Summary
本稿では培養上皮細胞は、どのように切開のような病変便利なモデルの傷癒しの in vitro、共焦点イメージングを可能にするについて説明しますまたはレーザ走査顕微鏡と高品質を提供することができます。細胞の挙動と移行に関与するメカニズムの両方の研究のための質的・量的データ。
Abstract
細胞遊走は、創傷治癒に必須の側面です。人工を作成する傷を研究の動物モデルにコストがかかり、複雑な実験手順の結果にしばしば潜在的精度に欠けている間。上皮細胞の体外培養は、創傷治癒と細胞の治療法の影響で細胞の回遊行動の研究のため適切なプラットフォームを提供します。上皮細胞の生理学は非合流条件でよく勉強しました。ただし、このアプローチは、自然治癒で条件に類似しないかもしれない。機械的手段によって上皮の整合性を中断することは現実的なモデルを生成しますが、分子技術のアプリケーションを妨げることがあります。したがって、顕微鏡技術は上皮細胞の遊走を勉強に最適体外。ここで我々 は, 上皮細胞の渡り鳥の性能に関する量的・質的データを入手できる人工移行フロント アッセイ、人工傷スクラッチ試験 2 つの特定の方法を詳しく説明します。
Introduction
上皮のギャップの最終的な閉鎖と混乱の表面1の修復を担当しており、細胞遊走は創傷治癒に必要です。動物モデルにおける人工傷を実行できるように生理的条件2の近くでこの複雑なプロセスを複製するため。しかし、このアプローチは多くの場合コストがかかり、複雑な実験の手順、可能性のある創傷治癒過程の複雑な性質のための明確なプロセスの研究の精度を欠いている結果します。
上皮細胞の体外培養は、創傷治癒や処理セルの回遊行動に及ぼす影響のこれらの細胞が果たす役割を研究するため動物モデルの有用な代替を提供します。上皮細胞の生理学は非合流文化3,4,5,6; を使用して分子技術によってよく勉強しました。ただし、上皮整合性の破壊は結構機械的切開により通常。細胞培養、細胞のほとんどの数は、傷のギャップにさらされるかもしれないし、彼らは分子生物学の技術のための余りに小さいサンプルを表すこれを意味します。ただし、これらの病変は、ミンク肺上皮細胞 (Mv1Lu) または自然不死化ひと表皮細胞 (HaCaT) セルなど、いくつかの上皮細胞ラインの生得的な渡り鳥の特性を利用して、顕微鏡のスケールで学ぶことができます。ライン。
ここでは創傷治癒の3,4,7,8のコンテキストにおける上皮細胞の移行に関する定量的データを取得する適切な顕微鏡法について述べる。また、移行上皮膜で発生した質的分子および形態学的変化を研究に役立つその他の方法を提案する.全体的にみて、これらのメソッドは、創傷治癒過程におけるダイナミクスと上皮細胞の挙動と治療への応答に関与の形態的変化を研究するためのフレームワークを提供します。
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Protocol
1. 人工傷スクラッチ アッセイ定量的研究
- セル膜の準備
- 無菌状態の下で働いて、シードし、血清添加培地を用いた培養フラスコに Mv1Lu または HaCaT 上皮細胞を成長します。一度、すべての 24-48 h 媒体を更新します。電池が 80% の合流点に達する後、適切な方法、すなわちtrypsinization9を使用してセルをデタッチします。
注: Mv1Lu と実装された EMEM と DEMEM の培養液を使用して上皮細胞株を培養している HaCaT それぞれ 2 mM L-グルタミンを添加したし、5% CO2の制御された雰囲気と 37 ° C で培養しました。すべての細胞株は細胞濃度と完全 confluency に達するに必要なタイミングを決定する徹底的に試金する必要があります。通常 Mv1Lu または HaCaT 細胞の x 10 の4または 104細胞/ウェル、x 4-6 2 4 それぞれがシード 175 cm2培養用フラスコのと最大 35 x 106 Mv1Lu または 1 × 107 HaCaT 細胞 80% で合流点が得られます。 - どちらかの 12、または 24 ウェル培養プレートの各ウェルの細胞の 2 mL の種子します。すべて 24-48 h. 確認セル番号が 2 または 3 日後 100% の合流点に到達するために十分に高い媒体を更新します。
- 細胞に達すると合流、血清添加培地を取り除き、新鮮な無血清培地で 2 回洗います。スクラッチ前に 24 h の無血清培地で細胞を保ちます。
注: Mv1Lu または HaCaT 細胞に特殊な基板の要件はありません。ただし、セルライン無血清条件下で自発的にデタッチに影響を受けやすいためポリ L リジン溶液を用いた培養プレート面の塗装の前処理する必要があります10と見なされます。
- 無菌状態の下で働いて、シードし、血清添加培地を用いた培養フラスコに Mv1Lu または HaCaT 上皮細胞を成長します。一度、すべての 24-48 h 媒体を更新します。電池が 80% の合流点に達する後、適切な方法、すなわちtrypsinization9を使用してセルをデタッチします。
- 単分子膜傷
- しっかりと 20 μ L またはスクラッチの幅に応じて、200 μ L 滅菌ピペット先端の狭い端をドラッグして文化単層をスクラッチ無菌環境で作業します。先端のギャップの均質性を最大化する文化面に垂直を維持します。
- 明らかに単層細胞を監視する暗い表面上培養皿に置きます。必要な場合は、各ウェル 4 移行の領域まで勉強するの (十字型) 2 つの垂直の傷を実行します。
- 軽く培と優しく追加新鮮な無血清培地を削除して剥離細胞を洗ってください。2 回繰り返す最も接続されていないセルを削除するまで、または。
- しっかりと 20 μ L またはスクラッチの幅に応じて、200 μ L 滅菌ピペット先端の狭い端をドラッグして文化単層をスクラッチ無菌環境で作業します。先端のギャップの均質性を最大化する文化面に垂直を維持します。
- 実験の手順とデータ収集
- まあ CCD カメラを組み込んだ倒立位相差顕微鏡を使用して各からスクラッチのギャップを中心とした最大 4 前処理参照画像を取る。傷の隣接する交差点に顕微鏡フィールドの端を合わせて、関心領域を選択します。
注: 通常、画像を用いている 10 倍の倍率、1,280 x 1,024 ピクセルのイメージ サイズ。前述のローカライズを容易およびウェルあたり最大 4 測定法の検証のために役立ちますようの関心領域を選択します。 - 一度すべての画像を取得、指定治療井戸;選択した治療法を含む新鮮な培地で井戸に培地を交換します。
注: また、化学物質や培養液の均質性を邪魔しないで化合物は、治療できます再接種される培養液に直接。 - 観測範囲 90% スクラッチ ギャップ閉鎖条件まで傷プレート (5% CO2を含む制御された雰囲気の 37 ° C) を孵化させなさい。完全な閉鎖を避けるため。
注: 合計ギャップ閉鎖の後処理の画像コレクションを無効リファレンス領域が検出されないし、ギャップの閉鎖のために参照を確立できません。Mv1Lu または HaCaT 細胞の場合 16-19 h は 90% の合流点に到達する必要があります。 - したセルを固定することによって細胞遊走を停止します。優しく実験の培養液を 1 mL の PBS で 4% ホルマリンに置き換えます。室温 15 分間インキュベートします。
- 過剰なホルマリンは; を削除するセルを洗浄して軽く新鮮な PBS の井戸にソリューションを取り付けます。2 回以上を繰り返します。
注: この段階で封止後プレートが 4 ° C で不明確に保存されます。 - 傷後キャプチャ元の参照領域から各ウェルの治療後の参照画像を取る。同じ機器 (倒立光学位相差顕微鏡 CCD カメラを組み込んだ) と一致する画像の設定 (倍率とデジタル解像度/密度) を使用します。
注: 個々 のセル移行速度の計算ができる可能性があります時間コース画像を個別に移行し、フロントがコヒーレント (例えば、MDA MB 231 乳房癌細胞) の形成とは無関係のギャップを埋める細胞としていること。
- まあ CCD カメラを組み込んだ倒立位相差顕微鏡を使用して各からスクラッチのギャップを中心とした最大 4 前処理参照画像を取る。傷の隣接する交差点に顕微鏡フィールドの端を合わせて、関心領域を選択します。
- 移行の画像解析と定量
- 画像処理ソフトウェア (例えばImageJ) を使用すると、スクラッチ ギャップ制限を定義し、治療前の写真で 4 つまでの測定のための gap 表面を決定します。「表面前処理ギャップ」としてデータを記録 (PREGAP)。治療後の写真は、同じ手順を繰り返します。「治療後ギャップの表面」としてデータを記録 (POSTGAP).
- ImageJ を使用して記録された画像を開きます。「画像」メニューで画像の種類を 8 ビットに設定します。「プロセス」メニューで「フィルター」サブメニューに移動し、、"変動"のフィルターを適用。
- 「画像」メニューで"調整"サブメニュー黒と白に設定されたしきい値を入力してください (B & W)、「暗い背景」が選択されていないことを確認します。「プロセス」メニューの"バイナリ"サブメニューに移動し、「穴を埋める」を選択します。
- 「分析」メニュー「測定を設定」を選択、「エリア」アクティブに。測定領域次のギャップを区切る移行のエッジの輪郭を描画します。
- 「分析」メニューの「粒子の分析」を選択し、描画エリア表面の「合計領域」の値を記録します。
- ギャップ表面測定の差として個々 のサンプルのセットごとに絶対移行を定量化するスプレッドシートの PREGAP、POSTGAP の総面積値を紹介: プリギャップ − POSTGAP [任意単位]。さらに、各コントロールのサンプル条件の絶対移行データを正規化: (サンプル ・制御) * 100 [%]。
注: セルを個別に移行し、フロントがコヒーレント (例えば、MDA MB 231 乳房癌細胞) の形成とは無関係のギャップを埋める、絶対移行により計算できる中央に侵入セルをカウントのいずれかのストリップコントロールまたは扱われたサンプル。 - (図 1参照) 数量出力をプロットします。必要であれば、統計分析を実行します。
- 画像処理ソフトウェア (例えばImageJ) を使用すると、スクラッチ ギャップ制限を定義し、治療前の写真で 4 つまでの測定のための gap 表面を決定します。「表面前処理ギャップ」としてデータを記録 (PREGAP)。治療後の写真は、同じ手順を繰り返します。「治療後ギャップの表面」としてデータを記録 (POSTGAP).
2. 人工移行フロント アッセイ地形の研究
- セル膜の準備
- 無菌状態での作業は、プレートの表面が完全に覆われるまで空培養皿に滅菌ラウンド coverslips の 1 つのレイヤーを配置します。
注: 12 と 33 coverslips までに収まる 5 cm と 10 cm 径プレート、それぞれ。 - 培養プレートに 2 〜 3 日後 100% 合流ができる濃度で細胞の十分な量を優しくシードします。Coverslips が滅菌ピペット先端で穏やかな圧力を適用することによって浮遊するを防ぐし、coverslip が隣接 coverslips 重なっていないかどうかを確認します。媒体ごとの 24-48 時間を更新します。
注: すべてのセルの行を徹底的にで検定して細胞濃度と完全 confluency に達するに必要なタイミングを決定する必要があります。通常 Mv1Lu または HaCaT 細胞の 2-3 x 10 の6または 10 の6セル/10 cm 径プレート x 2.5-4、それぞれシードされます。小さめの皿で細胞数をスケール ダウンする必要があります。 - 細胞に達すると合流、血清添加培地を取り除きし、新鮮な無血清培地に置き換えます。人工傷を実行する前に、24 h の無血清培地で細胞を維持します。
注: Mv1Lu または HaCaT 細胞に特殊な基板の要件はありません。ただし、細胞無血清条件下で自発的にデタッチの影響を受けやすいのポリ L リジン溶液を用いた培養面の塗装の前処理する必要があります10と見なされます。
- 無菌状態での作業は、プレートの表面が完全に覆われるまで空培養皿に滅菌ラウンド coverslips の 1 つのレイヤーを配置します。
- 単分子膜を傷つける
- 滅菌ピンセットを使用して、優しく新鮮な無血清培地を含むクリーン 10 cm プレートに観察を移動します。ピンセットで周囲に、coverslip を保持することによって、単分子膜の損傷を防ぐ。Coverslip 破損の恐れのある過度の圧力を避けます。
- 人工傷を作成するには、coverslips の中央に横ラインの殺菌かみそりの刃をドラッグします。中央の単分子膜のストリップを完全に削除するために戻って来たり、3-4 mm をドラッグします。細胞の残骸残って負傷のエッジに接続されていないことを確認します。
注: 12 mm 径の coverslip、ラウンド、切開で、半ば、カバーガラスの。以下の手順でカバーガラスの傾斜を避けるために (少なくとも 2 mm 幅) 十分に大きい主な正面の反対側セルの連勝を残してください。 - きれいな 6 ウェル プレート含む少なくとも 2 mL 新鮮な無血清培地に、上向きのセルと負傷者 coverslips を転送します。最大 4 負傷 coverslips/よくに合います。
- 水洗いして 2 回使用新鮮な無血清培地戸建のセルを削除します。
- 実験方法及びサンプリング
- 優しく選択した治療法を含む新鮮な培地で井戸に培地を交換します。
注: また、化学物質や培養液の均質性を邪魔しないで化合物は、治療できます再接種される培養液に直接。任意の潜在的な細胞の剥離を避けるために慎重に進みます。 - 目的の実験的タイミング (37 ° C、5% CO2) セル インキュベーター内のプレートを保ちます。
- したセルを固定することによって細胞遊走を停止します。優しく実験の培養液を 1 mL の PBS で 4% ホルマリンに置き換えます。室温 15 分間インキュベートします。
注: コース実験の時間のため培養プレートからサンプルを削除、その他、継続的な実験条件に影響を及ぼすホルマリン煙を避けるために別皿でそれらを修正します。 - 過剰なホルマリンは; を削除するセルを洗浄して軽く新鮮な PBS の井戸にソリューションを取り付けます。2 回以上を繰り返します。
注: この段階で封止後プレートが 4 ° C で不明確に保存されます。
- 優しく選択した治療法を含む新鮮な培地で井戸に培地を交換します。
- 蛍光抗体法 (IF) とトポロジー解析
- IF の染色を行いとして個々 coverslips にイメージングは別記3,4,11。
- Coverslips PBS で 0.3% トリトン X-100 溶液を浸すことによって 10 分間 permeabilize します。
- 次のブロックのソリューションを使用して 30 分間ブロック: 0.3% ウシ血清アルブミン。10% 牛胎児血清;5% のスキムミルク。PBS で 0.3% トリトン X-100 溶液。
注: ミルクなし解決を妨げること事前に準備ができ-20 ° C で保存 - 牛乳無料ブロッキング液で希釈した一次抗体と湿ったチャンバ内の室温で 1 時間インキュベートします。Coverslips に逆さまの状態で適切な配分を確保するため 15 μ L 抗体溶液を配置します。
注: 抗体作業希釈は、変数は、使用している抗体に依存します。たとえば、ウサギ抗 c 6 抗体は 1/100 希釈を必要とします。 - PBS での 0.1% トリトン X-100 溶液で coverslips を浸すことによって 3 回を洗浄します。
- 30 分間無料のミルク ブロック バッファーで希釈した二次抗体に coverslips を孵化させなさい。
注: 抗体作業希釈は、変数は、使用している抗体に依存します。たとえば、ヤギ抗うさぎ (488) は、最適な解像度の 1/400 希釈を必要とします。ヘキスト 33258 ファロイジンなど他の標識化合物は、この段階でインキュベーション バッファーに追加できます。 - PBS で 0.1% トリトン X-100 溶液 coverslips を浸すことによって 3 回を洗浄します。
- Coverslips 逆さまの状態で 10 μ L マウント メディア ドロップ (例えばVectashield) 顕微鏡スライド上に配置をマウントします。取付中硬化一晩室温で暗闇の中でスライドを残します。その後、無期限に暗闇の中で 4 ° C で保存します。
- 落射蛍光または移行の前面の端で発生した構造変化の共焦点顕微鏡画像のいずれかを取得します。
注: トポロジー研究は、内側の膜に移行する前から写真を並べて実行できます。半定量的な研究がローカル蛍光強度に基づくソフトウェア分析によって可能です。
- IF の染色を行いとして個々 coverslips にイメージングは別記3,4,11。
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Representative Results
定量的研究のため人工傷スクラッチ試金: 移行上皮成長因子 (EGF) 推進を評価します。
EGF は、上皮細胞の増殖と移行、およびこうして移行推進を定量化するための肯定的な制御のよく知られている誘導です。Mv1Lu と HaCaT 細胞膜が傷傷試金で使用された、治療前の写真が得られました。10 ng/ml の EGF, 接種後のセルは固定と治療後の写真の前に 19 時間培養。増殖は、血清飢餓条件を維持することによって最小に保たれました。ImageJ を用いた画像の前処理および後処理のセット分析し、中央ギャップ領域を調べた。重複しているためにも、各 4 つのサイズを登録するのに実験を実行します。表面の差として算出した絶対移行の定量化: (プリギャップ − POSTGAP)。刺激 HaCaT 細胞 (図 1 b) と比較して刺激 Mv1Lu 細胞 (図 1 a) に大きな渡り鳥可能性があった。違いはセル源によって説明されて粘膜上皮細胞、ケラチノ サイト、それぞれの皮膚します。
地形の研究人工移行フロント試金: 細胞骨格構造と C 6 月の空間表現のバリエーション。
細胞の移動は、セルの変位を維持するために細胞骨格構造の継続的かつ深い変化を伴います。HaCaT 細胞膜は、コントロールおよび刺激条件下における移行フロント試金で使用されました。EGF と治療を促進する場合によって観察される、レーザ走査顕微鏡 (LSM; 細胞骨格の動態図 2 a)。EGF トリートメントは、堅牢な Mitogen-Activated 蛋白質 (地図) キナーゼ シグナル伝達と C-JUN の発現にもなります。空間パターンの構成 LSM の画像を並べて表示できます。移行する前に隣接するセルで 6 月の c の発現の増加することができます簡単にソフトウェア イメージ分析によって明らかにされます。ここでは、c 6 月ラベル (図 2 b) に対応する緑のチャンネルにレインボー スケールを実施しました。
図 1。Mv1Lu および HaCaT 細胞における EGF による移行の推進です。Mv1Lu の負傷した領域の位相差顕微鏡像 (A) と (B) 細胞の制御条件の下で撮影されたし、10 ng/mL で EGF 19 h の無血清条件下で細胞の画像と比較して。代表的な顕微鏡は、スクラッチのギャップと 20 μ L マイクロ ピペット チップと負傷後に得られる閉鎖の範囲を示します。倍率 = 10 x;スケールバー = 100 μ m ですセル移行は定量化され、治療とコントロールのサンプルそれぞれの試金 (任意の単位; のための地域違いのバリエーションとして表されます。AU)。プロットは、条件ごとに 8 つの独立した測定の代表です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。アクチン フィラメントと移行する細胞に EGF によって促進される c 6 月式変更します。(A) 一晩 10 ng/mL EGF 治療移行 HaCaT 細胞内アクチン フィラメント構造の深遠な変更を促進します。細胞制御条件の移行前にしっかりと構造化されたアクチン フィラメントの細胞骨格を描く、EGF で細胞治療移行前で貧しいアクチン フィラメントの構造を示します。倍率 = 63 x;スケール バー = 20 μ m. F アクチンは色分けされた赤、ヘキストは青色で表されます。(B) タイル組成が空間的発現パターンを明らかにする免疫蛍光を移行細胞に 10 ng/mL EGF 治療後 c 6 月表現を勉強する LSM イメージングとの組み合わせで使用する場合。C 6 月蛍光 (緑) の画像は擬似カラー c 6 月染色の強さを示すために変えられました。カラー レインボー スケールは、c - ジュン、EGF とコントロールの右側のパネルにカラーマップに対応する蛍光強度を表します。ファロイジン (赤) とヘキスト 33258 (ブルー) 染色は細胞の構造と核をそれぞれ表示する使用されました。共焦点顕微鏡画像が撮影されました。6 月 c 核移行前に近づいている地区の増加の表現のレベルに注意してください。スケール バー = 40 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
皮膚または粘膜の破壊、線維芽細胞、上皮や免疫細胞など、様々 な細胞タイプの行動によってバリア機能が復元されます。相まって、これらの細胞を受ける複雑なアポトーシス、増殖、分化、重要なは、線維芽細胞を含むプロセスと上皮細胞の移行、混乱の組織の修復のための責任の究極のメカニズムであると表在性上皮ギャップ1,12細胞遊走を勉強したがっての閉鎖も傷の治療の調節の可能性を決定する際に上皮細胞の生理学的な現象を正確に記述することができます。癒し。
生理的条件2の近くでこの複雑なプロセスのレプリケーションおよびこうしていくつかの病理学の条件の評価や医薬品の効果の研究の動物モデルに人工傷を実行できるように治療13。しかし、このアプローチは多くの場合遅延ファッション13のデータを生成する可能性が負担の実験プロシージャと同様に、高価で複雑な物流の結果します。それどころか、体外培養は、創傷治癒過程で細胞の挙動を調査するためより便利なフレームワークを提供します。上皮細胞の初代培養では、実行可能な選択肢が構成する間を取得し、データ収集を複雑にすることができます細胞を処理することは困難ことです。例えば、初代培養の典型的な低通過制限に加えて、プライマリ ヒト角は線維芽細胞成長体外3層を供給を必要があります。Mv1Lu や HaCaT のような確立された上皮細胞培養は並ぶ初代培養細胞3,4のそれらのような特性、機能動作の障害自由な研究モデルを構成するどころか、 14,15。正確には、創傷治癒に関する研究のこれらの 2 つの細胞株は移行して合流16,17時に細胞間連絡阻害による増殖を停止する能力の重要な特性を保持します。
スクラッチ アッセイは、異なる種類の細胞、特に上皮やがん細胞の渡り鳥の機能を定量化するための信頼性と汎用性の高い方法です。癌細胞の場合、浸潤能の評価のためスクラッチ法が提案されています。ただし、このアプローチは、細胞外マトリックス18,19を貫通に必要な分解酵素の発現に依存するより具体的な方法と比較して侵襲性の指標としては足りない。逆に、スクラッチの試金は上皮細胞の渡り鳥のパフォーマンスとこの特性のさまざまな治療法の効果を評価するための信頼できます。癌細胞ラインと対照をなして頻繁凝集度の不足、その他上皮細胞線しっかりと関連付けられたフォーム「成長島」、両方によってプロセスでそのマージンを拡大、HaCaT、Mv1Lu いくつかの層に成長する能力を表示します。増殖、しかし、もっと重要なことに細胞の移動。したがって、スパースまたはサブ コンフルエントの細胞密度条件使用されている渡り鳥生理学; さまざまな治療法の効果の研究特にその後の分子生物学の技術を適用すると、このセルとして環境が最小化接触阻害細胞積極的に移行の割合を最大化しながら。ただし、上皮細胞の非合流条件はエピジェネティック制御の形で、例えば、重要な既存の接触阻害影響を除くのリスクをもたらします。したがって、創傷治癒を勉強する合流条件はモデルの忠実度の増加を与えます。
正確な見積もりを得るためには、上皮細胞層の構造に影響を与えるまたは移行に貢献して併用の要因を対処すべき。合流が望まれる中、これらの条件に悪影響を与える可能性がありますので、過剰な細胞密度や多層文化を避けるために重要です。したがって、増殖が一般的または制御されて血清自由な媒体の飢餓による不可逆的 DNA 架橋3,20,細胞の増殖を阻止するマイトマイシン C のような化学物質の添加による21. どちらか一方の使用が特定のセル行の動作に依存します。マイトマイシン C は血清添加が大規模な細胞の剥離を避けるために必要が減少したときに特に示されます。HEK 293 t 細胞の場合、事前ポリ L リジンを使用して文化面にコーティング Mytomycin C 治療を避けるために良いオプションです。移行を変えることができる炎症性因子のリリースも対処する必要があります。主にスクラッチ アッセイ22達成上皮表面の中断を模倣するシリコン挿入に基づいて、異なる戦略が使用されています。挿入は、シリコン部分を削除した後のセルの移行を許可する既存のギャップを生成する、スクラッチ法いくつかのギャップを生成する上皮膜の除去に直接依存しています。好みのギャップを生成する方法についても可能性があります損傷した細胞から要因の放出を最小限に抑えながら、傷の間に損傷から文化表面コーティング (すなわち、培養プレートやポリ L リジン) を保護するために挿入の能力に依存します。細胞文化行動23を危険にさらします。これらの特性は、すなわち、移行する癌細胞の能力を評価するいくつかの実験的設定の役に立つかもしれないが我々 の経験でわかった重大な欠点創傷治癒の研究で挿入を使用するため。Mv1Lu 細胞はシリコンの挿入外表面には、意図せずシリコン部分の除去時に細胞膜の断裂の結果にアタッチできます。また、細胞は、シリコーンには接続しないでください、挿入によるギャップに移行するこれらの細胞の能力が低下した我々 発見します。程度、炎症と移行は、密接に関連付けられての反応と HaCaT 細胞における創傷治癒のコンテキストに一緒に重要でこれらが表示されます。また、HaCaT 細胞の場合、ギャップを再作成する細胞の能力上に培養面の傷のためプラスチックのヒントを適用することがある明白な結果ないのでそのような行動を示唆しているギャップの細胞外マトリックスの残党が移行をガイドがあります。自然傷の真皮と同様のファッション。ただし、変動の主な情報源はまま傷を作るプラスチックの先端の使用が常に同じサイズのギャップをレンダリングされませんスクラッチ プロシージャ自体です。我々 は圧力の矛盾とスクラッチの時に先端の位置のための異なるサンプルの間で 20% までの変化を観察しました。これらのバリエーションはより剛体と単分子膜を負傷で対処できます。ただし、プラスチックの表面にキズ、細胞の自由な移動を危険にさらすでしょう。だから、初期の最初の変化する必要があります考慮する移行を計算するには通常、条件ごとの測定数増。
細胞遊走の分子プロセスを評価するには定量化、に加えて古典的な場合のテクニックと共に負傷の手順を適用する質的。Coverslips に成長する上皮細胞の機能はよく知っています。過去には、スクラッチのバリエーション続いて修正、傷傷実験セットアップ24内比較染色さまざまな条件にさらされる coverslips に移行する関与して細胞の試金します。ここでは、実験時間コース3,4,7を拡張するためできる coverslips に成長して単分子膜における広いギャップを作成することがわかった。さらに、これらの実験が増加可能性があります、正確な細胞および細胞内メカニズムを研究するプロシージャの検出機能、およびこの手法に適した抗体性による制限だけで、興味のセル。Coverslips 場合用のサンプルは、拡張保護を可能にする顕微鏡のスライド マウントされます。「タイリング」方法紹介されてここと他3,47のような長い研究期間必要とする実験のセットアップのアプリケーションに役立ちます。ソフトウェア分析ツールの実装は、ローカル蛍光値による半定量的な評価を提供する「タイル」戦略は、時系列データの移行に関与するメカニズムを再構築するための空間パターンを統合し中、強度、得られる情報の質のさらなる充実。我々 の経験でタイルはまたこのタイプの試金蛋白質の発現のセル位置情報の研究の可能性を提供しています。この位置情報は、理解し、上皮細胞の位置は、渡り鳥の行動3 を決定する非常に重要なセットアップを中心に、細胞の移動における異なる剤の効果をより良い翻訳を重要であると示されています。 ,4,14,15。
説明した両方の手順は、品質データの生産と同様、単純な実装では、大きな利便性を示します。したがって、顕微鏡を用いた研究に基づいていますこれらのアプローチは、ダイナミクスと上皮細胞の動作に関与する形態的変化の両方を研究するユニークでパワフルなフレームワークを提供し、中に治療への応答は創傷治癒します。
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Disclosures
著者は、利害の対立がないことを宣言します。
Acknowledgments
改善し、実際の状態にこれらのテクニックを絞り込むに役立つ演習の古いメンバーに感謝したい: 博士シーリア ・ マルティネス-モーラ;博士アンナ Mrowiec、博士カタリナ ルイス自慢、博士アントニア ・ アルカラス ガルシア。これらの技術の開発を強く支援病院臨床ウニベルシタリオ ビルゲン デ ラ Arrixaca にお世話になっております。セルバンテス ・ デ ・またサラッド カルロス 3 世、フォンド ・ デ ・研究 Sanitarias。Estatal を計画私 + D + 私とセルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III Subdirección 一般 06 y 開発デ ラ危惧 (許可番号: PI13/00794);www.isciii.es. Fondos ・ フェダー「Una manera デ hacer エウロパ」。我々 も行政も支援をグァテマラ ・ デ ・ ムルシア、IMIB Arrixaca、外国金融機関に感謝します。最後に、我々 は博士イサベル ・ マルチネス-Argudo と Facultad デ芸術報 Ambientales y Bioquímica、キャンパス ′ デ ラ Fábrica デ アルマス、グァテマラ カスティーリャ ・ ラ ・ マンチャ州、トレド喜んで譲ることで彼らの親切なサポートのおかげでスペシャルを与えたい、バイオ医薬品と本稿の撮影の一部を実現するためのバイオ テクノロジー研究室。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
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