هذه المخطوطة يصف كيف شق مثل الآفات على الخلايا الظهارية مثقف مونولاييرس مريح نموذج الجرح الشفاء في المختبر، مما يسمح للتصوير بواسطة [كنفوكل] أو الفحص المجهري بالليزر، والتي يمكن أن توفر جودة عالية البيانات الكمية والنوعية لدراسة سلوك الخلية والآليات المعنية بالهجرة.
الهجرة الخلية جانب إلزامي لالتئام الجروح. إنشاء اصطناعية الجروح في نماذج حيوانية للبحث غالباً ما تكون النتائج في إجراءات تجريبية مكلفة ومعقدة، بينما يحتمل أن تفتقر إلى الدقة. الثقافة في المختبر من خطوط الخلايا الظهارية منبرا مناسباً للبحث عن سلوك الخلية المهاجرة في التئام الجروح وأثر العلاجات في هذه الخلايا. غالباً ما يتم دراسة فسيولوجيا الخلايا الظهارية في ظروف غير روافد؛ بيد هذا النهج قد لا تشبه الجرح الطبيعية شفاء الظروف. تعطيل تكامل ظهارة بالوسائل الميكانيكية يولد نموذج واقعي، ولكن يمكن أن تعوق تطبيق التقنيات الجزيئية. ونتيجة لذلك، الأمثل لدراسة الهجرة الخلية الظهارية تقنيات الفحص المجهري على أساس في المختبر. هنا نحن التفصيل طريقتين محددة والمقايسة الصفر الجرح مصطنعة والمقايسة الجبهة الهجرة المصطنعة، التي يمكن الحصول على البيانات الكمية والنوعية، على التوالي، على أداء الخلايا الظهارية المهاجرة.
الهجرة الخلية المطلوب لالتئام الجروح، كما أنها مسؤولة عن الإغلاق النهائي للفجوة الظهارية وترميم السطح تعطلت1. أداء الجروح الاصطناعية في نماذج حيوانية يسمح بتكرار هذه العملية المعقدة بالقرب من الظروف الفسيولوجية2. ومع ذلك، غالباً ما يؤدي هذا النهج في إجراءات تجريبية مكلفة ومعقدة، التي يحتمل أن تكون تفتقر إلى الدقة لدراسة عمليات متميزة، بسبب الطبيعة المعقدة لعملية التئام الجروح.
الثقافة في المختبر من خطوط الخلايا الظهارية يوفر بديلاً مفيداً لنماذج حيوانية للبحث في الدور الذي تؤديه هذه الخلايا في التئام الجروح وآثار العلاج على سلوك الخلية المهاجرة. وكثيراً ما هو درس فسيولوجيا الخلايا الظهارية من التقنيات الجزيئية باستخدام غير روافد الثقافات3،4،،من56؛ ومع ذلك، عادة ما يتحقق الإخلال بسلامة ظهارة بغرامة شقوق الميكانيكية. في الخلية والثقافة، وهذا يعني أن عدد لا يذكر من الخلايا يمكن أن تتعرض إلى الفجوة الجرح، وهي تمثل عينة صغيرة جداً لتقنيات البيولوجيا الجزيئية. ومع ذلك، يمكن دراسة هذه الآفات على المستوى المجهري، مع استفادة خصائص بعض خطوط الخلايا الظهارية، مثل الخلية “الظهارية المنك الرئة” (Mv1Lu) أو الخلايا keratinocyte الإنسان عفويا مخلدة (هاكات) الفطرية المهاجرة خطوط.
هنا وصفت لنا طريقة للفحص المجهري مناسب للحصول على بيانات كمية عن هجرة الخلايا الظهارية في سياق الجرح الشفاء3،4،،من78. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم الطرق الإضافية التي قد تكون مفيدة لدراسة التغيرات الجزيئية نوعيا والمورفولوجية التي تحدث في مونولاييرس طلائي أثناء الترحيل. عموما، هذه الأساليب توفر إطارا لدراسة ديناميات والتغييرات الشكلية التي تشارك مع سلوك الخلايا الظهارية واستجابة للعلاج أثناء التئام الجروح.
على الجلد أو الأغشية المخاطية التعطيل، يتم استعادة وظيفة حاجز الأعمال التي تقوم بها العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الليفية أو الخلايا الظهارية ومحصنة. مربوط، تخضع هذه الخلايا معقدة العملية التي تنطوي على المبرمج وانتشارها، والتمايز، والأهم من ذلك، تنتجها الخلايا الليفية وط…
The authors have nothing to disclose.
نحن نريد أن نعطي بفضل كبار أعضاء المختبر التي تساعد في تحسين وصقل هذه التقنيات إلى حالته الفعلية: د. سيليا مارتينيز-مورا؛ أنا الدكتور مروويك والدكتور كاتالينا رويز-كانيادا والدكتور أنطونيا الكاراز-غارسيا. ونحن مدينون لمستشفى Clínico الجامعي فيرجن de la اريتشاكا لدعم تطوير هذه التقنيات بشدة. كما دي معهد الصحة كارلوس الثالث، Sanitarias فوندو للبحوث. خطة استاتال أنا + د + أنا ومعهد دي السعود كارلوس الثالث-Subdirección العامة دي تقييم y Investigación de la الحكوميتين (منحة رقم: PI13/00794)؛ www.isciii.es-FEDER Fondos “أونا manera de hacer Europa”. ونشكر أيضا جامعة دي مورسيا، إيميب-اريتشاكا وفيس للدعم الإداري والمساعدة. وأخيراً، نحن نريد أن نعطي خاصة بفضل الدكتورة إيزابيل مارتينيز-أرجودو وفي كلية العلوم عليه ص Bioquímica، حرم تكنولوجيا البحار de la مومنتم دي أرماس، جامعة قشتالة لامانشا، توليدو لدعمهم الطيبة في التنازل عن طيب خاطر الطب الحيوي ومختبر التكنولوجيا الحيوية تجعل من الممكن تصوير جزء من هذه الورقة.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |