इन विट्रो घाव हीलिंग के दौरान उपकला कोशिका प्रवास के आकलन के लिए सूक्ष्म आधारित तरीकों
Summary
इस पांडुलिपि का वर्णन करता है कि कैसे चीरा-तरह के घावों पर बने संस्कृतिक उपकला कोशिका monolayers आसानी से मॉडल घाव हीलिंग इन विट्रो, फोकल या लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, और जो उच्च गुणवत्ता प्रदान कर सकते हैं कक्ष व्यवहार और माइग्रेशन में शामिल तंत्र दोनों का अध्ययन करने के लिए मात्रात्मक और गुणात्मक डेटा ।
Abstract
कोशिका प्रवास घाव भरने के लिए एक अनिवार्य पहलू है । अनुसंधान पशु मॉडल पर कृत्रिम घावों का निर्माण अक्सर महंगा और जटिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में परिणाम है, जबकि संभावित परिशुद्धता में कमी । इन विट्रो में उपकला कोशिका लाइनों की संस्कृति घाव भरने में सेल प्रवासी व्यवहार और इन कोशिकाओं पर उपचार के प्रभाव पर शोध के लिए एक उपयुक्त मंच प्रदान करता है । उपकला कोशिकाओं की फिजियोलॉजी अक्सर गैर-धाराप्रवाह स्थितियों में अध्ययन किया जाता है; हालांकि, इस दृष्टिकोण प्राकृतिक घाव भरने की स्थिति के समान नहीं हो सकता है । यांत्रिक अर्थ द्वारा उपकला अखंडता में खलल डालना एक यथार्थवादी मॉडल उत्पन्न करता है, लेकिन आणविक तकनीकों के आवेदन में बाधा हो सकती है. नतीजतन, सूक्ष्म आधारित तकनीक इन विट्रो में उपकला कोशिका प्रवास का अध्ययन करने के लिए इष्टतम हैं । यहां हम विस्तार से दो विशिष्ट तरीकों, कृत्रिम घाव खरोंच परख और कृत्रिम प्रवासन सामने परख, कि मात्रात्मक और गुणात्मक डेटा क्रमशः प्राप्त कर सकते हैं, उपकला कोशिकाओं के प्रवासी प्रदर्शन पर.
Introduction
कोशिका प्रवास घाव भरने के लिए आवश्यक है, के रूप में यह उपकला अंतर और बाधित सतह की बहाली के अंतिम बंद होने के लिए जिंमेदार है1। पशु मॉडलों में कृत्रिम घावों प्रदर्शन के पास शारीरिक परिस्थितियों में इस जटिल प्रक्रिया की प्रतिकृति के लिए अनुमति देता है2. हालांकि, इस दृष्टिकोण अक्सर महंगा और जटिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में परिणाम, कि संभावित रूप से अलग प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए परिशुद्धता कमी, घाव भरने की प्रक्रिया की जटिल प्रकृति के कारण.
इन विट्रो में उपकला कोशिका लाइनों की संस्कृति भूमिका है कि इन कोशिकाओं को घाव भरने में खेलते हैं और सेल प्रवासी व्यवहार पर उपचार के प्रभाव पर शोध के लिए पशु मॉडल के लिए एक उपयोगी विकल्प प्रदान करता है । उपकला कोशिकाओं के फिजियोलॉजी अक्सर गैर-धाराप्रवाह संस्कृतियों का उपयोग कर आणविक तकनीक द्वारा अध्ययन किया जाता है3,4,5,6; हालांकि, उपकला अखंडता के विघटन आमतौर पर ठीक यांत्रिक चीरा द्वारा हासिल की है. कोशिका संस्कृति में, यह मतलब है कि कोशिकाओं की नगण्य संख्या घाव अंतर को उजागर किया जा सकता है, और वे आणविक जीवविज्ञान की तकनीक के लिए एक बहुत छोटा सा नमूना प्रतिनिधित्व करते हैं । हालांकि, इन घावों सूक्ष्म पैमाने पर अध्ययन किया जा सकता है, कुछ उपकला कोशिका लाइनों के सहज प्रवासी गुणों का लाभ उठाते हुए, जैसे मिंक फेफड़ों की उपकला कोशिका (Mv1Lu) या अनायास अमरता मानव keratinocyte (HaCaT) सेल लाइनों.
यहाँ हम माइक्रोस्कोपी के लिए एक विधि वर्णित है कि घाव भरने के संदर्भ में उपकला कोशिकाओं के प्रवास पर मात्रात्मक डेटा को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त है3,4,7,8. इसके अलावा, हम अतिरिक्त विधियां प्रस्तुत करते है जो प्रवास के दौरान उपकला monolayers पर होने वाले गुणात्मक आणविक और रूपात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने में सहायक होती हैं । कुल मिलाकर, इन तरीकों दोनों गतिशीलता और रूपात्मक उपकला कोशिका व्यवहार और घाव भरने के दौरान उपचार के लिए प्रतिक्रिया के साथ शामिल परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक रूपरेखा प्रदान करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
त्वचा या श्लेष्मा झिल्ली व्यवधान पर, बैरियर समारोह fibroblasts या उपकला और प्रतिरक्षा कोशिकाओं सहित कई कोशिका प्रकार, की क्रियाओं द्वारा बहाल किया जाता है. संयुक्त रूप से, इन कोशिकाओं को एक जटिल apoptosis शामिल प्र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रयोगशाला के पुराने सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं जो इन तकनीकों को अपने वास्तविक राज्य में सुधार और परिष्कृत करने में मदद करते हैं: Dr. सेलिया मार्टिनेज-मोरा; डॉ. अण्णा Mrowiec, डॉ. Catalina Ruiz-Cañada आणि डॉ. Antonia Alcaraz-García. हम दृढ़ता से इन तकनीकों के विकास का समर्थन करने के लिए अस्पताल Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca के लिए ऋणी हैं । इसके अलावा Instituto डी सैलड कार्लोस III, Fondo डी Investigaciones Sanitarias । योजना Estatal i + मृ + i और Instituto de सैलड कार्लोस III-Subdirección जनरल डे Evaluación y फोमेंटो de la Investigación (अनुदान सं.: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos फेडर “ऊना मनेरा डे hacer यूरोपा”. हम भी Universidad de मर्सिया, IMIB-Arrixaca और प्रशासनिक सहायता और सहायता के लिए FFIS धंयवाद । अंत में, हम Dr. इसाबेल मार्टिनेज-Argudo और Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, कैंपस Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla ला माँचा, Toledo में अपनी तरह के समर्थन के लिए के लिए एक विशेष धंयवाद देना चाहता हूं जैव चिकित्सा और बायोटेक्नोलॉजी प्रयोगशाला संभव बनाने के लिए इस अखबार का हिस्सा फिल्माया ।
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it?. Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J., Wells, C. M., Parsons, M. . Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally “Alkylating” Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
