swirl van de plaat, en de plaat bij 37 ° C in een bevochtigde incubator geleverd met 5% CO2 's nachts uit te broeden.
- Controleer de expressie van NR1-GFP recombinante eiwitten in de cellen van de gastheer onder fluorescente microscoop met 40 X-200 X vergroting (excitatie/emissie: 482/502 nm), en gaat u verder met de bepaling van cel-gebaseerde immunofluorescentie.
Opmerking: Transfect de expressie plasmide GFP in de cellen van de HEK293 met behulp van hetzelfde protocol.
3. cel-gebaseerde immunofluorescentie Assay
- Het gebruikte medium de putjes gecombineerd, dan wassen elk putje met 200 µL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) drie keer.
- Voeg 200 µL van 4% paraformaldehyde-oplossing aan elk putje; Incubeer de plaat duikt met RT gedurende 15 minuten.
- Gecombineerd de paraformaldehyde-oplossing van de putten en wassen elk goed met 200 µL van PBS driemaal.
- Voeg 200 µL van 10% magere melk in PBST (0,1% Tween-20 in PBS) oplossing voor elk goed, en de plaat duikt met RT voor 1 h met zacht schudden uit te broeden.
- De 10% magere melk in PBST oplossing uit de put gecombineerd, dan was de putjes met 200 µL PBST eens.
- Incubeer de putjes met verdunde plasma (1:100 in PBST) als het primaire antilichaam met zacht schudden bij RT gedurende 1 uur.
Opmerking: Plasma wordt gehaald uit het bloed van patiënten verdacht te hebben van auto-immune encefalitis. - Gecombineerd het verdunde plasma uit de putten en wassen elk goed met 200 µL van PBST driemaal.
- Voeg 200 µL van anti-menselijke geit IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 594 (1:1, 000 verdunning in PBST) aan elk putje en Incubeer de plaat van de cultuur op RT met zacht schudden voor 1 h.
- De geit anti-menselijke IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 594 oplossing gecombineerd, en was goed met 200 µL van PBST driemaal.
- Voeg 100 µL glycerol oplossing (50% glycerol in PBS en 1:100,000 van 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) aan elk putje.
- Observeren en beeld van de cellen onder een fluorescente microscoop met behulp van een 10 X oculair, en 4 X, 10 X en 20 X doelstellingen.
Opmerking: Gebruik het juiste filter voor elke kleurstof: voor NR1-GFP (excitatie/emissie = 482/502 nm), voor de Alexa Fluor 594 (excitatie/emissie = 561/594/nm), voor de DAPI (excitatie/emissie = 358/461 nm). Het gedrag van de negatieve controle de HEK cuvetten GFP op dezelfde manier uiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We kunnen gemiddeld 200-300 µg endotoxine-vrije expressie plasmide NR1-GFP en GFP krijgen van 250 mL bacteriecultuur na de procedures in sectie 1 van het protocol. Een bedrag van 100 ng/putje van de expressie plasmide werd gebruikt voor de transfectie van de HEK293 cellen gekweekt in de 48-well plaat zoals beschreven in de sectie 2 van het protocol. 24-30 uur na de transfectie, de cellen uitgesproken de NR1-GFP en GFP recombinante eiwitten onder fluorescente microscoop kon worden opgespoord. Figuur 1A toont het beeld van de cellen van de gastheer die uitdrukking geven aan de NR1-GFP, terwijl Figuur 1 d toont de cellen GFP uitdrukken. Het groene signaal kan worden gebruikt als een controller van de kwaliteit van de test: ongeveer 30% van de cellen had de groene signalen onder de fluorescente microscoop. Figuur 1A en 1 D tonen het beeld van de cellen van de gastheer die uitdrukking geven aan de NR1-GFP. Het groene signaal kan worden gebruikt als een controller van de kwaliteit van de test: ongeveer 30% van de cellen had de groene signalen onder de fluorescente microscoop. De cellen uiten NR1-GFP werden gebruikt om de aanwezigheid van anti-NMDA receptor autoantilichamen in het menselijk plasma monster te screenen.
In de cel-gebaseerde immunofluorescentie assay zoals beschreven in de sectie 3 van het protocol, de positieve controle monster (verkregen uit een commerciële bron, Zie Tabel van materialen) werd toegevoegd aan de gepoolde plasma in 1:10 verdunning volgens de instructies van de fabrikant. De gebundelde plasma bereid was uit 5 volwassen mannetjes en 5 volwassen vrouwtjes. Figuur 1B is het beeld van de Alexa Fluor-594 van positieve controlemonster na incubatie met de cellen expressie NR1-GFP, terwijl figuur 1E het beeld van de Alexa Fluor-594 van positieve controlemonster na incubatie met de cellen expressie GFP is. Figuur 1 c is de samengevoegde afbeelding van figuur 1A en figuur 1B: er zijn significante overlappingen van groene signalen en signalen van de rode in dezelfde cel, met vermelding van de co lokalisatie van NR1-GFP en de antistoffen tegen de NR1 subeenheid van NMDA receptor (pijlen). Een plasma monster waarin meer dan 30% overlappingen van groene en rode signalen zal worden geïnterpreteerd als positief in dit geval. Figuur 1F is de samengevoegde afbeelding uit Figuur 1 d en 1E figuur die als de negatieve controle voor Figuur 1 c fungeert. De zwakke rode kleur is achtergrond fluorescentie van de Alexa Fluor-594 afbeelding. Er is weinig overlap van groene en rode signalen, die aangeeft geen binding van de anti-NMDA receptor autoantibody tegen de recombinante eiwitten.
We waargenomen tijdens de totstandbrenging van de experimentele procedures, een lage signaal-/ ruisverhouding van de Alexa Fluor-594 afbeelding wanneer de plasma-monsters werden getest. We geprobeerd te optimaliseren de signal-to-noise verhouding door het uitvoeren van een seriële verdunning van het plasma formulier 1:10, 1:50, 1:100, en 1:200, en het testen van verschillende concentraties van Alex Fluor-594 gelabeld secundair antilichaam van 1:500 1:2, 000. We vonden dat 1:100 verdunning van de verdunning van het plasma en de 1:1,000 of de 1:2,000 van de Alexa Fluor-594 waren de optimale omstandigheden voor de interpretatie van de gegevens.
Figuur 1: representatieve beelden van de cel-gebaseerde immunofluorescentie assay voor het detecteren van anti-NMDA receptor autoantibody. (A) afbeelding van de HEK293 cellen die NR1-GFP uitdrukken. (B) de Alexa Fluor-594 beeld genomen uit hetzelfde veld van A na incubatie met het monster van de positieve controle. Rood signaal geeft aan de binding van de anti-NMDA receptor autoantilichamen aan de NR1 uitgedrukt in de HEK293 cellen. (C) de samengevoegde afbeelding van A en B. Gele kleur geeft aan dat de co lokalisatie van de NR1 (groene signaal) en de anti-NMDA receptor autoantilichamen (rood signaal). Pijlen geven aan voorbeelden van enkele prominente cellen weergegeven: Co lokalisatie van NR1-GFP en anti-NMDA receptor autoantilichamen. (D) beeld van de HEK293 cellen waarin NR1-GFP. (E) de Alexa Fluor-594 beeld genomen uit hetzelfde veld van D na incubatie met het monster van de positieve controle. Zwak rood signaal geeft aan de achtergrondgeluiden van Alexa Fluor-594 afbeelding. (F) de samengevoegde afbeelding voor D en E. Deze afbeelding fungeert als een negatieve controle, aangezien er weinig geel signaal waargenomen. De negatieve controle-afbeelding toont de specifieke binding van de anti-NMDA receptor antistoffen tegen de NR1-GFP in de test. Alle beelden werden genomen onder 10 X eye-lens en 20 X lens doelstelling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende cel-gebaseerde immunologische tests op het scherm van de aanwezigheid van Autoantilichamen tegen NMDA receptor gemeld in de literatuur, met inbegrip van de levende cel-gebaseerde immunofluorescentie assay11, vaste cel-gebaseerde immunofluorescentie assay9 , en stroom cytometry gebaseerde assay14. De levende cel-gebaseerde immunofluorescentie bepaling moet kort na de voorbereiding van cellen die zijn ectopically uiting geven aan de NR1 eiwit, terwijl de stroom cytometry gebaseerde bepaling opgeleid personeel en speciale apparatuur vereist worden uitgevoerd. Een vaste cel-gebaseerde immunofluorescentie assay is een handiger test die kan worden uitgevoerd voor klinische instellingen. Vandaar, gebruikt vele studies de commerciële indirecte vaste cel-gebaseerde immunofluorescentietest assay naar scherm anti-NMDA receptor autoantibody in serum en CSF specimens12,15. De gebruikte kit (Zie de tabel van materialen) bevat de vaste HEK293 cellen die ectopically de recombinante NR1 subeenheid van NMDA receptor uitdrukken. De bepaling is geëvalueerd om uitstekende prestaties bij de opsporing van de anti-NMDA-receptor IgG-antilichamen in het serum en de CSF specimens12. In ons protocol, we gebruikten dezelfde benadering als die aanbevolen door de fabrikant van de kit, behalve dat we NR1-GFP expressie plasmide gebruiken. De NR1-GFP-eiwit kan worden gebruikt om te controleren de transfectie efficiëntie en distributie van NR1 eiwit in elk experiment. Vandaar, kan het worden gebruikt als een waarborging van de kwaliteit van de test.
De efficiëntie van de transfectie van NR1-GFP expressie plasmide in de HEK293 cellen is ongeveer 30% in het protocol gepresenteerd hier, dat is voldoende voor de immunofluorescentie assay. Echter vonden we dat de intensiteit van de groene fluorescentie is niet gelijkmatig verdeeld onder de transfected cellen, hetgeen wijst op verschillen in de efficiëntie van transfectie of expressie vermogen van afzonderlijke cellen. De verschillende niveaus van de expressie van recombinant NR1-GFP in verschillende cellen veroorzaken heterogene intensiteit als het groene imago werd samengevoegd met de rode afbeelding van Alexa Fluor 594. De geit anti-menselijke die IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 594 werd gebruikt als het secundaire antilichaam te detecteren van de aanwezigheid van menselijke autoantibody IgG klasse. We vonden dat de helderheid van de Alexa Fluor 594 relatief zwakker dan die van de groen fluorescente proteïne is. We hebben geprobeerd het optimaliseren van de signaalsterkte door verhoging van de concentratie van de anti-menselijke die IgG geconjugeerd met Alex Fluor 594, echter de achtergrond ook verhoogd. Vandaar, is de optimale concentratie voor de anti-menselijke die IgG geconjugeerd met Alex Fluor 594 1:1,000 in dit laboratorium. Sommige monsters van plasma had ook een aanzienlijk hoog achtergrond signaal in de Alexa Fluor 594 afbeelding. Verschillende verdunningen van het plasma werden getest en bleek dat een minimale verdunning van 1:100 noodzakelijk is te verkrijgen van een schone achtergrond voor de meeste van de monsters. Vandaar, is het raadzaam 1:100 verdunning van plasma als de standaard stap in dit protocol. Vergeleken met de andere cel-gebaseerde testen dat het serummonster in de verdunning 1:10 en 1:20 bloed monster11,16 detecteren kunnen, dit huidige protocol beschikt niet over voldoende gevoeligheid voor het detecteren van lage titer anti-NMDA receptor autoantilichamen, dat is een beperking van het protocol.
Het huidige protocol is een test van de vaste cel-gebaseerde immunofluorescentie. De cultuur plaat kan worden opgeslagen in de koelkast 4 ° C na fixatie voor later gebruik voor maximaal 1 maand, in vergelijking met de levende cel-gebaseerde bepaling, die niet kan worden opgeslagen voor een lange tijd. Echter de NR1 proteïne zal worden gedenatureerd en verliest haar natuurlijke conformatie tijdens de fixatie-procedure, die de gedaante van de epitoop dat zich aan de anti-NMDA receptor autoantilichamen bindt kan beïnvloeden. Sommige studies vastgesteld vandaar, levende cel-gebaseerde immunofluorescene11,17. Ons protocol kan als alternatief worden gewijzigd om te worden van een levende cel-gebaseerde immunofluorescentie assay voor het behoud van de natuurlijke gedaante van de NR1 eiwit, als we Incubeer het monster plasma met de levende cellen eerst, en later herstellen van de cellen. Er is dus flexibiliteit in het protocol bij het voldoen aan de behoefte van het experiment.
De NMDA-receptor is een heterotetramer complex eiwit bestaande uit NR1, NR2A, NR2B, NR2C en NR2D. Het huidige protocol is ontworpen voor het detecteren van de IgG-klasse van autoantibody tegen NR1 subeenheid van de NMDA-receptor. Het protocol kan ook worden gewijzigd om te ontdekken van de verschillende isotypes van autoantilichamen, zolang de anti-menselijke IgG secundaire antilichamen worden vervangen door de andere specifieke klasse van secundaire antilichamen. Bovendien is het huidige protocol kan worden aangepast voor het detecteren van de aanwezigheid van Autoantilichamen tegen NR2A, NR2B, NR2C en NR2D, als de NR1-GFP expressie plasmide wordt vervangen door de bijbehorende expressie plasmide, respectievelijk.
In dit protocol gebruikten we een plasma monster in plaats van serum, omdat wij routinematig bloedmonster met anti-coagulant voor diverse studiedoeleinden verzamelen, maar het protocol op serum of CSF exemplaren toepassen kunt. De titer van de autoantilichamen in het plasma kan worden gekwantificeerd door seriële verdunning van het monster. We getest in het laboratorium ook de Afrikaanse groene aap nier fibroblast-achtige cellijn (COS1) als de cellen van de gastheer met behulp van hetzelfde protocol. De resultaten zijn hetzelfde als die gebruik maken van de HEK293 cellen, behalve dat de COS1 cellen een iets lager rendement van de transfectie dan de HEK293 cellen hebben.
Om na te gaan van de aanwezigheid van de anti-NMDA receptor autoantilichamen, is er aangegeven dat aanvullende experimenten zoals immunohistochemistry assay met behulp van knaagdier hersenen weefsels en immunocytochemie met behulp van primaire gekweekte knaagdier neuronen worden uitgevoerd5 ,9. Het huidige protocol kan daarom alleen worden beschouwd als een screening test. Hoewel haar experimentele geldigheid werd gecontroleerd met behulp van het voorbeeld van de positieve controle in deze studie, de gevoeligheid en specificiteit van deze bepaling in klinische instellingen moeten worden vastgesteld in de toekomst bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Chang Gung Medical Foundation (subsidie nummer CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 en CMRPG3E0633).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
- Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
- Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
- Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
- Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
- Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
- Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
- Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
- Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
- Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
- Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
- Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).
