Summary

Dissection et la coloration des Drosophila ovaires Pupal

Published: March 02, 2018
doi:

Summary

L’ovaire de la drosophile est un système excellent modèle pour étudier le développement de niche de cellules souches. Bien que les méthodes pour disséquer les ovaires larvaires et adultes ont été publiées, les dissections ovaires nymphales exigent d’autres techniques qui n’ont pas été publiées en détail. Ici, nous exposons un protocole de dissection, coloration et montage des ovaires nymphales.

Abstract

Contrairement aux ovaires de drosophile adultes, ovaires nymphales sont relativement difficiles d’accès et examiner en raison de leur petite taille, la translucidité et moulant au sein de la pupe. Le défi de disséquer les ovaires nymphales réside aussi dans leur emplacement physique au sein de la chrysalide : les ovaires sont entourées par des cellules de corps gras à l’intérieur de l’abdomen pupal, et ces cellules adipeuses doivent être enlevés pour permettre une bonne anticorps. Pour surmonter ces défis, ce protocole utilise des pipettes Pasteur personnalisés afin d’extraire les cellules du tissu adipeux de l’abdomen pupal. En outre, une lamelle compartimentée est utilisée à la place d’un tube de microcentrifuge pendant le processus de coloration pour améliorer la visibilité de la pupe. Cependant, malgré ces et d’autres avantages des outils utilisés dans le présent protocole, l’exécution réussie de ces techniques peut nécessiter encore plusieurs jours de pratique en raison de la petite taille des ovaires nymphales. Les techniques décrites dans le présent protocole pourraient être appliquées à des expériences de cours moment où ovaires sont analysés à différents stades de développement de pupe.

Introduction

Recherche sur les cellules souches utilisant drosophile ovaires a largement augmenté depuis la première documentation d’une cellule souche niche1,2,3,4. Suit l’évolution des outils génétiques du traçage de lignage, drosophile ovaire dissections ont été couramment utilisées pour étudier des lignées de cellules souches et les voies qui régulent la maintenance des cellules souches, la prolifération et sort dans la niche de cellules souches de signalisation. Connaissance de ces voies de signalisation peut-être donner un aperçu des causes possibles des cancers qui proviennent des cellules souches aberrantes activité5,6,7. Il a récemment été démontré que les cellules souches somatiques dans l’ovaire de la drosophile , appelées cellules souches de follicule (FSC), ressemblent fortement aux mammifères les cellules souches intestinales dans de nombreux aspects de leur organisation8. Pour cette raison, les ovaires de drosophile sont un système modèle hautement utile pour étudier le comportement des cellules souches.

Alors que les ovaires larvaires et adultes offrent des indices de développement précoce de cellules souches et l’organisation de la finale des cellules souches dans la niche, respectivement, l’ovaire pupal est une structure intermédiaire, dans lequel les cellules germinales et les cellules somatiques réorganiser et d’établir leur identité 9 , 10. bien que plusieurs études ont examiné des aspects du développement des tissus dans l’ovaire pupal10,11,12,13, questions subsistent quant à la différenciation et l’organisation spatiale des types de cellules ovariennes au cours du développement de pupe. En particulier, la spécification du FSC se produit pendant cette période. Ce protocole décrit une méthode de dissection et coloration des pupes ovaires aux moments désirés — une technique qui peut être utilisée dans des expériences de cours temps qui analysent le développement de pupes ovarien en détail de du stade larvaire au stade adulte.

Pour expliquer la petite taille, translucidité et inaccessibilité de l’ovaire pupe dans l’abdomen de pupe, ce protocole utilise des outils tels qu’une pipette de Pasteur à pointe fine sur mesure pour enlever le tissu adipeux abdominal entrave l’accès d’anticorps à la ovaires. Une lamelle de claire, chambrée utilisée au cours de l’anticorps coloration offre une plus grande visibilité de la pupe et une plateforme plus douce balancement des ovaires sur un « Nutator ». Basé sur un protocole pour les dissections de larves ovaire de Maimon et Gilboa14, une concentration relativement élevée de Triton X-100 a été utilisée dans les premières étapes de la procédure de marquage pour maximiser l’accès perméabilisation et anticorps de membrane cellulaire à la cellules ovariennes.

Protocol

1. EggLaying Mélanger environ dix hommes et quinze femelles adultes drosophile mouches du génotype désiré dans un flacon de nourriture normale de mouche riche additionné de levure. Pour éviter le surpeuplement de la fiole, permettent des femelles accouplées à pondre pour pas plus de 2 à 4 h14. Transférer les adultes à partir du flacon dans un flacon de nouveau en tapant sur le flacon d’ouverture contre un flacon différent avec de la nourriture volée. Lai…

Representative Results

L’exécution réussie de cette procédure devrait se traduire par anticorps clair coloration qui révèle la structure et l’organisation cellulaire d’un ovaire de pupes de drosophile . Immunohistochemistry décrite dans le présent protocole peut être utilisé pour identifier les types de cellule couramment teintés ovaires larvaires et adultes. Les cellules de la tige de pupe dérivé essaim cellules18 (contour blanc par Fasciclin III) sont indiqu?…

Discussion

L’étape la plus critique et difficile du présent protocole nécessite la préparation des pupes ovaires avant la fixation. Pour s’assurer que les ovaires, petits et enterrées par les cellules de corps gras à l’intérieur de l’abdomen pupal, sont suffisamment colorées avec les anticorps, il est important de larme non seulement une grande ouverture dans le sac abdominale avec une pince, mais aussi extraire les cellules de corps gras qui obstruent les ovaires de l’anticorps. L’exécution réussie de cette ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par les National Institutes of Health (GM079351 RO1 à D.K.). Nous remercions Dorothea Godt pour ses conseils utiles sur des dissections ovaire pupal basé sur son protocole original. Nous remercions également Amy Reilein pour son aide et les commentaires sur le manuscrit.

Materials

Dumont #5 Forceps, biology Fine Scientific Tools 11252-20
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155383
Dissection microscope Nikon SMZ-10A
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Analysis software Carl Zeiss Zen
9 Depression Glass Spot Plates Pyrex 7220-85
Pasteur pipet Fisher Scientific 13-678-6B
Pasteur pipet bulb Various vendors
Bunsen burner Various vendors
Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 12-544-2
22 x 22 mm glass coverslips No 1 VWR 48366-067
Dapi Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Double-sided tape Scotch
Nutator Clay Adams
Fine brush #0, #3-#5 Various vendors
Gilson Pipetman Starter Kit Thomas Scientific F167300 Contains p20, p200, p1000 pipettors
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS
Triton Sigma-Aldrich 9002-93-1
10x PBS Ambion AM9624 Dilute to 1x PBS
Normal Goat Serum Jackson ImmunoResearch 5000121 Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration
Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration
Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration
Fly vials Denville Scientific V9406
Cotton Balls, For Wide Vials Genesee Scientific 51-102W
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 101400
Fly food Produced in laboratory Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid
Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) Bloomington Drosophila Stock Center

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Cite This Article
Park, K. S., Godt, D., Kalderon, D. Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries. J. Vis. Exp. (133), e56779, doi:10.3791/56779 (2018).

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