En enkel cellebasert Immunofluorescence analysen å oppdage Autoantibody mot N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) reseptoren i blod
Summary
Vi uttrykte ectopically NR1 delenhet i NMDA reseptor merket med grønne fluorescerende protein i menneskelige embryonale celler (HEK293) som antigen å oppdage autoantistoffer mot NMDA reseptor i blodet av pasienter mistenkt med autoimmune encefalitt. Denne enkle metoden kan være passende for screening formål i klinisk innstillinger.
Abstract
Tilstedeværelsen av anti-NMDA reseptor autoantibody kan forårsake ulike nevropsykiatriske symptomer i berørte pasienter, kalt anti-NMDA reseptor autoimmune encefalitt. Påvisning av den spesifikke autoantibody mot NMDA reseptor i blodet eller cerebrospinalvæske (CSF) er avgjørende for nøyaktig diagnose av problemet. NMDA reseptor er en ion kanal protein kompleks som inneholder fire underenheter, inkludert to obligatoriske NMDA reseptor delenhet 1 (NR1) og en eller to NMDA reseptor delenhet 2A (NR2A), NMDA reseptor delenhet 2B (NR2B), NMDA reseptor delenhet 2C (NR2C), eller NMDA reseptor delenhet 2D (NR2D). Av anti-NMDA reseptor autoantibody ble rapportert å være til stede på ekstracellulære N-terminal domenet NR1 delenhet i NMDA reseptor. Målet med denne studien er å utvikle en enkel cellebasert immunofluorescence analysen som kan brukes som en screening test for å oppdage tilstedeværelsen av autoantistoffer mot NR1 delenhet i NMDA reseptor i blodet til rette klinisk og grunnleggende forskning anti-NMDA reseptor autoimmune encefalitt.
Introduction
Anti-NMDA reseptor autoimmune encefalitt er en nylig anerkjent sykdom enhet som kan oppstå hos pasienter i alle aldre, og påvirker hovedsakelig kvinnelige pasienter1,2. Det er en av de hyppigst diagnostisert encefalitt hos pasienter med første ukjent etiologi encefalitt3. Pasienter berørt med anti-NMDA reseptor encefalitt vanligvis har prodromalsymptomer en hodepine eller feber, etterfulgt av den raske utviklingen av bevissthet nivået endring og en rekke akutt nevropsykiatriske symptomer, inkludert agitasjon, irritabilitet , angst, søvnløshet, hallusinasjoner, vrangforestillinger, aggresjon, bisarr opptreden, bevegelse unormalt, autonome feilregulering og beslag angrep4,5. Tidlig anerkjennelse av denne tilstanden og rettidig behandling med immunterapi er viktig for et bedre resultat og med full gjenoppretting i pasientene påvirkes6. Derfor er det foreslått at anti-NMDA reseptor autoimmune encefalitt bør betraktes som et viktig differensialdiagnose av pasienter med akutt eller nye psykotiske funksjoner7,8.
Foruten kliniske funksjoner er oppdagelsen av autoantibody mot NMDA reseptor i blodet eller CSF avgjørende for korrekt diagnose av anti-NMDA reseptor autoimmune encefalitt9. De fleste av immunologiske tester oppdage anti-NMDA reseptor autoantibody er tilgjengelige i noen forskning laboratorier10,11, og det er bare en kommersielt tilgjengelig cellebasert immunofluorescence analysen for screening av anti-NMDA reseptor autoantistoffer12. Målet med denne studien er å utvikle en enkel in-house cellebasert immunofluorescence analysen som kan enkelt brukes i laboratoriet til skjermen tilstedeværelse av anti-NMDA reseptor autoantistoffer å lette klinisk forskning av anti-NMDA reseptor autoimmune encefalitt. NMDA reseptor er et heterotetramer ion kanal protein kompleks spesielt uttrykt i hjernen. Den er laget av to obligatoriske NR1 underenheter og kombinasjonen av en eller to underenheter av NR2A, NR2B, NR2C eller NR2D13. En tidligere studien rapporterte at den viktigste epitope målrettet av antistoffer var på N-terminal ekstracellulære domenet NR1 delenhet5. Derfor i denne protokollen, vi uttrykke menneskelige rekombinant NR1-delenhet protein av NMDA reseptor merket med grønne fluorescerende protein (GFP) i den menneskelige embryonale nyre epithelial celle linjen (HEK293) og utvikle en cellebasert immunofluorescence analysen å oppdage IgG klassen av anti-NMDA reseptor autoantistoffer i blodet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere cellebasert immunologiske analyser til skjermen tilstedeværelse av autoantistoffer mot NMDA reseptor rapportert i litteraturen, inkludert live cellebasert immunofluorescence analysen11, fast cellebasert immunofluorescence analysen9 , og flyt cytometri-baserte analysen14. Live cellebasert immunofluorescence analysen bør utføres etter utarbeidelse av celler ectopically uttrykke NR1 protein, mens flyt cytometri-baserte analysen krever op…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Chang Gung medisinsk Foundation (bevilgning nummer CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 og CMRPG3E0633).
Materials
| GRIN1 (GFP-tagged) – Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
- Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
- Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
- Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
- Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
- Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
- Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
- Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
- Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
- Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
- Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
- Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).
