Mikroskopie-basierten Methoden für die Beurteilung der Epithelzelle Migration bei der In-vitro- Wundheilung
Summary
Dieses Manuskript wird beschrieben, wie Schnitt-ähnliche Läsionen am kultivierten Epithelzelle Monolagen günstig Modell Heilung in-vitro-, so dass für die Bildgebung durch konfokale gewickelt oder laser-scanning-Mikroskopie, und die bieten qualitativ hochwertige quantitative und qualitative Daten für das Studium Zelle Verhalten und die Mechanismen, die bei der Migration.
Abstract
Zellmigration ist obligatorisch für die Wundheilung. Erstellen von künstlichen Wunden an Tiermodellen Forschung führt oft zu teure und komplizierte experimentelle Verfahren, während möglicherweise fehlt in der Präzision. In-vitro- Kultur von epithelialen Zelllinien bietet eine geeignete Plattform für die Erforschung der Zelle Wanderungsverhalten der Wundheilung und die Auswirkungen der Behandlungen auf diese Zellen. Die Physiologie der Epithelzellen ist oft in nicht-Zusammenfluss Bedingungen untersucht; jedoch kann dieser Ansatz nicht natürliche Wundheilung Bedingungen ähneln. Stören die Epithel-Integrität mit mechanischen Mitteln erzeugt ein realistisches Modell, aber die Anwendung molekularer Verfahren behindern kann. Infolgedessen Mikroskopiertechniken basierend sind optimal für das Studium Epithelzelle Migration in-vitro-. Hier zeigen wir zwei spezifische Methoden, die künstliche Wunde kratzen Assay und der künstlichen Migration vorderen Assay, die quantitative und qualitative Daten über die wandernden Leistung von Epithelzellen bzw. erhalten können.
Introduction
Zellmigration ist erforderlich für die Wundheilung, da es für die endgültige Schließung der epithelialen Lücke und Wiederherstellung der gestörten Oberfläche1verantwortlich ist. Durchführung von künstlichen Wunden in Tiermodellen ermöglicht für die Replikation von diesem komplexen Prozess in in der Nähe von physiologischen Bedingungen2. Dieser Ansatz führt jedoch oft kostspieligen und komplizierten experimentellen Verfahren, die Präzision für die Untersuchung von unterschiedliche Prozesse, aufgrund der komplizierten Natur der Wundheilung Prozess möglicherweise fehlt.
In-vitro- Kultur von epithelialen Zelllinien bietet eine hilfreiche Alternative zu Tiermodelle zur Erforschung der Rolle von diesen Zellen in Wundheilung und die Auswirkungen der Behandlung auf Zelle Wanderungsverhalten. Die Physiologie der Epithelzellen wird oft von molekularen Techniken mit nicht-Zusammenfluss Kulturen3,4,5,6untersucht; die Störung der Epithel Integrität wird jedoch in der Regel durch feine mechanische Ritzlinien erreicht. In der Zellkultur impliziert dies, dass die Wunde Lücke zu vernachlässigende Zahl von Zellen ausgesetzt sein kann, und sie eine zu kleine Probe für molekularbiologische Techniken stellen. Jedoch können diese Läsionen auf der mikroskopischen Skala, unter Ausnutzung der angeborenen wandernden Eigenschaften einige epithelialen Zell-Linien wie die Mink Lunge Epithelzelle (Mv1Lu) oder die Zelle spontan verewigt menschlichen Keratinozyten (HaCaT) untersucht werden Linien.
Hier haben wir eine Methode für die Mikroskopie, die geeignet ist, quantitative Daten über die Migration von Epithelzellen im Rahmen der Wundheilung3,4,7,8. Darüber hinaus präsentieren wir weitere Methoden, die hilfreich sind, qualitativ molekulare und morphologische Veränderungen auf epithelialen Monolagen während der Migration zu studieren. Insgesamt bieten diese Methoden einen Rahmen um die Dynamik und die morphologischen Veränderungen Epithelzelle Verhalten und Reaktion auf Behandlungen mit einbezogen bei der Wundheilung zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Auf Haut oder Schleimhaut-Störungen wird die Barrierefunktion durch die Aktionen der zahlreichen Zelltypen, einschließlich Fibroblasten oder epithelialen und immune Zellen wiederhergestellt. Gemeinsam, diese Zellen durchlaufen einen komplexen Prozess mit Apoptose, Proliferation, Differenzierung und allem, Fibroblasten und epithelialen Zell-Migration, die die ultimative Mechanismus für die Wiederherstellung des gestörten Gewebes verantwortlich ist und die Schließung der oberflächlichen Epithelzellen Lücke<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir wollen durch ältere Mitglieder des Labors geben, die helfen, verbessern und verfeinern Sie diese Techniken in den tatsächlichen Zustand: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada und Dr. Antonia Alcaraz-García. Wir sind verpflichtet, das Hospital Clínico Universitario Virgen De La Arrixaca für unterstützt nachdrücklich die Entwicklung dieser Techniken. Auch das Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Planen Sie Estatal ich + D + I und Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento De La Investigación (Grant-Nr.: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER “Una Manera de Hacer Europa”. Wir danken auch Universidad de Murcia, IMIB Arrixaca und FFI für administrative Unterstützung und Hilfe. Schließlich wollen wir einen besonderen Dank an Dr. Isabel Martínez-Argudo und die Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico De La Fábrica de Armas, Universidad Castilla La Mancha Toledo für ihre freundliche Unterstützung in bereitwillig Abtretung geben die Biomedizin und Biotechnologie-Labor den gefilmten Teil dieses Papiers zu ermöglichen.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
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