Summary
本手稿描述了如何在培养的上皮细胞单分子膜切口样病变, 方便模型伤口愈合在体外, 允许成像的共焦或激光扫描显微镜, 并能提供高质量定量和定性数据, 用于研究细胞行为和参与迁移的机制。
Abstract
细胞迁移是伤口愈合的一个必需的方面。在研究动物模型上制造人工伤口往往导致昂贵和复杂的实验程序, 但可能缺乏精确性。体外上皮细胞系的培养为研究创面愈合过程中细胞迁移行为和治疗对这些细胞的影响提供了一个合适的平台。上皮细胞的生理学在 non-confluent 条件下经常被研究;然而, 这种方法可能不像自然伤口愈合的条件。通过机械手段破坏上皮细胞的完整性产生了一个现实的模型, 但可能会阻碍分子技术的应用。因此, 显微技术是最理想的研究上皮细胞迁移的体外.在这里, 我们详细介绍了两种具体的方法, 人工伤刮法和人工迁移前分析法, 可以分别获得定量和定性的数据, 对上皮细胞的迁移性能。
Introduction
细胞迁移是需要的伤口愈合, 因为它是负责最后关闭的上皮间隙和恢复破坏表面1。在动物模型中执行人工伤口允许在近生理条件下复制这个复杂的过程2。然而, 这种方法往往导致昂贵和复杂的实验程序, 可能缺乏精确的研究不同的过程, 由于复杂的性质, 伤口愈合过程。
体外上皮细胞系的培养为研究这些细胞在创伤愈合中所起的作用以及治疗对细胞迁移行为的影响提供了一种有益的替代动物模型。利用 non-confluent 培养的分子技术, 经常研究上皮细胞的生理特性3,4,5,6;然而, 上皮完整性的破坏通常是通过细微的机械切口来实现的。在细胞培养中, 这意味着可忽略的细胞数可能暴露在伤口间隙, 它们代表了一个太小的样本分子生物学技术。然而, 这些病变可以在显微镜下进行研究, 利用一些上皮细胞系的固有迁移特性, 如水貂肺上皮细胞 (Mv1Lu) 或自发永生化的人角质形成细胞 (HaCaT)。线.
在这里, 我们描述了一种显微镜方法, 它是适合获得定量数据的上皮细胞迁移在伤口愈合的情况下3,4,7,8。此外, 我们提出的其他方法, 有助于研究的定性分子和形态学的变化发生在上皮膜的迁移。总的来说, 这些方法提供了一个框架来研究的动力学和形态学的变化涉及上皮细胞的行为和反应的治疗过程中伤口愈合。
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Protocol
1. 定量研究的人工伤口划痕法
- 细胞单层制备
- 在无菌条件下工作, 用血清补充培养基在培养瓶中种 Mv1Lu 或 HaCaT 上皮细胞。每24-48 小时刷新一次介质。在单元格达到80% 汇合后, 使用适当的方法分离单元格,即, trypsinization9。
注: Mv1Lu 和 HaCaT 上皮细胞系分别用 EMEM 和 DEMEM 培养基培养, 并辅以2毫米 l-谷氨酰胺, 在37° c 下孵育 5% CO2的受控气氛。每一个细胞线必须进行彻底的检测, 以确定细胞浓度和时间需要达到完全70-100。通常为 Mv1Lu 或 HaCaT 细胞, 2-4 x 104或 4-6 x 104单元格/好, 分别在 175 cm2培养烧瓶中播种, 在80% 汇合处的收益率高达 35 x 106 Mv1Lu 或 1 x 107 HaCaT 单元格。 - 在12井或24井培养板, 种子在每井2毫升的细胞。每24-48 小时刷新一次介质, 确保电池数量足够高, 可以在2或3天后达到100% 汇合。
- 细胞到达汇合处后, 取出血清补充培养基, 用新鲜无血清培养基冲洗两次。在刮伤前24小时将细胞保持在无血清培养基中。
注: Mv1Lu 或 HaCaT 细胞没有特殊的承印物要求;然而, 对于易在无血清条件下自发分离的细胞系, 使用聚 l-赖氨酸溶液的培养板表面的预应考虑为10。
- 在无菌条件下工作, 用血清补充培养基在培养瓶中种 Mv1Lu 或 HaCaT 上皮细胞。每24-48 小时刷新一次介质。在单元格达到80% 汇合后, 使用适当的方法分离单元格,即, trypsinization9。
- 单层刮伤
- 在无菌环境中工作, 通过牢固地拖动20µL 或200µL 无菌微尖端的窄端, 根据所需的划痕宽度, 从头开始培养单层。保持尖端与培养面垂直, 最大限度地提高间隙均匀性。
- 将培养皿放置在深色表面上, 以清楚地监视细胞单分子。如果需要, 在每个井上执行两个垂直划痕 (十), 以研究多达4迁移区。
- 通过轻轻去除培养基, 轻轻地加入新鲜无血清培养基, 洗涤分离细胞。重复两次, 或直到大多数未连接的单元格被移除。
- 在无菌环境中工作, 通过牢固地拖动20µL 或200µL 无菌微尖端的窄端, 根据所需的划痕宽度, 从头开始培养单层。保持尖端与培养面垂直, 最大限度地提高间隙均匀性。
- 实验程序和数据收集
- 采用一台倒置的相衬显微镜, 结合 CCD 相机, 以每井的划痕间隙为中心的4前处理参考图像。通过将显微镜场的边缘与划痕的相邻交叉点对齐, 选择感兴趣区域。
注意: 通常, 图像是使用10x 放大倍数和 1280 x 1024 像素图像大小获取的。如上所述, 选择感兴趣的区域有助于方便地定位和验证每井4测量。 - 一旦所有的图像获得, 指定治疗井;用含有选定处理的新鲜培养基在井中交换培养基。
注: 另外, 对于不干扰培养基同质性的化学品或化合物, 可以直接将治疗接种到培养基中。 - 孵育刮板 (37 ° c 与控制气氛包含 5% CO2), 直到观察到的条件达到90% 划痕间隙闭合。避免完全关闭。
注: 总间隙闭合使后处理图片收集无法检测, 无法确定间隙闭合的时间基准。在 Mv1Lu 或 HaCaT 细胞的情况下, 需要16-19 小时达到90% 汇合。 - 通过固定细胞来阻止细胞迁移;在 PBS 中用1毫升4% 福尔马林轻轻地取代实验培养基。在 RT 处孵育15分钟。
- 清洗细胞去除过量福尔马林;用新的 PBS 将溶液轻轻地替换在井中。重复至少两次。
注: 在这个阶段, 在密封之后, 板材可以被存放在4° c 无限期地。 - 从划痕后捕获的原始参考区域中对每一个井后的参考图像进行处理。使用相同的设备 (倒置光学相衬显微镜, 结合 CCD 相机) 和匹配的图片设置 (放大和数字分辨率/密度)。
注意: 对于单独迁移并填补间隙的单元格, 独立于相干锋的形成 (例如, MDA-MB-231 乳腺癌人细胞), 时效图像可能允许计算单个细胞迁移速度。
- 采用一台倒置的相衬显微镜, 结合 CCD 相机, 以每井的划痕间隙为中心的4前处理参考图像。通过将显微镜场的边缘与划痕的相邻交叉点对齐, 选择感兴趣区域。
- 图像分析与迁移量化
- 使用图像处理软件 (例如, ImageJ), 定义划痕间隙限制, 并确定在预处理图片中多达四测量的间隙表面。将数据记录为 "预处理间隙曲面" (PREGAP)。对后处理图片重复相同的过程。将数据记录为 "后处理间隙曲面" (POSTGAP)。
- 使用 ImageJ 打开录制的图像。在 "图像" 菜单中, 将图像类型设置为8位。在 "进程" 菜单中, 转到 "过滤器" 子菜单并应用 "方差" 过滤。
- 在 "图像" 菜单中, 输入 "调整" 子菜单, 并将阈值设置为黑白 (B 和 #38; W), 确保未选中 "暗背景"。在 "进程" 菜单中, 转到 "二进制" 子菜单, 然后选择 "填充孔"。
- 在 "分析" 菜单中, 选择 "设置测量" 并激活 "区域"。然后绘制在迁移边缘轮廓之后的可测量区域, 从而划定间隙。
- 在 "分析" 菜单中, 选择 "分析粒子" 并记录绘制区域表面的 "总面积" 值。
- 在电子表格中引入 PREGAP 和 POSTGAP 的总面积值, 以量化每个样本集的绝对迁移, 作为间隙表面测量的差异: PREGAP − POSTGAP [任意单位]。另外, 将每个条件的绝对迁移数据规范化为控制样本: (采样/控制) * 100 [%]。
注意: 对于单独迁移和填充间隙的单元格, 独立于相干锋的形成, (例如, MDA-MB-231 的乳腺癌人细胞), 绝对迁移可以通过计数细胞侵入中心地带, 无论是在控制或处理过的样品。 - 绘制量化输出 (请参见图 1)。必要时进行统计分析。
- 使用图像处理软件 (例如, ImageJ), 定义划痕间隙限制, 并确定在预处理图片中多达四测量的间隙表面。将数据记录为 "预处理间隙曲面" (PREGAP)。对后处理图片重复相同的过程。将数据记录为 "后处理间隙曲面" (POSTGAP)。
2. 地形研究的人工迁移前沿试验
- 细胞单层制备
- 在无菌条件下工作, 将一层消毒的圆形片放在空的培养基中, 直到盘子表面完全覆盖。
注: 最多12和33片适合5厘米和10厘米直径的板材, 分别。 - 在培养基上, 在2或3天后, 轻轻地将足够数量的细胞聚集在一起, 使100% 汇合。确保没有片重叠相邻的片和防止片的浮动, 应用温和的压力与无菌微提示。每24-48 小时刷新介质。
注意: 每一个细胞线必须进行彻底的检测, 以确定细胞浓度和时间需要达到完全70-100。通常为 Mv1Lu 或 HaCaT 单元格, 分别为 2-3 x 106或 2.5-4 x 106 cells/10 cm 直径板。对于较小的板材, 必须缩小单元格数。 - 细胞到达汇合处后, 取出血清补充培养基, 用新鲜无血清培养基代替。在进行人工伤口前, 将细胞保持在无血清培养基中24小时。
注: Mv1Lu 或 HaCaT 细胞没有特殊的承印物要求;然而, 对于易在无血清条件下自发分离的细胞系, 使用聚 l-赖氨酸溶液预的培养表面应考虑为10。
- 在无菌条件下工作, 将一层消毒的圆形片放在空的培养基中, 直到盘子表面完全覆盖。
- 单层伤
- 使用无菌镊子, 轻轻地移动一个片到一个干净的10厘米板含有新鲜的无血清培养基。用镊子在外围片, 避免损坏单层。避免过度的压力, 可能导致片破损。
- 通过在片中心的横线上拖动一条消毒的刀片来制造人为的伤口。拖3-4 毫米来回, 为了完全删除中央单层带。确保没有细胞残骸附着在受伤的边缘。
注: 在直径为12毫米的圆片上, 切口是在片的中部进行的。确保在主前侧留有足够大 (至少2毫米宽) 的细胞, 以避免片在以下步骤中倾斜。 - 将受伤的片与面对向上的细胞转移到一个干净的6井板上, 其中含有至少2毫升新鲜无血清培养基。可容纳4受伤的片/井。
- 用新鲜无血清培养基轻轻冲洗两次, 去除分离细胞。
- 实验程序和取样
- 用含有选定处理的新鲜培养基轻轻地在井中交换培养基。
注: 另外, 对于不干扰培养基同质性的化学品或化合物, 可以直接将治疗接种到培养基中。谨慎行事, 避免任何潜在的细胞脱离。 - 保持板在细胞孵化器 (37 ° c, 5% CO2) 为期望的实验时间。
- 通过固定细胞来阻止细胞迁移;在 PBS 中用1毫升4% 福尔马林轻轻地取代实验培养基。在 RT 处孵育15分钟。
注: 对于时间课程的实验, 从培养基中取出样品, 并将其固定在一个单独的盘子中, 以避免甲醛烟雾影响其他的, 正在进行的实验条件。 - 清洗细胞去除过量福尔马林;用新的 PBS 将溶液轻轻地替换在井中。重复至少两次。
注: 在这个阶段, 在密封之后, 板材可以被存放在4° c 无限期地。
- 用含有选定处理的新鲜培养基轻轻地在井中交换培养基。
- 免疫荧光 (IF) 和拓扑分析
- 如在其他地方所描述的那样对个别片进行染色和成像3,4,11。
- Permeabilize 在 PBS 的0.3% 海卫 X-100 溶液中浸泡片10分钟。
- 使用以下阻断液块30分钟: 0.3% 牛血清白蛋白;10% 胎牛血清;5% 脱脂牛奶;0.3% 海卫 X-100 解决方案在 PBS。
注: 不含牛奶的堵塞液可提前准备并贮存在-20 ° c。 - 在潮湿的室内, 在室温下孵育1小时, 在无牛奶的阻断溶液中稀释初级抗体。将片倒置在15µL 抗体溶液中, 以确保适当的分布。
注意: 抗体工作稀释是可变的, 将取决于使用的抗体。例如, 兔 anti-c-六月抗体需要1/100 的稀释。 - 洗涤三次, 蘸片在0.1% 海卫 X-100 解决方案在 PBS。
- 在无奶阻塞缓冲液中稀释的二次抗体中孵育片30分钟。
注意: 抗体工作稀释是可变的, 将取决于使用的抗体。例如, 山羊抗兔 (488) 需要1/400 稀释以获得最佳的分辨率。其他标记试剂, 如笔和 Hoechst-33258 可以添加到孵化缓冲在这个阶段。 - 洗涤三次, 蘸片在0.1% 海卫 X-100 解决方案在 PBS。
- 将片倒置在10µL 安装介质放置 (例如, Vectashield) 放置在显微镜幻灯片上。在夜间将幻灯片留在室温下, 以使安装介质硬化。之后, 在黑暗中无限期地存放在4° c。
- 获得荧光或共聚焦显微镜图像的结构变化发生在迁移前边缘。
注意: 拓扑研究可以通过平铺图片从迁移前到内单层。通过基于软件的局部荧光强度分析, 可以进行半定量研究。
- 如在其他地方所描述的那样对个别片进行染色和成像3,4,11。
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Representative Results
定量研究的人工伤口划痕法: 评估表皮生长因子 (EGF) 促进迁移:
EGF 是一个众所周知的诱导上皮细胞增殖和迁移, 从而对量化迁移促进的积极控制。Mv1Lu 和 HaCaT 细胞单分子膜用于创面划伤的检测, 并获得了预处理图像。在接种 10 ng/毫升 EGF 后, 细胞孵育19小时前固定和后处理图片。通过维持血清饥饿状况, 使其增殖保持在最低限度。用 ImageJ 分析了前后两组图像, 确定了中心间隙区。实验是重复运行的, 每个井都有四测量值。绝对迁移的定量计算作为表面的区别: (PREGAP − POSTGAP)。与受激的 HaCaT 细胞 (图 1B) 相比, 受激 Mv1Lu 细胞 (图 1A) 的迁移潜能更大。不同的细胞来源, 分别是粘膜上皮细胞和皮肤角质形成。
地形研究的人工迁移前沿试验: 骨架构象和空间表达的变化:
细胞迁移涉及细胞骨架结构的持续和深度的改变, 以维持细胞膜的位移。HaCaT 细胞单分子膜在控制和刺激条件下用于迁移前的测定。EGF 加强骨架动力学的治疗, 这是观察, 如果和激光扫描显微镜 (LSM;图 2A)。EGF 的治疗也导致了强大的丝裂原活化蛋白 (MAP) 激酶信号和 c-钧过度表达。平铺 LSM 图像允许配置空间模式。通过软件图像分析, 可以很容易地在迁移前的相邻单元中增加表达 c-JUN 的能力;在这里, 我们实现了绿色通道的彩虹尺度, 它对应于 c 钧标记 (图 2B)。
图1。在 Mv1Lu 和 HaCaT 细胞中促进 EGF 的迁移.Mv1Lu (A) 和 HaCaT (B) 细胞的相对比显微镜图像在控制条件下进行, 与 10 ng/mL EGF 治疗的细胞图像相比, 无血清条件下 19 h。代表显微显示了20µL 微尖伤后的划痕间隙和闭合程度。放大倍数 = 10x;缩放条 = 100 µm. 细胞迁移被定量化并且代表作为治疗和控制样品的区域区别的变化在每种化验 (任意单位;AU)。剧情代表八独立测量为每个情况。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。肌动蛋白纤维和 c-钧细胞表达变化促进 EGF 在迁移 HaCaT 单元.(A) 隔夜 10 ng/毫升 EGF 治疗促进肌动蛋白丝在迁移 HaCaT 细胞构象的深刻变化。细胞在迁移前的控制条件描绘了一个严密结构肌动蛋白丝骨架, 而细胞处理的 EGF 显示较差肌动蛋白花丝组织在迁移前。放大倍数 = 63x;缩放条 = 20 µm. F-肌动蛋白是 color-coded 红色, 赫斯特用蓝色表示。(B) 当免疫荧光与 LSM 成像结合使用时, 研究了 10 ng/毫升 EGF 在移植 HaCaT 细胞后的表达, 平铺成分揭示了空间表达模式。将 c-六月荧光 (green) 的图像转换成彩色, 以显示 c-六月染色的强度。颜色彩虹标度代表了 c-六月的荧光强度, 对应于 EGF 和控制的右面板上的 colormaps。用笔 (红) 和 Hoechst-33258 (蓝) 共染色分别显示细胞结构和细胞核。图像是由共焦显微镜拍摄的。请注意, 在接近迁移阵线的地区, 核 c-6月的表达水平正在上升。缩放栏 = 40 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在皮肤或粘膜的破坏, 屏障功能恢复的行动, 许多细胞类型, 包括成纤维细胞或上皮和免疫细胞。共同, 这些细胞经历了一个复杂的过程, 涉及细胞凋亡, 增殖, 分化, 重要的是, 成纤维细胞和上皮组织迁移, 这是最终的机制, 负责修复被破坏的组织和浅上皮间隙闭合1,12因此, 研究细胞迁移有助于精确描述上皮细胞的生理行为, 同时也确定伤口治疗的调节电位愈合.
在不同的研究动物模型上执行人工伤口可以在近生理条件下复制这个复杂的过程2, 从而评估某些病理条件或药物的作用处理13。然而, 这种方法通常会导致成本高昂且复杂的物流, 以及繁琐的实验程序, 这些过程可能会以延迟的方式13生成数据。相反,体外细胞培养为研究创伤愈合过程中的细胞行为提供了一个更方便的框架。虽然上皮细胞的原代细胞培养是可行的选择, 但很难获得和处理细胞, 这可能会使数据收集复杂化。例如, 除了对初级文化的典型的 low-passage 限制外, 初级人类角质形成细胞需要一个成纤维的喂养层, 以促进生长在试管中3。相反, 成熟的上皮细胞培养线, 如 Mv1Lu 或 HaCaT, 构成了一个无障碍的研究模式, 特点的行为和特征, 如在主要培养细胞3,4, 14,15。准确地说, 对于伤口愈合的研究, 这两个细胞线保留了其迁移和阻止增殖的能力的关键特性, 因为在汇合16,17的细胞接触抑制。
划痕分析法是一种可靠和通用的方法来量化不同细胞类型, 特别是上皮细胞和癌细胞的迁移能力。对于癌细胞的情况, 已经提出了用于评估侵袭性电位的划痕方法。然而, 这种方法比起依赖于穿透细胞外基质1819所需的蛋白酶表达式的更具体的方法来作为侵入性指标的时间短。相反, 划痕测定方法对评估上皮细胞的迁移性能和不同处理方法对此性状的影响是可靠的。与癌细胞的线条相反, 它经常表现出很弱的凝聚力和在几个层次上生长的能力, Mv1Lu、HaCaT 和其他上皮细胞系形成紧密联系的 "生长群岛", 它们在一个过程中扩展它们的边缘, 这取决于增殖, 但更重要的是细胞迁移。因此, 通常使用稀疏或 sub-confluent 细胞密度条件来研究不同处理对迁徙生理学的影响;特别是当随后的分子生物学技术被应用, 因为这个细胞环境最大限度地减少接触抑制, 同时最大化的比例积极迁移细胞。然而, 对于上皮细胞, non-confluent 条件构成了排除重要的预先存在的接触抑制影响的风险, 例如以表观遗传调节的形式。因此, 为了研究伤口愈合, 汇合条件赋予模型增加保真度。
为了获得精确的估计, 应解决影响上皮细胞层构象或促进移徙的伴随因素。当汇合是渴望的, 它是重要的避免过度的细胞密度或多层的文化, 因为这些情况可能消极地影响。因此, 在无血清的培养基中, 或通过添加像丝裂霉素 C 这样的化学物质, 不可逆地阻止细胞增殖, 通过 DNA 交联3,20, 21. 使用一个或另一个依赖于特定的细胞系的行为;丝裂霉素 C 是特别指出, 当减少血清补充需要, 以避免大规模细胞脱离。这是 HEK-293T 细胞的情况下, 预的培养表面使用聚 l-赖氨酸是一个很好的选择, 以避免 Mytomycin C 治疗。还需要解决可能改变移徙的炎症因素的释放问题。采用了不同的策略, 主要是基于硅胶插入物来模拟用划痕法测定的上皮表面的破坏22。虽然插入产生存在的差距, 允许细胞迁移后, 去除硅胶片, 刮伤方法直接依赖于去除一些上皮单层产生的差距。对如何产生间隙的偏好依赖于刀片的能力, 以保护文化表面涂层 (即, 培养板或多聚 l-赖氨酸) 在划伤期间的损害, 同时也尽量减少从损坏的细胞释放的因素, 可能破坏单元格区域性行为23。尽管这些特性对于某些实验性的设置可能是有用的,即评估癌细胞迁移的能力, 但根据我们的经验, 我们发现在伤口愈合研究中使用刀片是有很大的缺陷的。Mv1Lu 细胞能够附着在硅酮的外表面, 这会导致在去除硅胶件时无意中撕裂细胞单层。此外, 尽管 HaCaT 细胞不附着在硅胶上, 但我们发现这些细胞迁移到插入产生的间隙的能力减弱了。在这个程度上, 炎症和迁移是紧密联系在一起的反应, 这些似乎是关键的结合在一起的伤口愈合的 HaCaT 细胞。此外, 由于应用塑料针尖来刮伤培养表面对细胞重新填充间隙的能力没有明显的影响, 在 HaCaT 细胞的情况下, 这种行为表明, 胞外基质残留在间隙可能引导迁移与真皮在自然伤口中相似的方式。然而, 变异的主要来源仍然是抓挠过程本身, 因为使用塑料尖端使伤口并不总是呈现相同的大小差距。我们观察到在不同样本中的变异量高达 20%, 原因是压力和针尖在刮擦时的位置不一致。这些变化可以通过伤害单层和一个更加刚性的对象来解决;然而, 塑料表面的任何划痕都会危及细胞的自由运动。因此, 在计算迁移时必须考虑初始划痕的变化;通常, 通过增加每个条件的测量数。
除了量化, 应用伤人程序连同经典的如果技术可以定性地评估细胞迁移的分子过程。片上皮细胞生长的能力是众所周知的;在过去, 划痕测定的变化涉及的细胞迁移片暴露在不同的条件, 然后固定和染色, 以比较在伤口从头实验设置24。在这里, 我们发现, 创造广泛的差距, 在单分子生长的片允许延长实验时间课程3,4,7。此外, 在这些实验中, 如果提高程序的检测能力, 以潜在的方式研究所涉及的任何精确的蜂窝和亚细胞机制, 并且它只受适用于这种技术的抗体的可用性和细胞的利益。在片上使用的样品如安装在显微镜幻灯片上, 可以延长保存。这有助于需要长时间学习的实验设置的应用, 如在这里和其他地方展示的 "平铺" 方法3,4,7。"平铺" 策略将空间模式与时态数据集成在一起, 用于重建迁移所涉及的机制, 而软件分析工具的实施可以提供基于局部荧光的半定量评估强度, 进一步丰富了所获得信息的质量。在我们的经验, 瓷砖也提供了研究细胞位置信息的可能性, 表达蛋白质在这种类型的化验。这个位置信息已经被证明是至关重要的理解和更好地翻译不同的药物对细胞迁移的影响, 特别是在设置的位置上皮细胞是非常重要的, 以确定其迁移行为3 ,4,14,15。
所描述的两个过程都显示了很大的方便, 简单的实现, 以及生产质量数据。因此, 这些方法, 是基于显微镜研究, 提供了一个独特的和强大的框架, 研究的动力学和形态学变化涉及的上皮细胞的行为和反应的治疗过程中伤口愈合。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢实验室的老成员, 帮助改善和完善这些技术的实际状态: Dr. 西莉亚。Dr. 安娜 Mrowiec, Dr., 拉肯纳和 Dr.-加西亚。我们感谢医院 Clínico 体育馆圣女 Arrixaca 大力支持这些技术的发展。还有干杯卡洛斯三世, 基金 de 门多萨市 Sanitarias。计划国家 i + D + i 和干杯研究所-Subdirección 总 de Evaluación y 调值研究 (批准号: PI13/00794);www.isciii.es. Fondos 菲德 "manera de hacer 欧罗巴"。我们还感谢穆尔西亚、IMIB-Arrixaca 和 FFIS 的行政支助和援助。最后, 我们要特别感谢 Dr. 伊莎贝尔-马丁内斯-Argudo 和 Facultad de Ciencias Ambientales Bioquímica, 校园 Tecnológico de Fábrica 武器, 卡斯蒂利亚 la 恰尔, 托莱多为他们的亲切的支持自愿割让生物医学和生物技术实验室, 使本论文的拍摄部分成为可能。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
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