Summary

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

Published: March 02, 2018
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Summary

Drosophila 난소 줄기 세포 틈새 시장 개발을 공부 하는 우수한 모델 시스템입니다. 애벌레와 성인 난소를 해 부 방법 출판 되었습니다 비록 번데기 난소 해 자세히 게시 되지 않은 다른 기술이 필요 합니다. 여기 우리는 해 부, 얼룩, 번데기 난소를 장착 한 프로토콜 개요.

Abstract

성인 초파리 난소와 달리 번데기 난소는 상대적으로 어려운 액세스 하 여 검사 때문에 그들의 작은 크기, 반투명, 번데기 케이스 내 인. 번데기 난소를 해 부의 도전 또한 번데기 내의 그들의 물리적 위치에 속 인 다: 난소 번데기 복 부 내부 지방 신체 세포로 둘러싸여 있으며, 적절 한 항 체 얼룩이 지기 수 있도록 이러한 지방 세포를 제거 해야 합니다. 이러한 문제를 해결 하려면이 프로토콜 번데기 복 부에서 지방을 신체 세포를 추출 하는 사용자 지정 된 파스퇴르 pipets를 사용 합니다. 또한, 연 발된 coverglass 대신 사용 된다 microcentrifuge 튜브 착 과정 중 번데기의 가시성을 개선 하기 위해. 그러나, 이들과 다른 장점이이 프로토콜에 사용 되는 툴,에 불구 하 고 이러한 기술의 성공적인 실행 될 수 있습니다 여전히 번데기 난소의 작은 크기로 인해 연습의 몇 일. 이 프로토콜에서 설명 하는 기술은 난소 번데기 개발의 다양 한 단계에서 분석 하는 시간 과정 실험에 적용할 수 있습니다.

Introduction

줄기 세포 연구 초파리 난소를 사용 하 여 줄기 세포 틈새1,2,,34의 첫 번째 문서부터 널리 확장 했다. 개발 도구의 계보 추적 유전자 초파리 난소 해 일반적으로 줄기 세포 계보를 연구 하는 데 사용 되었습니다 다음 하 고 줄기 세포 유지, 확산, 및 운명 줄기 세포 틈새에 경로 신호. 이러한 신호 통로의 지식 탈 선 줄기 세포 활동5,,67에서 발생 하는 암의 잠재적인 원인에 대 한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 그것은 또한 최근 여 포 줄기 세포 (FSCs)로 알려진 초파리 난소에서 체세포 줄기 세포 강하게 그들의 조직8의 여러 측면에서 포유류 장 줄기 세포를 닮은 표시 되었습니다. 이러한 이유로, 초파리 난소는 줄기 세포 행동을 공부 하기 위한 매우 유용한 모델 시스템.

이른 줄기 세포 개발 및 틈새, 마지막 줄기 세포 조직에 단서를 각각 제공 하는 애벌레와 성인 난소 번데기 난소는 생식 및 체세포 재구성 및 그들의 정체성을 확립 하는 중간 구조 9 , 10. 여러 연구 번데기 난소10,11,,1213에 조직 개발의 측면 검사, 질문 남아 있다 분화와 공간 조직에 관한 난소 세포 유형 번데기 개발 중. 특히, FSCs의 규격은이 기간 동안 발생합니다. 이 프로토콜 설명 해 부하 고 원하는 시간 지점에서 번데기 난소를 얼룩이 지는 방법-성인 단계를 자세하게는 애벌레에서 번데기 난소 개발 분석 시간 과정 실험에 사용할 수 있는 기술.

작은 크기, 반투명, 및 번데기 복 부 내에서 번데기 난소의 어려움에 대 한 계정,이 프로토콜 활용 도구 주문 품 얇은 밀고 파스퇴르 피펫으로 복 부 지방을 신체 조직에 항 체 접근을 방해를 제거 하는 난소입니다. 명확 하 고, 연 발 coverglass 번데기와 락는 “Nutator”에 난소에 gentler 플랫폼의 제공 더 큰 시야를 얼룩이 지는 항 체 중에 사용 마이몬과 Gilboa14애벌레 난소 해에 대 한 프로토콜에 따라, Triton X-100의 상대적으로 높은 농도 고용 착 절차의 초기 단계에서 세포 막 permeabilization 및 항 체에 대 한 액세스를 극대화 하는 난소 세포입니다.

Protocol

1입니다. EggLaying 결합 약 10 남자와 정상적인 풍부한 비행 음식 효 모와 보충의 유리병에 원하는 유전자의 15 여성 성인 초파리 파리. 유리병과 밀을 피하기 위해, 성관계 여성 더 이상 보다 2-4 h14에 대 한 계란을 낳을 수 없습니다. 비행 음식 다른 유리병에 대 한 열기는 유리병을 활용 하 여 새로운 병으로 유리병에서 성인 전송. 계란 3-4 일 동안 실 온에서 애?…

Representative Results

이 절차의 성공적인 실행 명확한 항 체는 그 구조와 초파리 번데기 난소의 세포 조직 얼룩 발생 한다. 이 프로토콜에서 설명 Immunohistochemistry 애벌레와 성인 난소에 얼룩진 일반적으로 셀 형식을 식별 하 사용할 수 있습니다. 셀에서 파생 된 번데기 줄기의 메뚜기 세포18 (흰색에서 Fasciclin III에 의해 제시 된)는 그림 3에 표시 됩…

Discussion

이 프로토콜의 가장 중요 하 고 어려운 단계 고정 전에 번데기 난소의 준비를 포함 한다. 작고 뚱뚱한 몸 세포 번데기 복 부 내부에 의해 묻혀 난소 항 체와 함께 충분히 스테인드은,이 뿐만 아니라 복 부 자루에 큰 여 겸 자, 함께 눈물 하지만 방해 하는 뚱뚱한 몸을 셀 추출 하는 것이 중요 합니다 항 체에서의 난소 이 단계를 성공적으로 실행 해야 복 부 자루에서 뚱뚱한 몸 세포를 세척 하는 동안 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 대표이사 (RO1 GM079351). 우리는 그녀의 원래 프로토콜에 따라 번데기 난소 해에 그녀의 유용한 조언에 대 한 Dorothea 좋음 감사 합니다. 우리는 또한 그녀의 지원 및 원고에 대 한 의견에 대 한에 이미 Reilein 감사합니다.

Materials

Dumont #5 Forceps, biology Fine Scientific Tools 11252-20
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155383
Dissection microscope Nikon SMZ-10A
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Analysis software Carl Zeiss Zen
9 Depression Glass Spot Plates Pyrex 7220-85
Pasteur pipet Fisher Scientific 13-678-6B
Pasteur pipet bulb Various vendors
Bunsen burner Various vendors
Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 12-544-2
22 x 22 mm glass coverslips No 1 VWR 48366-067
Dapi Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Double-sided tape Scotch
Nutator Clay Adams
Fine brush #0, #3-#5 Various vendors
Gilson Pipetman Starter Kit Thomas Scientific F167300 Contains p20, p200, p1000 pipettors
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS
Triton Sigma-Aldrich 9002-93-1
10x PBS Ambion AM9624 Dilute to 1x PBS
Normal Goat Serum Jackson ImmunoResearch 5000121 Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration
Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration
Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration
Fly vials Denville Scientific V9406
Cotton Balls, For Wide Vials Genesee Scientific 51-102W
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 101400
Fly food Produced in laboratory Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid
Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) Bloomington Drosophila Stock Center

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Cite This Article
Park, K. S., Godt, D., Kalderon, D. Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries. J. Vis. Exp. (133), e56779, doi:10.3791/56779 (2018).

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