Summary
Bu el yazması kültürlü epitel hücre monolayers üzerinde yapılan nasıl kesi benzeri lezyonlar elverişli bir konuma sahip modeli şifa vitrogörüntüleme için tarafından confocal sağlayan, yarası. açıklar veya lazer tarama mikroskobu ve yüksek kaliteli sağlayabilir nicel ve nitel veri hücre davranış ve mekanizmaları geçişinde dahil çalışmak için.
Abstract
Hücre göç yara iyileşmesi için zorunlu bir yönüdür. Yapay oluşturma araştırma hayvan modellerinde genellikle pahalı ve karmaşık deneysel prosedürler sonuçlarında potansiyel hassas eksik ise yaralar. Vitro kültür epitel hücre hatları yara iyileşmesi ve tedaviler bu hücrelerde etkisini hücre göç davranışlara araştırma için uygun bir platform sağlar. Epitel hücrelerinin fizyolojisi kez birleşmesi olmayan koşullarda okudu; Ancak, bu yaklaşım koşulları şifa doğal yara benzemeyebilir. Mekanik yollarla epitel bütünlüğünü bozan gerçekçi bir model oluşturur, ancak moleküler tekniklerin uygulanması engelleyebilir. Sonuç olarak, temel mikroskobu teknikleri epitel hücre geçiş eğitimi için en iyi durumda tüp bebek. Burada iki belirli yöntemleri, yapay yara karalama tahlil ve nicel ve nitel veri, sırasıyla, epitel hücreleri göçmen performansı üzerinde elde edebilirsiniz yapay geçiş açık tahlil, ayrıntılı.
Introduction
Epitel boşluğu son kapatılması ve kesintiye yüzey1restorasyonu için sorumlu olduğu gibi hücre göç yara iyileşmesi için gereklidir. Hayvan modellerinde yapay yaraları yapmadan karmaşık bu süreçte fizyolojik şartlarda2yakınındaki çoğaltma olanağı sağlar. Ancak, bu yaklaşım genellikle potansiyel olarak farklı süreçler, yara iyileşme süreci karmaşık doğası gereği incelenmesi için duyarlık eksikliği pahalı ve karmaşık deneysel prosedürler, sonuç.
Vitro kültür epitel hücre hatları bu hücreler yara iyileşmesi ve hücre göç davranışı üzerinde tedavinin etkilerini oynamak rol araştırma için hayvan modelleri için yararlı bir alternatif sağlar. Epitel hücrelerinin fizyolojisi tarafından Moleküler teknikleri kullanarak birleşmesi kültürler3,4,5,6kez okudu; Ancak, epitel bütünlüğünü bozulma genellikle iyi mekanik insizyon tarafından sağlanır. Hücre kültüründe bu ihmal edilebilir hücre sayısı için yara boşluğu maruz kalabileceğinizi ve moleküler biyoloji teknikleri için çok küçük bir örnek temsil ettikleri anlamına gelir. Ancak, bu lezyonlar vizon akciğer epitel hücre (Mv1Lu) veya kendiliğinden ölümsüzleştirdi insan keratinosit (HaCaT) hücre gibi bazı epitel hücre hatları doğuştan gelen göçmen özelliklerini yararlanarak mikroskobik ölçek okudu olabilir satırları.
Burada nicel veriler üzerinde geçiş3,4,7,8şifa yara bağlamında epitel hücrelerinin elde etmek uygundur mikroskopi için bir yöntem açıklanmıştır. Ayrıca, biz niteliksel moleküler ve morfolojik değişiklikler üzerinde epitel monolayers geçiş sırasında meydana gelen eğitim yararlı ek yöntemler mevcut. Genel olarak, bu yöntemleri yara iyileşmesi sırasında dinamikleri ve morfolojik değişiklikler epitel hücre davranış ve yanıt-e doğru tedaviler ile ilgili çalışma için bir çerçeve sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. yapay yara karalama tahlil için nicel çalışmalar
- Hücre monolayer hazırlık
- Steril koşullarda çalışma, tohum ve kültür şişe serum takıma orta kullanarak Mv1Lu veya HaCaT epitel hücrelerinde büyür. Orta bir kez her 24-48 h yenileyin. Hücrelerin % 80 izdiham ulaştıktan sonra hücreleri kullanarak bir uygun yöntemi, Yani, trypsinization9bağlantısını kesin.
Not: Mv1Lu ve epitel hücre hatları EMEM ve DEMEM kültür ortamına kullanarak kültürlü HaCaT sırasıyla, 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş ve % 5 CO2kontrollü bir atmosfer ile 37 ° C'de inkübe. Her hücre kültürünü iyice hücre toplama ve zamanlama tam confluency ulaşmak için gerekli belirlemek için denetlesinler gerekir. Genellikle Mv1Lu veya HaCaT hücreler için 2-4 x 104 ya da 4-6 x 104 hücreleri/iyi, sırasıyla, bir 175 cm2 kültür şişeye numaralı seribaşı ve %80 35 x 106 Mv1Lu ya da 1 x 107 HaCaT hücreleri izdiham verir. - Ya bir 12-şey ya da 24-şey kültür tabağına, her kuyuya hücre 2 mL tohum. Her 24-48 h emin olun cep numaraları sonra 2-3 gün sonra % 100 izdiham ulaşmak için yüksek orta yenileyin.
- Hücreleri izdiham ulaştıktan sonra serum takıma orta kaldırmak ve iki kez taze orta ile serum-Alerjik yıkayın. Hücreler serum-Alerjik orta 24 h için tırmalamak önce tutmak.
Not: Mv1Lu veya HaCaT hücreleri özel substrat gereksinimleri yoktur; Ancak, hücre hatlarında serum serbest koşullarda kendiliğinden ayırma için duyarlı, Poli-L-lizin çözüm kullanarak kültür plaka yüzeyi öncesi kaplama10düşünülmelidir.
- Steril koşullarda çalışma, tohum ve kültür şişe serum takıma orta kullanarak Mv1Lu veya HaCaT epitel hücrelerinde büyür. Orta bir kez her 24-48 h yenileyin. Hücrelerin % 80 izdiham ulaştıktan sonra hücreleri kullanarak bir uygun yöntemi, Yani, trypsinization9bağlantısını kesin.
- Monolayer tırmalamak
- Steril bir ortamda çalışmaya, kültür monolayer sıkıca 20 µL veya 200 µL steril micropipette uç, bağlı olarak istenilen sıfırdan genişliği dar sonuna sürükleyerek kaşı. İpucu boşluk homojenliği en üst düzeye çıkarmak için kültür yüzeye dik tutun.
- Kültür plakaları açıkça hücre monolayer izlemek için karanlık bir yüzeye yerleştirin. Gerekirse, iki dikey çizik (çapraz şeklinde) üzerine 4 geçiş alanları kadar çalışmaya her iyi gerçekleştirin.
- Müstakil hücreler kültür orta ve yavaşça ekleyerek taze serum-Alerjik orta hafifçe kaldırarak yıkayın. İki kere tekrar edin veya en ekli olmayan hücreleri kaldırıncaya kadar.
- Steril bir ortamda çalışmaya, kültür monolayer sıkıca 20 µL veya 200 µL steril micropipette uç, bağlı olarak istenilen sıfırdan genişliği dar sonuna sürükleyerek kaşı. İpucu boşluk homojenliği en üst düzeye çıkarmak için kültür yüzeye dik tutun.
- Deneysel işlem ve veri toplama
- Her şey bir CCD kamera birleştiren bir ters faz kontrast mikroskobu kullanarak sıfırdan farkı merkezli 4 ön arıtma referans görüntü alabilir. Mikroskop alan çizikler bitişik kesişimine kenarına yerleştirerek ilgi alanları seçin.
Not: Genellikle, 10 x büyütme ve 1280 x 1024 piksel görüntü boyutu kullanarak görüntüleri elde edilir. Yardımcı olur kolay Yerelleştirme ve doğrulama şey başına en çok 4 ölçümler için yukarıda açıklandığı gibi ilgi alanları seçme. - Bir kez tüm görüntüleri elde, tedavi wells belirlemek; Wells orta seçili tedavileri içerir taze orta ile değişimi.
Not: Alternatif olarak, kimyasal madde veya kültür orta homojenliği rahatsız etmeyin bileşikler için Tedaviler doğrudan kültür ortamın aşılanmış. - Gözlem ulaşmak % 90'ı karalama boşluğu kapatma koşullarda kadar çizik plaka (37 ° C de % 5 CO2içeren bir kontrollü atmosfer) kuluçkaya. Tam kapatma kaçının.
Not: Toplam boşluğu kapatma tedavi sonrası resim koleksiyonu olarak başvuru alanları algılanabilir değildir ve gap kapanış zaman başvurusunu kurulamıyor kapatıldı. Mv1Lu veya HaCaT hücre söz konusu olduğunda, 16-19 h % 90 izdiham ulaşmak için gereklidir. - Hücre geçiş hücreleri düzelterek dur; Yavaşça 1 mL % 4 formalin PBS içinde deneysel kültür orta yerine. 15 dakika dik, kuluçkaya
- Aşırı formalin kaldırmak için hücreleri yıkayın; Yavaşça kuyuları çözümde taze PBS ile değiştirin. En az iki kere tekrar edin.
Not: Bu aşamada, mühürleme sonra plakaları 4 ° C'de süresiz olarak saklanır. - Tedavi sonrası referans görüntü her şey çizilmemesi sonra yakalanan başvuru alanlarından alabilir. Aynı ekipman (CCD kamera birleşmeyle ters optik faz kontrast mikroskop) ve eşleşen resim ayarları (büyütme ve dijital çözünürlük/yoğunluğu) kullanın.
Not: tek tek geçir ve bağımsız olarak (örneğin, MDA-MB-231 meme kanseri insan hücreleri) tutarlı bir cephe oluşumu boşluğu doldurmak hücreler için tek tek hücre geçiş hızları hesaplanması zaman ders görüntüleri izin verebilir.
- Her şey bir CCD kamera birleştiren bir ters faz kontrast mikroskobu kullanarak sıfırdan farkı merkezli 4 ön arıtma referans görüntü alabilir. Mikroskop alan çizikler bitişik kesişimine kenarına yerleştirerek ilgi alanları seçin.
- Görüntü analizi ve miktar göç
- Görüntü işleme yazılımı (örneğin, ImageJ) kullanarak, sıfırdan farkı sınırlarını tanımlamak ve dört ölçüm sonuçları ön arıtma resimler için boşluk yüzey belirlemek. "Ön arıtma boşluğu yüzeyi" olarak veri kaydı (PREGAP). Tedavi sonrası resimler için aynı işlemi tekrarlayın. "Tedavi sonrası boşluğu yüzeyi" olarak veri kaydı (POSTGAP).
- Kaydedilen görüntü ImageJ kullanarak açın. "Resim" menüsündeki resim türü 8 bit olarak ayarlayın. "İşlem" menüsünden "filtreler" alt menüsüne gidin ve "varyans" filtreleme uygulayın.
- "Resim" menüsündeki "ayarlama" alt menü ve siyah ve beyaz set eşik girin (B & W), "Koyu arka plan" seçilmediğinden emin olun. "İşlem" menüsünden "ikili" alt menüsüne gidin ve "boşluğu doldurman gerek" seçin.
- "Analiz" menüsündeki "ölçümleri Kur" seçeneğini ve "alan" harekete geçirmek. Sonra böylece boşluğu sınırlayan geçirme kenar dağılımı aşağıdaki ölçülebilir alanı çizin.
- "Analiz" menüde "parçacıklar analiz" seçin ve "Toplam alan" değerlerini çizilmiş alan yüzey için kaydedin.
- PREGAP ve POSTGAP Toplam alan değerleri her el bireysel örnekleri için mutlak geçiş boşluğu yüzey ölçümleri fark olarak ölçmek için elektronik tablodaki tanıtmak: PREGAP − POSTGAP [rasgele birimleri]. Ayrıca, mutlak göç veri denetimi örnekleri her durumun normale: (örnek / kontrol) * 100 [%].
Not: tek tek geçir ve tutarlı bir açık, (örneğin, MDA-MB-231 meme kanseri insan hücreleri) oluşumu bağımsız olarak boşluğu doldurmak hücreler için mutlak geçiş merkezi bir istila hücreleri sayarak hesaplanabilir ya da şerit denetimi ya da tedavi örnekleri. - (Bkz. şekil 1) miktar çıkışlarını arsa. İstatistiksel analizi gerçekleştirin.
- Görüntü işleme yazılımı (örneğin, ImageJ) kullanarak, sıfırdan farkı sınırlarını tanımlamak ve dört ölçüm sonuçları ön arıtma resimler için boşluk yüzey belirlemek. "Ön arıtma boşluğu yüzeyi" olarak veri kaydı (PREGAP). Tedavi sonrası resimler için aynı işlemi tekrarlayın. "Tedavi sonrası boşluğu yüzeyi" olarak veri kaydı (POSTGAP).
2. yapay geçiş açık tahlil topografik Etüdleri
- Hücre monolayer hazırlık
- Plaka'nın yüzeyi tamamen kaplı kadar steril koşullarda çalışma, boş kültür levha sterilize yuvarlak coverslips bir katman yer.
Not: 12 ve 33 coverslips kadar 5 cm ve 10 cm Çap Kaplamalar, anılan sıraya göre uygun. - Kültür plaka üzerinde hafifçe 2-3 gün sonra % 100 izdiham sağlar bir konsantrasyon hücreleri yeterli bir hacmi tohum. Steril micropipette bahşiş ile hafif basınç uygulayarak yüzen coverslips önlemek ve hiçbir coverslip komşu coverslips çakışıyor emin olun. Orta her 24-48 h yenileyin.
Not: Her hücre kültürünü iyice hücre toplama ve zamanlama tam confluency ulaşmak için gerekli belirlemek için denetlesinler gerekir. Genellikle Mv1Lu veya HaCaT hücreler için sırasıyla, 2-3 x 106 veya 2.5-4 x 106 hücreler/10 cm-Çap plaka, seribaşı. Küçük tabak için hücre sayıları ölçekli olmalıdır. - Hücreleri izdiham ulaştıktan sonra serum takıma orta kaldırın ve taze serum-Alerjik orta ile değiştirin. Yapay yara yapılmadan önce hücreleri serum-Alerjik orta 24 saat tutun.
Not: Mv1Lu veya HaCaT hücreleri özel substrat gereksinimleri yoktur; Ancak, hücre hatlarında serum serbest koşullarda kendiliğinden ayırma duyarlı, Poli-L-lizin çözüm kullanarak kültür yüzey öncesi kaplama10düşünülmelidir.
- Plaka'nın yüzeyi tamamen kaplı kadar steril koşullarda çalışma, boş kültür levha sterilize yuvarlak coverslips bir katman yer.
- Monolayer yaralama
- Steril cımbız kullanarak, yavaşça bir coverslip taze serum-Alerjik orta içeren bir temiz 10 cm tabak taşıyın. Coverslip çevre cımbız ile tutarak monolayer zarar vermemek. Coverslip kırılması neden olabilir aşırı basınç kaçının.
- Yapay yaraları sterilize jilet enine bir çizgide coverslips Merkezi sürükleyerek oluşturun. 3-4 mm ve ileri geri, Merkezi monolayer şerit tamamen kaldırmak için sürükleyin. Hiçbir hücre artıkları yaralı kenarlarına bağlı kalır emin olun.
Not: üzerinde 12 mm çapında coverslip, belgili tanımlık kesme sırasında yapılan orta coverslip. Hücrelerin coverslip aşağıdaki adımlarda, devirme önlemek için yeterince büyük ana açık karşısında (en az 2 mm genişliğinde) bir çizgi bıraktığınızdan emin olun. - Yaralı coverslips hücreleri, bir temiz 6-şey plaka içeren en az 2 mL taze serum-Alerjik ortamına karşı karşıya aktarabilirsiniz. 4 yaralı coverslips/iyi uygun.
- Yavaşça iki kez taze kullanarak yıkayın müstakil hücre kaldırma için serum-Alerjik orta.
- Deneysel bir işlem ve örnekleme
- Yavaşça Wells orta seçili tedavileri içerir taze orta ile değişimi.
Not: Alternatif olarak, kimyasal madde veya kültür orta homojenliği rahatsız etmeyin bileşikler için Tedaviler doğrudan kültür ortamın aşılanmış. Herhangi bir potansiyel hücre dekolmanı önlemek için dikkatli olun. - Bir hücre İnkübatör (37 ° C, % 5 CO2) içinde plaka için istenen deneysel zamanlama tutmak.
- Hücre geçiş hücreleri düzelterek dur; Yavaşça 1 mL % 4 formalin PBS içinde deneysel kültür orta yerine. 15 dakika dik, kuluçkaya
Not: Ders deneyler süre örnekleri kültür plaka kaldırın ve bunları diğer, devam eden deneysel koşullar etkileyen formalin duman önlemek için ayrı bir tabak içinde düzeltmek. - Aşırı formalin kaldırmak için hücreleri yıkayın; Yavaşça kuyuları çözümde taze PBS ile değiştirin. En az iki kere tekrar edin.
Not: Bu aşamada, mühürleme sonra plakaları 4 ° C'de süresiz olarak saklanır.
- Yavaşça Wells orta seçili tedavileri içerir taze orta ile değişimi.
- Ayirt (Eğer) ve topolojik analizi
- Eğer boyama gerçekleştirmek ve görüntüleme bireysel coverslips üzerinde başka bir3,4,11bölümünde.
- 10 dakikadır coverslips % 0,3 Triton X-100 çözümde PBS çeker tarafından permeabilize.
- Blok 30 dk ertesi gün engelleme eriyik istimal için: %0,3 sığır Serum albümin; % 10 fetal sığır Serum; %5 yağsız süt; %0,3 Triton X-100 PBS çözümde.
Not: süt olmadan çözüm engelleme olabilir önceden hazırlanmış ve -20 ° C'de depolanan - Nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 1 h için birincil antikor süt içermeyen engelleme çözümde seyreltilmiş ile kuluçkaya. Coverslips ters uygun dağıtım sağlamak için 15 µL antikor çözümde yerleştirin.
Not: Antikor çalışma seyreltme değişkendir ve antikor kullanılıyor bağlı olacaktır. Örneğin, 1/100 seyreltme tavşan anti-c-Jun antikor gerektirir. - Çözümde bir içinde % 0,1 Triton X-100 PBS coverslips daldırma tarafından üç kez yıkayın.
- İkincil antikor engelleme arabelleği süt ücretsiz 30 min için seyreltilmiş coverslips kuluçkaya.
Not: Antikor çalışma seyreltme değişkendir ve antikor kullanılıyor bağlı olacaktır. Örneğin, keçiyi-anti-tavşan (488) 1/400 seyreltme için en iyi çözünürlük gerektirir. Phalloidin ve Höchst 33258 gibi diğer etiketleme reaktifler kuluçka arabelleğe bu aşamada eklenebilir. - Üç kez PBS % 0,1 Triton X-100 çözümde coverslips daldırma tarafından yıkayın.
- Coverslips ters içinde mikroskop slayt üzerinde yerleştirilen bir 10 µL montaj medya damla (örneğin, Vectashield) bağlayın. Slaytları gecede montaj orta sertleştirme için oda sıcaklığında karanlıkta bırakın. Daha sonra karanlıkta 4 ° C'de süresiz olarak depolar.
- Ya epifluorescence ya da yapısal değişiklikler geçirme ön kenarında meydana gelen confocal mikroskobu görüntüleri elde edilir.
Not: Topolojik çalışmalar iç monolayer geçirme açık resimler fayans tarafından gerçekleştirilir. Yarı nicel çalışmalar yerel Floresans yoğunluklarda yazılım tabanlı analiz tarafından yapılır.
- Eğer boyama gerçekleştirmek ve görüntüleme bireysel coverslips üzerinde başka bir3,4,11bölümünde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yapay yara karalama tahlil için nicel çalışmalar: Epidermal büyüme faktörü (EGF) promosyon göç değerlendirilmesi:
EGF epitel hücre çoğalması ve geçiş ve böylece olumlu bir denetim geçiş promosyon miktarının için iyi bilinen bir uyarıcı olduğunu. Mv1Lu ve HaCaT hücre monolayers yara karalama deneyleri içinde kullanılan ve ön arıtma resimler elde edilmiştir. 10 ng/mL EGF ile aşı sonra hücreleri için 19 h fiksasyon ve tedavi sonrası resimleri önce inkübe. Nükleer silahların yayılmasına karşı serum açlık koşulları tutarak minimumda tutuldu. Öncesi ve tedavi sonrası kümeleri resimleri ImageJ kullanarak analiz edildi ve merkezi boşluk alanları belirlenmiştir. Deney için her şey dört ölçümleri kayıt Çoğalt, çalıştırıldı. Miktar mutlak göçün yüzeyler fark hesaplanmıştır: (PREGAP − POSTGAP). Uyarılan HaCaT hücrelere (şekil 1B) karşılaştırıldığında uyarılan Mv1Lu hücreleri (şekil 1A) büyük bir göç potansiyeli vardı. Farklar keratinositler, sırasıyla cildi ve Mukoza epitel hücreleri olan hücre kaynaklar tarafından açıklanmıştır.
Yapay geçiş açık tahlil topografik Araştırmaları: hücre iskeleti uyum ve kayma ifade, C-Haziran:
Hücre göç hücre deplasman sürdürmek için sürekli ve derin değişiklikleri sitoiskeleti yapısının içerir. HaCaT hücre monolayers denetim ve stimülasyon koşullar altında geçiş açık deneyleri kullanılmaya başlanmıştır. Eğer gözlenen ve tarama mikroskobu (LSM; lazer hücre iskeleti dynamics EGF ile tedavi potentiates Şekil 2A). EGF tedavi de sinyal sağlam Mitogen-Activated Protein (harita) kinaz ve c-JUN overexpression ile sonuçlanır. LSM resimleri döşemek için kayma desenleri yapılandırılmasına olanak sağlar. Artan ifade, c-Haziran geçirme cepheye bitişik hücreleri, kolayca yazılım görüntü analizi tarafından açığa çıkarılabilir; Burada, biz hangi (2B rakam) c-JUN etiketleme karşılık yeşil kanal için bir gökkuşağı ölçek hayata.
Şekil 1. Promosyon Mv1Lu ve HaCaT hücrelerdeki EGF tarafından göçün. Faz kontrast mikroskobu görüntüleri Mv1Lu yaralı bölgeye(a)ve HaCaT (B) hücreleri kontrol koşullar altında alınan ve görüntüleri ile 10 ng/mL EGF 19 h için serum serbest koşullarda tedavi hücre karşılaştırılır. Temsilcisi Filmler sıfırdan bir boşluk ve bir 20 µL micropipette ucu ile yaralama sonra elde edilen kapatma ölçüde göster. Büyütme = 10 x; Ölçek çubuğu 100 µm. göç sayılabilir ve tedavi ve kontrol örnekleri her tahlil (rasgele adet; için alan farklılıkları varyasyonu olarak temsil hücre = AU). Arsa her koşul için sekiz bağımsız ölçümlerin temsilcisidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Aktin filamentleri ve c-JUN ifade değişiklikleri EGF geçirme HaCaT hücrelerdeki tarafından teşvik. (A) gecede 10 ng/mL EGF tedavi teşvik aktin filamentleri geçirme HaCaT hücrelerdeki biçimsel büyük değişiklikler. Hücreleri geçiş ön kontrol koşullardan sıkı bir şekilde yapılandırılmış aktin filamentleri sitoiskeleti tasvir, zavallı aktin filamentleri organizasyon geçiş ön tarafta hücreleri EGF ile tedavi gösterirken. Büyütme = 63 x; Ölçek çubuğu = 20 µm. F-aktin olduğunu renk kodlu kırmızı ve Höchst mavi renk tarafından temsil edilir. (B) IMMUNO-floresan c-JUN ifade geçirme HaCaT hücreleri üzerinde 10 ng/mL EGF tedaviden sonra çalışmaya LSM Imaging ile birlikte kullanıldığı zaman, döşeme besteleri kayma ifade desenleri ortaya koyuyor. C-Jun floresan (yeşil) görüntülerini c-Jun boyama şiddeti göstermek için sözde renk olarak çevrildi. Renk gökkuşağı ölçeği floresan yoğunluğu c-Haziran, colormaps doğru panellerinde EGF ve denetim için karşılık gelen için temsil eder. Phalloidin (kırmızı) ve Höchst-33258 (mavi) ile birlikte boyama hücre yapısı ve çekirdeği, sırasıyla göstermek için kullanıldı. Görüntüleri confocal mikroskop tarafından alındı. Artan ifade düzeyleri, nükleer c-Haziran yaklaşıyor geçirme açık alanlarda unutmayın. Ölçek çubuğu 40 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cilt veya mukoz kesintileri bariyer fonksiyonu fibroblastlar veya epitel ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri eylemleri ile geri yüklenir. Manivela, tabi bu hücreler karmaşık bir işlem apoptosis, nükleer silahların yayılmasına karşı farklılaşma ve önemlisi, fibroblast ve epitel hücre göç, son mekanizması kesintiye dokusunun restorasyonu için sorumlu olan ve Tam da yara tedavisi düzenleyici potansiyelini belirlenirken epitel hücreleri, fizyolojik davranışını tanımlayan kapatma yüzeysel epitel boşluk1,12 böylece, hücre geçiş eğitim yardımcı olur şifa.
Farklı araştırma hayvan modellerinde yapay yaraları yapmadan fizyolojik şartlarda2yakınındaki karmaşık bu süreçte çoğaltılması ve patolojik bazı koşullar değerlendirilmesi veya ilaç etkileri için böylece olanağı sağlar tedaviler13. Ancak, bu yaklaşım genellikle pahalı ve karmaşık lojistik yanı sıra veri gecikmeli moda13' te oluşturabilir külfetli deneysel prosedürler sonuç. Aksine, vitro hücre kültürü hücrelerde süreci şifa yara dahil davranışını araştırma için daha uygun bir çerçeve sağlar. Epitel hücrelerinin birincil hücre kültürü uygun bir seçenek teşkil ederken, elde etmek ve veri toplama karmaşık hale getirebilir hücreleri işlemek zor olabilir. Örneğin, ek olarak tipik düşük geçiş kısıtlama birincil kültürlerin birincil insan lenfositi fibroblast büyüme vitro3için katman besleme gerekir. Aksine, Mv1Lu veya HaCaT, gibi köklü epitel hücre kültür çizgiler o özellikleri davranışı ve özellikleri bu birincil kültür hücreleri3,4gibi bir engel-Alerjik araştırma modeli oluşturur, 14,15. Doğrusu, yara iyileşmesi çalışma için bu iki hücre satırları kritik özellikleri geçirin ve yayılması nedeniyle hücre hücre iletişim inhibisyon izdiham16,17üzerine durdurmak için yeteneklerini korumak.
Kazı-kazan deneyleri göçmen yeteneklerini farklı hücre tipleri, özellikle epitel ve kanser hücrelerinin miktarının için güvenilir ve çok yönlü bir yöntemdir. Kanser hücrelerinin durum için invaziv potansiyeli değerlendirmesi için karalama yöntemi önerdi. Ancak, bu yaklaşım daha belirli yöntemleri hücre dışı matriks18,19nüfuz için gerekli metalloproteases ifade dayanarak karşılaştırıldığında invasiveness gösterge yetersiz kalıyor. Aksine, kazı-kazan deneyleri epitel hücrelerinin göçmen performans ve bu özellik üzerinde farklı tedaviler etkisini değerlendirmek için güvenilirdir. Kanser hücreleri satırları aksine, hangi sık sık kötü uyum ve yetenek çeşitli katmanları, Mv1Lu, HaCaT ve "her ikisi de bağlı olarak bir süreç içinde onların kenar boşluklarını genişletmek diğer epitel hücre hatları sıkıca ilişkili form büyüme adalar─▒", büyümeye göstermek nükleer silahların yayılmasına karşı ama daha da önemlisi üzerinde hücre göç. Sonuç olarak, seyrek veya alt Konfluent hücre yoğunluğu koşulları geleneksel göçmen fizyolojisi üzerinde farklı tedaviler etkileri eğitimi için kullanılır; özellikle sonraki moleküler biyoloji teknikleri uygulandığında, aktif geçirme oranı en üst düzeye çıkarma hücreleri ise bu hücre çevre temas inhibisyonu en aza indirir. Ancak, epitel hücreleri için birleşmesi olmayan koşullar önemli önceden varolan temas inhibisyonu etkiler, örneğin epigenetik düzenleme şeklinde hariç riski teşkil. Böylece, yara iyileşmesi çalışmaya Konfluent koşulları modeli artan sadakat görüşmek.
Kesin tahminleri elde etmek için epitel hücre katmanı biçimi etkilemeden veya göç-e doğru katkıda bulunmak eşlik eden faktörler ele alınması gerekir. İzdiham isteniyorsa, bu aşırı hücre yoğunluğu ya da çok katmanlı kültürler, bu koşullar olumsuz etkileyebilecek beri önlemek önemlidir. Bu nedenle, nükleer silahların yayılmasına karşı yaygın açlık serum-Ücretsiz medya ya da geri dönüşümsüz tutuklamak hücre çoğalması DNA crosslinking3,20tarafından, Mitomycin C gibi kimyasal ilavesi denetlenir 21. belirli hücre çizgileri; davranışını ikisinden biri kullanımına dayanıyor Mitomycin C özellikle ne zaman indirimli serum takviyesi büyük hücre dekolmanı önlemek için gerekli belirtilir. Bu durumda HEK-293T hücreler için önceden Poli-L-lizin kullanarak kültür yüzey kaplama nerede Mytomycin C tedavi önlemek için iyi bir seçenek. Serbest geçiş alter inflamatuar faktörlerin de ele alınması gerekir. Farklı stratejiler, epitel yüzeyi ile sıfırdan tahlil22elde bozulma taklit etmek için silikon ekler üzerinde ağırlıklı olarak kullanılmaktadır. Silikon parça çıkardıktan sonra hücre geçiş izin önceden var olan boşluklar ekler üretmek iken, karalama yöntemi doğrudan boşluğu oluşturmak için epitel monolayer bazılarını kaldırmayı üzerinde dayanır. Tercih boşluğu oluşturmak nasıl kültür yüzey kaplama (Yani, kültür plaka veya Poli-L-lizin) koruma yeteneği ekler üzerinde zararlardan tırmalamak sırasında ayrıca olabilir hasarlı hücreleri faktörler sürümünden en aza indirerek dayanır hücre kültür davranışı23uzlaşma. Bu özelliklere geçirmek için yeteneği kanser hücrelerinin değerlendirilmesi Yani, bazı deneysel ayarları için yararlı olabilir, ancak deneyim önemli sakıncaları ekler çalışmalar şifa yarada kullanmak için bulduk. Mv1Lu hücreleri hücre monolayer silikon parçaları kaldırılması üzerine, yırtılma istemeden sonuçları silikon Ekle dış yüzeyine bağlama yeteneğine sahiptirler. Ayrıca, her ne kadar HaCaT hücreleri için silikon eklemek değil, azalmış yetenek Ekle tarafından oluşturulan boşluklar geçirmek bu hücreler için bulduk. Bu ölçüde, inflamasyon ve geçiş sıkıca ilişkili yanıtlara ve bunlar HaCaT hücrelerde yara iyileşmesi bağlamında birlikte kritik gibi görünüyor. Kültür yüzey tırmalama için plastik bir ipucu uygulama yeteneği hücre yeniden durumunda HaCaT hücreleri, boşluğu doldurmak için hiçbir belirgin sonucu vardır Ayrıca, böyle bir davranışı hücre dışı matriks kalıntıları boşluğu içinde geçişinde yol gösteriyor doğal bir yara dermiste benzer bir biçimde.Ancak, yara yapmak için plastik bir ipucu kullanımı her zaman aynı boyut boşluk işlemez gibi değişim ana kaynağı tırmalamak prosedür kendisini, kalır. Tutarsızlık baskı ve çizik zaman ucunda konumunu nedeniyle farklı örnekleri arasında % 20'e kadar varyasyonları gözlemledim. Bu varyasyonlar daha katı bir nesne ile monolayer yaralama tarafından ele alınması; Ancak, herhangi bir çizik plastik yüzey hücreleri serbest dolaşımı tehlikeye. Yani, ilk çizik değişimler geçiş hesaplamak için dikkate alınmalıdır; tipik olarak, koşul başına ölçüm sayısını artırarak.
Miktar ek olarak, klasik Eğer teknikleri ile birlikte yaralama yordamları uygulama niteliksel hücre göç moleküler süreçlerinin değerlendirebilirsiniz. Coverslips üzerinde büyümeye epitel hücrelerinin iyi bilmek bir özelliktir; Geçmişte, çizik varyasyonları deneyleri dahil hücreleri üzerinde farklı koşullar ardından sabitleme ve yara Tirmigi deneysel Kur24içinde karşılaştırma için boyama maruz coverslips geçirme. Burada, monolayers coverslips üzerinde büyüyen geniş boşluklar oluşturma deneysel zaman içerisinde3,4,7genişletmek için sağlar bulduk. Ayrıca, bu deneylerde artar potansiyel hassas herhangi bir hücre ve hücre altı mekanizmaları incelemek için yordam algılama yetenekleri dahil ve sadece antikorlar bu teknik için uygun kullanılabilirliği ile sınırlıdır ve hücreleri ilgi. Eğer için kullanılan coverslips örnekleri için genişletilmiş koruma izin mikroskop slaytlar monte edilmiştir. Bu uygulama uzun çalışma süreleri, "döşeme" yaklaşımlar burada ve başka yerlerde3,4,7görücüye gibi gerektiren deneysel kurulumları yardımcı olur. "Döşeme" strateji kayma desenleri mekanizmaları geçişinde ilgili yeniden yapılandırma için zamansal veri ile entegre ederken, yazılım analiz araçları uygulanması yarı nicel değerlendirmeler üzerinde yerel Floresans dayalı sağlayabilir yoğunluk ve elde edilen bilgilerin kalitesi daha da zenginleştirmek. Deneyim, döşeme da hücre konumsal bilgi bu tür bir tahlil proteinlerin ifade için eğitim imkanı sunuyor. Bu konum bilgileri anlamak ve hücre göç, özellikle kurulumları epitel hücreleri konumunu göçmen davranışının3 belirlemek çok önemli olduğu farklı ajanlar etkilerini daha iyi çevirmek için çok önemli olduğu gösterilmiştir ,4,14,15.
Her iki yordamlar açıklanan basit uygulama olarak kalite veri üreten büyük kolaylık gösterir. Bu nedenle, mikroskopisi çalışmaları, temel alan bu yaklaşımlar sunan dinamikleri ve morfolojik değişiklikler epitel hücre davranışlara yer çalışmaya benzersiz ve güçlü bir çerçeve ve yaranın normal iyileşmesi sırasında tedavilere yanıt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması olduğunu ilan eder.
Acknowledgments
Biz geliştirmek ve fiili duruma bu teknikleri rafine yardımcı eski üyeleri laboratuarının sayesinde vermek istiyorum: Dr Celia Martinez-Mora; Dr Anna Mrowiec, Dr Catalina Ruiz-Canada'da ve Dr Antonia Alcaraz-García. Biz kuvvetle bu tekniklerin gelişimi desteklemek için hastane Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca için borçlu bulunmaktadır. Ayrıca Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Estatal planı ben + D + ı ve Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant No: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER "Una manera de hacer Europa". Biz Ayrıca Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca ve FFIS idari destek ve yardım için teşekkür ederiz. Sonunda, biz özel bir Doktor Isabel Martínez-Argudo ve Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, kampüs Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo isteyerek sigorta içinde tür destek için teşekkür vermek istiyorum Biyomedikal ve biyoteknoloji filme bu kağıt parçası mümkün kılmak için laboratuvar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it? Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
