Summary

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

Published: March 02, 2018
doi:

Summary

والمبيض المورفولوجية نظام نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية المتخصصة التنمية. ولو تم نشر أساليب لتشريح المبايض اليرقات والكبار، تتطلب تشريح المبيض الخوادر التقنيات المختلفة التي لم تنشر بالتفصيل. هنا أننا مخطط بروتوكول لتشريح وتلطيخ، وتصاعد المبايض الخوادر.

Abstract

على عكس الكبار المورفولوجية المبايض، المبايض الخوادر صعبة نسبيا الوصول ودراسة سبب هذه الصغيرة الحجم، وترانسلوسينسي، وغلفت ضمن حالة الخوادر. ويكمن التحدي لتشريح المبايض الخوادر أيضا في موقعها الفعلي داخل الخادرة: المبيض محاطة بخلايا الجسم الدهون داخل البطن الخوادر، ويجب إزالة هذه الخلايا الدهنية للسماح لتلطيخ جسم سليم. للتغلب على هذه التحديات، يستخدم هذا البروتوكول بيبيتس باستور مخصصة لاستخراج خلايا الجسم الدهون من البطن الخوادر. وعلاوة على ذلك، يستخدم كوفيرجلاس غرف بدلاً من أنبوب ميكروسينتريفوجي أثناء عملية المصبوغة لتحسين الرؤية الخوادر. ومع ذلك، على الرغم من هذه المزايا الأخرى للأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول، والتنفيذ الناجح لهذه التقنيات قد تنطوي على لا تزال عدة أيام من الممارسة نظراً لصغر حجم المبايض الخوادر. يمكن تطبيق التقنيات المبينة في هذا البروتوكول على تجارب دورة الوقت الذي يتم تحليل المبايض في مراحل مختلفة من التنمية الخوادر.

Introduction

بحوث الخلايا الجذعية باستخدام المبايض المورفولوجية وسعت على نطاق واسع منذ أول الوثائق المتعلقة بالخلايا الجذعية المتخصصة1،2،،من34. بعد وضع النسب تتبع الأدوات الوراثية، المبيض المورفولوجية تشريح استخدمت عادة لدراسة الأنساب الخلايا الجذعية، ويشير إلى الممرات التي تنظم صيانة الخلايا الجذعية، والانتشار، ومصير الخلايا الجذعية المتخصصة. قد تسفر عن المعرفة من هذه المسارات إشارات ثاقبة الأسباب المحتملة للسرطانات التي تنشأ من الخلايا الجذعية الشاذة النشاط5،،من67. لقد ثبت مؤخرا أن الخلايا الجذعية الجسدية في المبيض المورفولوجية ، المعروفة باسم الخلايا الجذعية جريب (التابعة)، بقوة تشبه الخلايا الجذعية المعوية الثدييات في جوانب كثيرة من تلك المنظمة8. لهذا السبب، المبايض المورفولوجية نظام نموذج مفيد للغاية لدراسة سلوك الخلايا الجذعية.

بينما المبايض اليرقات والكبار تقديم أدلة للإسراع بتطوير الخلايا الجذعية والمنظمة نهائياً من الخلايا الجذعية في المكانة، على التوالي، المبيض الخوادر هو هيكل وسيطة التي germline وخلايا جسدية إعادة تنظيم وتحديد هوياتهم 9 , 10-على الرغم من أن العديد من الدراسات قد درست جوانب التنمية أنسجة المبيض الخوادر10،11،،من1213، تبقى الأسئلة المتعلقة بالتمايز ومنظمة المكانية أنواع خلية المبيض أثناء تطوير الخوادر. على وجه الخصوص، مواصفات التابعة يحدث خلال هذه الفترة. هذا البروتوكول يحدد طريقة لتشريح وتلطيخ المبايض الخوادر في النقاط الزمنية المطلوبة – تقنية التي يمكن استخدامها في تجارب دورة الوقت أن تحليل التنمية المبيض الخوادر بالتفصيل من اليرقات إلى مرحلة الكبار.

يستخدم هذا البروتوكول لحساب حجم صغير وترانسلوسينسي، وصعوبة الوصول إلى المبيض الخوادر داخل البطن الخوادر، أدوات مثل مصنوعة خصيصا بيبيت باستور رقيقة-يميل إلى إزالة أنسجة الجسم الدهون البطن التي تعرقل وصول الأجسام المضادة المبيض. كوفيرجلاس واضحة، وغرف المستخدمة خلال جسم تلطيخ رؤية عروض أكبر في الخوادر ومنصة الطف لهزاز المبايض في “نوتاتور”. بناء على بروتوكول لتشريح المبيض اليرقات ميمون وجلبوا14، استخدمت في الخطوات الأولى للإجراء المصبوغة إلى أقصى حد ممكن الوصول غشاء الخلية بيرميبيليزيشن والأجسام المضادة لتركيزات عالية نسبيا من X-100 تريتون خلايا المبيض.

Protocol

1-اجلايينج تجمع حوالي عشرة الذكور والإناث خمسة عشر الكبار من الذباب المورفولوجية للنمط الوراثي المطلوب في قنينة الطعام يطير الغنية العادي وتستكمل مع الخميرة. لتجنب الازدحام القنينة، السماح بتفعيل الإناث وضع البيض لمدة لا تزيد على 2 – 4 ح14. نقل الكبار من القنين?…

Representative Results

ينبغي أن يؤدي تنفيذ هذا الإجراء بنجاح في تلطيخ جسم واضح أن يكشف عن هيكل وتنظيم الخلوية من المبيض الخوادر المورفولوجية . يمكن استخدام إيمونوهيستوتشيميستري المبينة في هذا البروتوكول تحديد أنواع الخلايا الملون عادة في المبايض اليرقات والكبار. خلايا ساق الخوادر المست?…

Discussion

أن الخطوة الأكثر صعبة وحرجة من هذا البروتوكول ينطوي على إعداد الخوادر المبايض قبل التثبيت. للتأكد من أن المبايض، صغيرة ودفن بخلايا الجسم الدهون داخل البطن الخوادر، ملطخة بما فيه الكفاية مع الأجسام المضادة، من المهم أن الدموع ليس فقط فتحه كبيرة في كيس البطن بالملقط، ولكن أيضا استخراج خلاي…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

كان يؤيد هذا البحث “المعاهد الوطنية للصحة” (RO1 GM079351 إلى D.K.). ونشكر دوروثيا Godt على نصيحتها مفيدة في تشريح المبيض الخوادر استناداً إلى بلدها الأصلي للبروتوكول. ونشكر أيضا ريلين إيمي لها المساعدة والتعليقات على المخطوطة.

Materials

Dumont #5 Forceps, biology Fine Scientific Tools 11252-20
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155383
Dissection microscope Nikon SMZ-10A
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Analysis software Carl Zeiss Zen
9 Depression Glass Spot Plates Pyrex 7220-85
Pasteur pipet Fisher Scientific 13-678-6B
Pasteur pipet bulb Various vendors
Bunsen burner Various vendors
Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 12-544-2
22 x 22 mm glass coverslips No 1 VWR 48366-067
Dapi Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Double-sided tape Scotch
Nutator Clay Adams
Fine brush #0, #3-#5 Various vendors
Gilson Pipetman Starter Kit Thomas Scientific F167300 Contains p20, p200, p1000 pipettors
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS
Triton Sigma-Aldrich 9002-93-1
10x PBS Ambion AM9624 Dilute to 1x PBS
Normal Goat Serum Jackson ImmunoResearch 5000121 Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration
Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration
Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration
Fly vials Denville Scientific V9406
Cotton Balls, For Wide Vials Genesee Scientific 51-102W
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 101400
Fly food Produced in laboratory Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid
Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) Bloomington Drosophila Stock Center

References

  1. Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
  2. Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
  3. Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
  4. Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
  5. Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
  6. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  7. Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
  8. Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
  9. Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).
  10. Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
  11. King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
  12. Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
  13. Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
  14. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537 (2011).
  15. Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).
  16. Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
  17. Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
  18. Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
  19. Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
  20. Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
  21. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52 (2006).

Play Video

Cite This Article
Park, K. S., Godt, D., Kalderon, D. Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries. J. Vis. Exp. (133), e56779, doi:10.3791/56779 (2018).

View Video