Summary
Dit manuscript beschrijft hoe incisie-achtige letsels gemaakt op gekweekte epitheliale cel monolayers gunstig model wond genezing in vitro, waardoor voor beeldvorming door confocal of laser scanning microscopie, en die kan voorzien van kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve en kwalitatieve gegevens voor het bestuderen van zowel cel gedrag en de mechanismen die betrokken zijn bij migratie.
Abstract
Cel migratie is een verplicht onderdeel voor wondgenezing. Creëren van kunstmatige wonden op onderzoek diermodellen resulteert vaak in dure en ingewikkelde experimentele procedures, terwijl potentieel ontbreekt in precisie. In vitro cultuur van epitheliale cellijnen biedt een geschikt platform voor het onderzoeken van het trekgedrag van de cel in de wondgenezing en het effect van de behandelingen op deze cellen. De Fysiologie van epitheliale cellen is vaak bestudeerd in niet-heuvels voorwaarden; Deze benadering kan echter niet lijken op natuurlijke wond genezing voorwaarden. Verstoren van de epitheel integriteit door mechanische middelen genereert een realistisch model, maar de toepassing van moleculaire technieken kan belemmeren. Bijgevolg gebaseerd microscopie technieken zijn optimaal voor de studie van epitheliale cel migratie in vitro. Hier detail wij twee specifieke methoden, de kunstmatige wond kras assay en de voorste assay van kunstmatige migratie, die van kwantitatieve en kwalitatieve gegevens, respectievelijk op de trekkende prestaties van epitheliale cellen verkrijgen kan.
Introduction
Cel migratie is vereist voor wondgenezing, want het is verantwoordelijk voor de definitieve sluiting van de epitheliale kloof en herstel van de verstoorde oppervlakte1. Uitvoeren van kunstmatige wonden in diermodellen zorgt voor de replicatie van dit complexe proces in in de buurt van fysiologische omstandigheden2. Deze benadering leidt echter vaak dure en ingewikkelde experimentele procedures, die mogelijk gebrek aan precisie voor de studie van de verschillende processen, het ingewikkelde karakter van de wondgenezing proces.
In vitro cultuur van epitheliale cellijnen biedt een nuttig alternatief voor dierlijke modellen voor het onderzoeken van de rol die deze cellen bij wondgenezing en de effecten van behandeling op cel trekgedrag spelen. De Fysiologie van epitheliale cellen wordt vaak bestudeerd door moleculaire technieken met behulp van niet-heuvels culturen3,4,5,6; echter, de verstoring van de integriteit van het epitheel wordt gewoonlijk bereikt door fijne mechanische insnijdingen. In de cultuur van de cel impliceert dit dat te verwaarlozen aantal cellen kan worden blootgesteld aan de wond kloof, en zij een te kleine steekproef voor moleculaire biologietechnieken vertegenwoordigen. Echter, deze letsels kunnen worden bestudeerd op de microscopische schaal, profiteren van de aangeboren trekkende eigenschappen van sommige epitheliale cellijnen, zoals de Mink Lung epitheliale cel (Mv1Lu) of de spontaan vereeuwigd menselijke Keratinocyt (HaCaT) lijnen.
We beschreven hier een methode voor microscopie die geschikt is voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de migratie van epitheliale cellen in het kader van de wond genezing van3,4,7,8. Bovendien presenteren we extra methoden die zijn nuttig om te studeren kwalitatief moleculaire en morfologische veranderingen op epitheliale monolayers tijdens de migratie. Over het geheel genomen is deze methoden bieden een kader om te studeren zowel de dynamiek en de morfologische veranderingen die betrokken zijn bij de epitheliale cellen gedrag en reactie op de behandelingen tijdens de wondgenezing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kunstmatige wond kras Assay voor kwantitatief onderzoek
- Cel enkelgelaagde voorbereiding
- Werken onder steriele condities, zaad en groeien van Mv1Lu of HaCaT epitheliale cellen in cultuur kolven via serum-aangevuld. Vernieuwen medium eenmaal elke 24-48 h. Nadat cellen 80% samenvloeiing bereiken, loskoppelen met behulp van een geschikte methode, d.w.z., trypsinebehandeling9cellen.
Opmerking: Mv1Lu HaCaT epitheliale cellijnen worden gekweekt met behulp van EMEM en DEMEM kweekmedium, respectievelijk, aangevuld met 2 mM L-Glutamine en geïncubeerd bij 37 ° C met een gecontroleerde atmosfeer van 5% CO2. Elke cel regel moet grondig worden bepaald om na te gaan van concentratie van de cel en timing vereist volledige confluentie bereiken. Typisch voor Mv1Lu of HaCaT cellen, 2-4 x 104 of 4-6 x 104 cellen/well, respectievelijk, zijn overgeënt in een maatkolf van 175 cm2 cultuur, en 80% samenvloeiing levert maximaal 35 x 106 Mv1Lu of 1 x 107 HaCaT cellen. - In een 12-well of 24-well cultuur-plaat, zaad in elk putje 2 mL van cellen. Vernieuwen medium zodra elke 24-48 h. Controleer cel nummers zijn hoog genoeg om het bereiken van de samenvloeiing van de 100% na 2 of 3 dagen.
- Nadat de cellen samenvloeiing bereiken, verwijdert u het medium serum-aangevuld en wassen tweemaal met verse serumvrij medium. Houd cellen in serumvrij medium voor 24u alvorens het krassen.
Opmerking: Mv1Lu of HaCaT cellen hebben geen speciale substraat eisen; echter voor cellijnen vatbaar voor spontaan losmaken in serumvrij voorwaarden, moet pre coating van de cultuur plaat oppervlakte met behulp van een poly-L-lysine oplossing worden beschouwd10.
- Werken onder steriele condities, zaad en groeien van Mv1Lu of HaCaT epitheliale cellen in cultuur kolven via serum-aangevuld. Vernieuwen medium eenmaal elke 24-48 h. Nadat cellen 80% samenvloeiing bereiken, loskoppelen met behulp van een geschikte methode, d.w.z., trypsinebehandeling9cellen.
- Enkelgelaagde krabben
- Werken in een steriele omgeving, krassen op de cultuur enkelgelaagde door stevig te slepen het smalle einde van een 20 µL of 200 µL steriele micropipet tip, afhankelijk van de gewenste breedte van kras. Houd de tip loodrecht op het oppervlak van de cultuur te maximaliseren van de homogeniteit van de kloof.
- Plaats de platen van de cultuur op een donker oppervlak duidelijk volgen de cel enkelgelaagde. Indien nodig, de twee loodrecht krassen (kruisvormig) op elk putje te bestuderen tot 4 migratie gebieden uitvoeren.
- Wassen vrijstaande cellen door cultuurmedium en zachtjes toe te voegen verse serumvrij medium voorzichtig te verwijderen. Herhaal dit twee keer, of totdat de meest niet-vastgemaakte cellen zijn verwijderd.
- Werken in een steriele omgeving, krassen op de cultuur enkelgelaagde door stevig te slepen het smalle einde van een 20 µL of 200 µL steriele micropipet tip, afhankelijk van de gewenste breedte van kras. Houd de tip loodrecht op het oppervlak van de cultuur te maximaliseren van de homogeniteit van de kloof.
- Experimentele procedure en gegevensverzameling
- Neem maximaal 4 voorbehandeling referentie afbeeldingen gecentreerd op de kras kloof van elk goed met een omgekeerde fase contrast Microscoop met een CCD-camera. Selecteer interesse gebieden door het uitlijnen van de rand van Microscoop veld op het aangrenzende snijpunt van krassen.
Opmerking: Doorgaans afbeeldingen zijn verworven met behulp van een 10 x vergroting en een 1280 x 1024 pixelgrootte van de afbeelding. Interesse gebieden zoals eerder beschreven helpt voor gemakkelijk lokalisatie en validatie van maximaal 4 metingen per putje te selecteren. - Zodra alle afbeeldingen zijn opgedaan, wijzen behandeling putten; het medium in de putjes met verse medium waarin geselecteerde behandelingen uit te wisselen.
Opmerking: Als alternatief voor chemische stoffen of verbindingen die niet kweekmedium homogeniteit storen, behandelingen kunnen worden geënt rechtstreeks in het kweekmedium. - Incubeer de gekraste plaat (37 ° C met een gecontroleerde atmosfeer met 5% CO2) tot de voorwaarden onder observatie reach 90% kras kloof sluiting. Vermijd volledige sluiting.
Opmerking: Totale kloof sluiting huwelijksleven nabehandeling fotoverzameling als referentiegebieden niet waarneembaar zijn en de referentieperiode voor kloof sluiten kan niet worden vastgesteld. In het geval van Mv1Lu of HaCaT cellen, zijn 16-19 h vereist voor het bereiken van de samenvloeiing van de 90%. - Cel migratie te stoppen door de vaststelling van de cellen; Vervang het experimentele kweekmedium zachtjes met 1 mL 4% formaline in PBS. Incubeer gedurende 15 minuten op RT.
- Wassen van de cellen om te verwijderen van de overtollige formaline; zachtjes vervangen de oplossing in de putjes met verse PBS. Minstens twee maal herhalen.
Opmerking: In dit stadium, na verzegeling, platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor onbepaalde tijd. - Neem nabehandeling referentie beelden van elk putje van de oorspronkelijke referentiegebieden captured na het krassen. Gebruik de dezelfde apparatuur (omgekeerde optische fase contrast Microscoop met een CCD-camera) en de overeenkomende beeldinstellingen (vergroting en digitale resolutie/dichtheid).
Opmerking: Voor cellen die individueel migreren en de leemte onafhankelijk van de vorming van een coherent front (b.v., MDA-MB-231 menselijke borstkankercellen), het tijdsverloop afbeeldingen kunnen toestaan dat de berekening van de individuele cel migratie snelheden.
- Neem maximaal 4 voorbehandeling referentie afbeeldingen gecentreerd op de kras kloof van elk goed met een omgekeerde fase contrast Microscoop met een CCD-camera. Selecteer interesse gebieden door het uitlijnen van de rand van Microscoop veld op het aangrenzende snijpunt van krassen.
- Beeldanalyse en kwantificering van migratie
- Met behulp van beeld processing software (bijvoorbeeldImageJ), kras kloof grenzen definiëren en bepalen van het oppervlak van de kloof voor maximaal vier metingen in voorbehandeling beelden. Opnemen van de gegevens als "voorbehandeling kloof oppervlak" (als). Herhaal dezelfde procedure voor nabehandeling foto's. Opnemen van de gegevens als "nabehandeling kloof oppervlak" (POSTGAP).
- Open het opgenomen beeld met behulp van ImageJ. Stel in het menu "beeld" afbeeldingstype op 8 bit. In het "proces"-menu, ga naar "filters" submenu en toepassing "variance" filteren.
- Voer in het menu "beeld" "aanpassen" submenu en ingestelde drempel naar zwart-wit (B & W), Controleer of "Donkere achtergrond" niet is geselecteerd. In het "proces"-menu, ga naar "binaire" submenu en selecteer "Vul gaten".
- In het menu "analyseren", selecteer "set metingen" en Activeer "ruimte". Vervolgens tekent u de meetbare ruimte na de migratie rand contour dus het afbakenen van de kloof.
- In het menu "analyseren", selecteer "analyseren deeltjes" en "totale oppervlakte" waarden voor de oppervlakte van het getekende gebied opnemen.
- Voeren als en POSTGAP totale oppervlakte waarden in een werkblad te kwantificeren van absolute migratie voor elke set van afzonderlijke monsters als het verschil van kloof oppervlak metingen: als − POSTGAP [willekeurige eenheden]. Bovendien, normaliseren absolute migratiegegevens van elke voorwaarde aan controlemonsters: (proeven / CONTROL) * 100 [%].
Opmerking: Voor cellen die individueel migreren en de leemte onafhankelijk van de vorming van een coherent front (b.v., MDA-MB-231 menselijke borstkankercellen), de absolute migratie kan worden berekend door het tellen van cellen die een centrale invasie in strip het besturingselement of de behandelde monsters. - Plot kwantificering uitgangen (Zie Figuur 1). Statistische analyse uitvoeren indien nodig.
- Met behulp van beeld processing software (bijvoorbeeldImageJ), kras kloof grenzen definiëren en bepalen van het oppervlak van de kloof voor maximaal vier metingen in voorbehandeling beelden. Opnemen van de gegevens als "voorbehandeling kloof oppervlak" (als). Herhaal dezelfde procedure voor nabehandeling foto's. Opnemen van de gegevens als "nabehandeling kloof oppervlak" (POSTGAP).
2. kunstmatige migratie Front Assay voor topografische onderzoeken
- Cel enkelgelaagde voorbereiding
- Werken onder steriele omstandigheden plaats één laag van gesteriliseerde ronde coverslips in lege cultuur platen tot de plaat het oppervlak volledig bedekt is.
Opmerking: Maximaal 12 en 33 coverslips passen op 5 cm en 10 cm diameter platen, respectievelijk. - Op de plaat van de cultuur, zaad voorzichtig een voldoende volume van cellen bij een concentratie waarmee 100% samenvloeiing na 2 of 3 dagen. Zorg ervoor dat geen dekglaasje aan overlapt naburige coverslips en verhinderen dat coverslips zweven door zachte druk met een steriel micropipet tip toe te passen. Vernieuw het medium elke 24-48 h.
Opmerking: Elke cel regel moet grondig vehiculumcontrolegroep worden om na te gaan van concentratie van de cel en timing vereist volledige confluentie bereiken. Typisch voor Mv1Lu of HaCaT cellen, zijn 2-3 x 106 of 2.5-4 x 106 cellen/10 cm-diameter plaat, respectievelijk, overgeënt. Voor kleinere platen, moet cel nummers worden teruggeschroefd. - Nadat de cellen samenvloeiing bereiken, verwijdert u het medium serum-aangevuld en vervangen door verse serumvrij medium. Houd de cellen in serumvrij medium voor 24 uur voordat de kunstmatige wond wordt uitgevoerd.
Opmerking: Mv1Lu of HaCaT cellen hebben geen speciale substraat eisen; echter voor cellijnen vatbaar voor spontaan losmaken in serumvrij voorwaarden, moet pre coating van het oppervlak van de cultuur met behulp van een poly-L-lysine oplossing worden beschouwd10.
- Werken onder steriele omstandigheden plaats één laag van gesteriliseerde ronde coverslips in lege cultuur platen tot de plaat het oppervlak volledig bedekt is.
- Enkelgelaagde verwonden
- Zachtjes een dekglaasje aan naar een schone 10 cm plaat met verse serumvrij medium met steriel pincet, verplaatsen. Te voorkomen beschadiging van de enkelgelaagde door het dekglaasje aan op de periferie met een pincet. Vermijd overmatige druk die zou kunnen leiden een dekglaasje aan breuk tot.
- Het maken van kunstmatige wonden door een gesteriliseerde scheermesje in een dwarse lijn over het midden van het coverslips te slepen. 3-4 mm heen-en-weer, sleep om de centrale enkelgelaagde strip volledig te verwijderen. Zorg ervoor dat geen cel puin blijft verbonden aan de gewonde randen.
Opmerking: op een diameter van 12 mm ronde dekglaasje aan, de incisie wordt gemaakt op het midden van het dekglaasje aan. Zorg ervoor om te vertrekken een streak van cellen tegenover het hoofdfront groot genoeg is (ten minste 2 mm breed) om te voorkomen dat het kantelen van het dekglaasje aan in de volgende stappen. - Gewonde coverslips Pipetteer met behulp van cellen naar boven, naar een schone 6-well plaat met ten minste 2 mL verse serumvrij medium. Maximaal 4 gewonde coverslips/goed passen.
- Voorzichtig wassen twee keer met verse serumvrij middellange tot vrijstaande cellen verwijderen.
- Experimentele procedure en bemonstering
- Zachtjes het medium in de putjes met verse medium waarin geselecteerde behandelingen uit te wisselen.
Opmerking: Als alternatief voor chemische stoffen of verbindingen die niet kweekmedium homogeniteit storen, behandelingen kunnen worden geënt rechtstreeks in het kweekmedium. Behoedzaam om te voorkomen dat elke potentiële mobiele-detachement. - Houd de plaat binnen een cel incubator (37 ° C, 5% CO2) voor de gewenste experimentele timing.
- Cel migratie te stoppen door de vaststelling van de cellen; Vervang het experimentele kweekmedium zachtjes met 1 mL 4% formaline in PBS. Incubeer gedurende 15 minuten op RT.
Opmerking: Voor tijd cursus experimenten, de monsters uit de cultuur-plaat verwijderen en corrigeren in een afzonderlijke plaat om te voorkomen dat formaline dampen op het gebied van de andere, lopende experimentele omstandigheden. - Wassen van de cellen om te verwijderen van de overtollige formaline; zachtjes vervangen de oplossing in de putjes met verse PBS. Minstens twee maal herhalen.
Opmerking: In dit stadium, na verzegeling, platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor onbepaalde tijd.
- Zachtjes het medium in de putjes met verse medium waarin geselecteerde behandelingen uit te wisselen.
- Immunofluorescentie (IF) en topologische analyse
- Uitvoeren als kleuring en beeldvorming op individuele coverslips als elders beschreven3,4,11.
- Permeabilize voor 10 min door coverslips in een oplossing van de Triton X-100 0,3% in PBS onder te dompelen.
- Blok voor 30 min met behulp van de volgende blokkerende oplossing: 0,3% bovien serumalbumine; De foetale runderserum 10%; 5% afgeroomde melk; 0,3% Triton X-100 oplossing in PBS.
Opmerking: Het blokkeren van oplossing zonder melk kan worden voorbereid en opgeslagen bij-20 ° C. - Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer, met primair antilichaam verdund in melkvrije blokkerende oplossing. Plaats de coverslips ondersteboven in de 15 µL antilichaam oplossing om goede verdeling.
Opmerking: De werkverdunning antilichaam is variabel en hangt af van het antilichaam in gebruik. Bijvoorbeeld, vereist het antilichaam van de anti-c-Jun konijn een verdunning van 1/100. - Spoel driemaal door dompelen de coverslips in een in 0,1% Triton X-100 oplossing in PBS.
- Incubeer de coverslips in secundair antilichaam verdund in melkvrije blokkeerbuffer gedurende 30 minuten.
Opmerking: De werkverdunning antilichaam is variabel en hangt af van het antilichaam in gebruik. Bijvoorbeeld, vereist de geit-anti-konijn (488) een verdunning van 1/400 voor een optimale resolutie. Andere labeling reagentia zoals phalloidin en Hoechst 33258 kunnen worden toegevoegd aan de incubatie-buffer in dit stadium. - Spoel driemaal door dompelen de coverslips in 0,1% Triton X-100 oplossing in PBS.
- Monteer de coverslips upside-down in een 10 µL montage media drop (bvVectashield) geplaatst op een microscoopglaasje. Laat de dia's in het donker bij kamertemperatuur 's nachts voor de montage middellange verharding. Daarna, voor onbepaalde tijd bewaren bij 4 ° C in het donker.
- Het verkrijgen van epifluorescence of confocale microscopie beelden van structurele veranderingen die zich voordoen bij het migreren van de voorste rand.
Opmerking: Topologische onderzoek kunnen worden verricht door de foto's van de migreren voorzijde naar de innerlijke Enkelgelaagde tegels. Semi-kwantitatieve studies zijn mogelijk door analyse van de software gebaseerd op lokale fluorescentie intensiteiten.
- Uitvoeren als kleuring en beeldvorming op individuele coverslips als elders beschreven3,4,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kunstmatige wond kras Assay voor kwantitatieve Studies: epidermale groeifactor (EGF) bevordering van migratie beoordelen:
EFG is een bekende inductor van epitheliale cellen proliferatie en migratie, en dus een positieve controle voor het kwantificeren van de bevordering van de migratie. Mv1Lu en HaCaT cel monolayers werden gebruikt in de wond kras testen en voorbehandeling beelden werden verkregen. Na inoculatie met 10 ng/mL EGF, cellen werden ge¨ uncubeerd 19u voor fixatie en nabehandeling foto's. Proliferatie bleef tot een minimum te beperken door het handhaven van serum honger voorwaarden. Zowel vóór als na de behandeling sets van foto's werden geanalyseerd met behulp van ImageJ en de centrale kloof gebieden werden bepaald. Het experiment werd uitgevoerd in tweevoud, registreren van vier metingen voor elk putje. Kwantificering van de absolute migratie was berekend als het verschil van oppervlakken: (als − POSTGAP). Er was een groter potentieel van de migratiestromen in de gestimuleerd Mv1Lu cellen (figuur 1A) in vergelijking met de gestimuleerd HaCaT cellen (figuur 1B). De verschillen worden verklaard door de bronnen van de cel, wordt mucosa epitheliale cellen en keratinocyten, respectievelijk huid.
Kunstmatige migratie Front Assay voor topografische onderzoeken: variaties in Cytoskeletal bevleesdheid en ruimtelijke uitdrukking van C-Jun:
Cel migratie houdt continu en diepe veranderingen van de structuur van het cytoskelet te houden van de verplaatsing van de cel. HaCaT cel monolayers werden gebruikt in de voorste testen van migratie onder controle en stimulatie voorwaarden. Behandeling met EGF potentiates de cytoskeletal dynamiek, die worden waargenomen door IF en laser scanning microscopie (LSM; Figuur 2A). EGF behandeling ook resulteert in robuuste Mitogen-Activated eiwit (kaart) kinases signalering en c-JUN overexpressie. Plavuizen LSM beelden voorziet in de configuratie van ruimtelijke patronen. Verhoogde expressie van c-JUN op cellen grenzend aan het migreren front kan gemakkelijk worden onthuld door beeldanalyse van software; hier, wij een regenboog schaal voor het groene kanaal, die corresponderen met de c-JUN labeling (figuur 2B).
Figuur 1. Bevordering van migratie door EGF in cellen Mv1Lu en HaCaT. Fase contrast microscopie beelden van de gewonde gebied van Mv1Lu (A) en HaCaT (B) cellen werden genomen onder controlevoorwaarden en vergeleken met beelden van de cellen met 10 ng/mL EGF voor 19u in serumvrij voorwaarden behandeld. Representatieve microfoto tonen de omvang van kras kloof en sluiting verkregen na verwonding met een 20 µL micropipet tip. Vergroting = 10 x; Schaal bar = 100 µm. cel migratie was gekwantificeerd en vertegenwoordigde als variatie van het gebied verschillen tussen behandelingen en controlemonsters voor elke assay (willekeurige eenheden; AU). Het perceel is vertegenwoordiger van acht onafhankelijke metingen voor elke voorwaarde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Door samensmelting van filamenten actine en c-JUN expressie veranderingen EGF in migreren HaCaT cellen voorstaat. (A) Overnight 10 ng/mL EGF behandeling bevordert ingrijpende veranderingen in de gedaante van de actine-filamenten in migreren HaCaT cellen. Cellen aan de voorzijde van de migratie van controlevoorwaarden portretteren een strak gestructureerde actine-filamenten cytoskelet, terwijl cellen met EGF behandeld slechte actine filamenten structuur weergeven aan de voorzijde van de migratie. Vergroting = 63 x; Schaal bar = 20 µm. F-actine is kleurgecodeerde rood en Hoechst wordt vertegenwoordigd door een blauwe kleur. (B) wanneer immuno-fluorescentie wordt gebruikt in combinatie met LSM imaging te bestuderen van c-JUN expressie na 10 ng/mL EGF behandeling op migreren HaCaT cellen, betegeling composities onthullen ruimtelijke expressiepatronen. Beelden van c-Jun fluorescentie (groen) werden omgezet in pseudo-kleur zodat de intensiteit van kleuring van c-Jun. De kleurenschaal van de regenboog staat voor fluorescentie intensiteit voor c-Jun, overeenkomen met de colormaps op de juiste panelen voor EGF en controle. Mede kleuring met phalloidin (rood) en Hoechst-33258 (blauw) werd gebruikt voor het tonen van de celstructuur en kernen, respectievelijk. Beelden werden genomen door een confocal microscoop. Opmerking de toename van de expressie van nucleaire c-Jun in gebieden nadert de migreren voorkant. Schaal bar = 40 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Op de huid of slijmvlies verstoring, is barrièrefunctie hersteld door de acties van talrijke celtypen, met inbegrip van fibroblasten of epitheliale en immuun cellen. Gezamenlijk, deze cellen ondergaan een complex proces waarbij apoptosis, proliferatie, differentiatie en bovenal fibroblast en epitheliale cel migratie, die het ultieme mechanisme verantwoordelijk voor herstel van de verstoorde weefsel is en de sluiting van de oppervlakkige epitheliale kloof1,12 aldus, bestuderen van cel migratie helpt juist beschrijven de fysiologische werking van epitheliale cellen, terwijl ook het bepalen van de f potentieel van behandelingen voor wond genezing.
Uitvoeren van kunstmatige wonden op verschillende dierlijke onderzoeksmodellen zorgt voor de replicatie van dit complexe proces in in de buurt van fysiologische omstandigheden2, en dus de beoordeling van een aantal pathologische voorwaarden of de gevolgen van farmaceutische behandelingen13. Deze aanpak resulteert echter vaak in de dure en ingewikkelde logistiek, evenals belastende experimentele procedures die kunnen genereren van gegevens in een vertraagde mode-13. Integendeel, biedt in vitro cultuur van de cel een geschikter kader voor het onderzoeken van het gedrag van cellen die betrokken zijn in de wond genezingsproces. Terwijl de primaire celculturen van epitheliale cellen vormt een haalbare optie, kan het moeilijk te verkrijgen en verwerken van de cellen die gegevens verzamelen kunnen bemoeilijken. Bijvoorbeeld, naast de typische low-passage beperking van primaire culturen moeten primaire menselijke keratinocyten een fibroblast laag voor groei in vitro3voeding. Integendeel, vormen gevestigde epitheliale cultuur cellijnen, zoals Mv1Lu of HaCaT, een belemmering-vrije onderzoeksmodel dat gedrag van de functies en kenmerken zoals die in de cultuur van de primaire cellen3,4, 14,,15. Voor de studie van de wondgenezing, juist, behouden deze twee cellijnen kritieke eigenschappen in hun vermogen om te migreren en stoppen van proliferatie als gevolg van cel naar cel contact remming op samenvloeiing16,17.
Kras testen zijn een betrouwbare en veelzijdige methode voor de kwantificering van de trekkende mogelijkheden van verschillende celtypes, vooral epitheliale en kankercellen. Voor het geval van kankercellen, de kras methode voorgesteld voor beoordeling van invasieve potentieel. Echter, deze aanpak schiet tekort als indicator voor de invasiviteit in vergelijking met meer specifieke methoden, afhankelijk van de expressie van metalloproteinasen die nodig zijn voor het penetreren van de extracellulaire matrix18,19. Integendeel, zijn kras tests betrouwbaar voor de beoordeling van de trekkende prestaties van epitheliale cellen en het effect van verschillende behandelingen op deze eigenschap. In tegenstelling tot kanker cellen lijnen, waaruit blijkt vaak arme cohesie en de mogelijkheid om te groeien op verschillende lagen, Mv1Lu, HaCaT, en andere epitheliale cel lijnen vorm strak verbonden "groei eilanden", die hun marges in een proces afhankelijk van beide uitbreiden proliferatie, maar meer belangrijker op cel migratie. Bijgevolg, schaars of sub confluente cel dichtheid voorwaarden conventioneel worden gebruikt voor het bestuderen van de effecten van verschillende behandelingen op de trekkende fysiologie; vooral wanneer de daaropvolgende moleculaire biologietechnieken worden toegepast, als deze cel minimaliseert milieu contact remming terwijl het maximaliseren van de verhouding tussen actief migreren cellen. Niet-heuvels voorwaarden vormen voor epitheliale cellen, echter het risico uit te sluiten van belangrijke reeds bestaande contactpersoon remming invloeden, bijvoorbeeld in de vorm van Epigenetische regulatie. Zo verleent confluente voorwaarden studeren wondgenezing, verhoogde betrouwbaarheid van het model.
Voor het verkrijgen van nauwkeurige schattingen, moeten bijkomende factoren beïnvloeden de gedaante van de epitheliale cellaag of bij te dragen tot migratie worden aangepakt. Hoewel samenvloeiing gewenst is, is het belangrijk om te voorkomen dat buitensporige celdichtheid of meerdere lagen culturen, aangezien deze voorwaarden negatief kunnen beïnvloeden. Daarom proliferatie wordt meestal gecontroleerd door verhongering in serumvrij media of door toevoeging van chemicaliën zoals mitomycine C, die onherroepelijk celproliferatie door DNA crosslinking3,20, arresteren 21. het gebruik van een of het ander is afhankelijk van het gedrag van specifieke cellijnen; Mitomycine C vooral aangegeven wanneer verminderd serum suppletie is vereist om te voorkomen dat massale mobiele-detachement. Dat is het geval voor HEK-293T cellen, waar vooraf coating het oppervlak van de cultuur met behulp van poly-L-lysine is een goede optie om te voorkomen dat Mytomycin C behandeling. Ook moet de vrijlating van inflammatoire factoren die van migratie veranderen kan worden aangepakt. Verschillende strategieën zijn gebruikt, voornamelijk op basis van siliconen toevoegingen na te bootsen de verstoring van het epitheliale oppervlak met de kras assay22bereikt. Terwijl inzetstukken bestaande lacunes waarmee cel migratie genereren na het verwijderen van het stuk van de siliconen, berust de kras methode direct op het wegnemen van enkele van de epitheliale enkelgelaagde voor het genereren van de kloof. Voorkeur over het maken van de kloof is afhankelijk van het vermogen van inzetstukken ter bescherming van de oppervlaktelaag van cultuur (dat wil zeggen, cultuur plaat of poly-L-lysine) tegen schade tijdens het krabben, terwijl het ook het minimaliseren van de release van factoren uit beschadigde cellen die kunnen de cel cultuur gedrag23in gevaar te brengen. Hoewel deze kenmerken nuttig voor sommige experimentele instellingen, dat wil zeggen wellicht, evaluatie van het vermogen van kankercellen te migreren, in onze ervaring vonden we aanzienlijke nadelen voor het gebruik van inzetstukken in wond genezing studies. Mv1Lu cellen zijn geschikt voor het aansluiten van het silicone invoegen buitenoppervlak, waardoor onbedoeld scheuren van de cel enkelgelaagde na verwijdering van de siliconen stukken. Ook, hoewel HaCaT cellen niet aan siliconen hechten doen, vonden we een verminderde mogelijkheid voor deze cellen migreren naar invoegen gegenereerde lacunes. Die omvang, ontsteking en migratie zijn strak bijbehorende reacties, en deze verschijnen samen in het kader van de wondgenezing in HaCaT cellen kritisch te zijn. Bovendien, aangezien de toepassing van een plastic tip voor krassen op het oppervlak van de cultuur geen zichtbare gevolgen heeft op het vermogen van cellen aan repopulate de kloof, in het geval van HaCaT cellen, dergelijk gedrag suggereert dat extracellulaire matrix overblijfselen in de kloof kunnen laten leiden door migratie in een soortgelijke wijze als dermis in een natuurlijke wond.De belangrijkste bron van variatie blijft echter de krassen procedure zelf, zoals het gebruik van een plastic tip om de wond niet altijd weer de zelfde grootte kloof. We hebben waargenomen variaties tussen verschillende monsters, als gevolg van inconsistentie van druk en de positie van de tip op het moment van kras tot 20%. Deze variaties kunnen worden aangepakt door het verwonden van de enkelgelaagde met een meer rigide object; een kras op het plastic oppervlak zou echter in gevaar brengen het vrije verkeer van de cellen. Dus, variaties in de initiële kras rekening moeten worden gehouden voor het berekenen van migratie; meestal, door het verhogen van het aantal meting per voorwaarde.
Naast de kwantificering, kan verwonden procedures samen met klassieke als technieken toe te passen kwalitatief beoordelen de moleculaire processen van cel migratie. Het vermogen van epitheliale cellen om te groeien op coverslips is het bekende; in het verleden testen variaties van de kras betrokken cellen migreren op coverslips blootgesteld aan verschillende omstandigheden, gevolgd door de vaststelling en kleuring voor vergelijking binnen de wond-kras experimentele opzet24. Hier vonden we dat maken grote hiaten in monolayers groeien op coverslips mogelijk maakt voor het uitbreiden van de experimentele tijd cursussen3,4,7. Bovendien, in deze experimenten, als verhogingen de detectiemogelijkheden van de procedure mogelijk studie precieze cellulaire en subcellular mechanismen betrokken, en het alleen door de beschikbaarheid van antilichamen geschikt voor deze techniek beperkt wordt en de cellen van belang. Monsters op de coverslips gebruikt voor als zijn gemonteerd op Microscoop dia's, die het mogelijk voor uitgebreide behoud maken. Dit helpt de toepassing van experimentele opstellingen die lange studieperiodes, vereisen zoals de "tegels" benaderingen hier en elders3,4,7 demonstreerde. Terwijl de strategie van de "tegels" ruimtelijke patronen met temporele gegevens integreert voor de wederopbouw van de mechanismen die betrokken zijn bij migratie, kunnen de uitvoering van software-analysefuncties semi-kwantitatieve beoordeling op basis van lokale fluorescentie intensiteit, en de kwaliteit van de verkregen informatie verder te verrijken. In onze ervaring biedt betegeling ook de mogelijkheid van het bestuderen van de cel-positionele gegevens voor de expressie van eiwitten in dit type van test. Deze positionele gegevens is aangetoond dat doorslaggevend zijn voor het begrijpen en beter vertalen de effecten van verschillende agenten op cel migratie, met name in opstellingen waar de positie van de epitheliale cellen erg belangrijk is voor het bepalen van haar trekgedrag3 ,4,14,15.
Beide procedures beschreven tonen groot gemak door ongecompliceerde uitvoering, alsook gegevens van hoge kwaliteit te produceren. Dus, deze benaderingen die zijn gebaseerd op studies van de microscopie, bieden een unieke en krachtige kader om te studeren zowel de dynamiek en de morfologische veranderingen die betrokken zijn bij de epitheliale cellen gedrag en reactie op de behandelingen tijdens wondheling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen conflict van belang is.
Acknowledgments
Wij willen geven dankzij de oudere leden van de lab die helpen te verbeteren en verfijnen van deze technieken om de feitelijke toestand: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada en Dr. Antonia Alcaraz-García. We zijn dank verschuldigd aan het ziekenhuis klinisch Universitario Virgen de la Arrixaca voor zijn krachtige steun van de ontwikkeling van deze technieken. Ook het Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Plan Estatal ik + D + ik en Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant nr.: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER "Una manera de hacer Europa". Wij danken ook Universidad de Murcia en IMIB-Arrixaca FFIS voor administratieve ondersteuning en bijstand. Tot slot willen we een speciale dank aan Dr. Isabel Martínez-Argudo en de Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus autonoom de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo voor hun vriendelijke ondersteuning in gewillig cederende geven de Biogeneeskunde en biotechnologie laboratorium mogelijk te maken het gefilmde deel van dit document.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it? Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
