Summary
Dette manuskript beskriver hvordan snit-lignende læsioner på kulturperler epitelcelle encellelag bekvemt model sår healing i vitro, giver mulighed for billeddannelse af Konfokal eller laser scanning mikroskopi, og som kan give høj kvalitet kvantitative og kvalitative data for at studere både celle adfærd og de mekanismer, der er involveret i migration.
Abstract
Celle migration er et obligatorisk aspekt for sårheling. At skabe kunstige sår på forskning dyremodeller ofte resultater i dyre og komplicerede eksperimentelle procedurer, mens potentielt mangler i præcision. In vitro kultur epitelcelle linjer udgør en passende platform for forske celle vandrende opførsel i sårheling og virkningen af behandlinger på disse celler. Fysiologi af epitelceller er ofte studerede i ikke-sammenflydende betingelser; dog kan denne tilgang ikke ligne naturlige sårheling betingelser. Forstyrre epitel integritet mekanisk genererer en realistisk model, men kan haemme anvendelsen af molekylærbiologiske teknikker. Mikroskopi baseret teknikker er derfor optimal for at studere epitelcelle migration in vitro-. Vi detalje her to specifikke metoder, kunstige sår scratch analysen og kunstige migration front assay, der kan få kvantitative og kvalitative data, henholdsvis på vandrende udførelsen af epitelceller.
Introduction
Celle migration er nødvendig for sårheling, som er ansvarlig for den endelige lukning af epitel hullet og restaurering af den forstyrrede overflade1. Udfører kunstige sår i dyremodeller giver mulighed for replikering af denne komplekse proces i nærheden af fysiologiske forhold2. Men denne tilgang ofte resulterer i dyre og komplicerede eksperimentelle procedurer, der potentielt mangler præcision for studiet af adskilte processer, på grund af den indviklede karakter af sårheling proces.
In vitro kultur epitelcelle linjer giver et nyttigt alternativ til dyremodeller for forske disse celler rolle i sårheling og effekten af behandling på celle vandrende adfærd. Fysiologi af epitelceller er ofte studerede af molekylære teknikker, der anvender ikke-sammenflydende kulturer3,4,5,6; afbrydelse af epitel integritet opnås normalt ved fine mekaniske indsnit. I cellekultur indebærer dette, at ubetydelige antal celler kan blive udsat for sår hul, og de repræsenterer en for lille stikprøve til molekylærbiologiske teknikker. Men disse læsioner kan studeres på mikroskala, drage fordel af de medfødte vandrende egenskaber af nogle epitelial cellelinjer, såsom den Mink lunge epitelcelle (Mv1Lu) eller cellen spontant udødeliggjort humane keratinocytter (HaCaT) linjer.
Her beskrevet vi en metode til mikroskopi, der er egnet til at få kvantitative data migration af epitelceller i forbindelse med sårheling3,4,7,8. Desuden præsenterer vi yderligere metoder, der er nyttige at studere kvalitativt molekylære og morfologiske ændringer forekommer på epitelial encellelag under overflytningen. Samlet set giver disse metoder en ramme for at studere både dynamik og morfologiske ændringer involveret med epitelcelle adfærd og reaktion på behandlinger i løbet af sårheling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kunstige sår Scratch Assay for kvantitative undersøgelser
- Celle éncellelag forberedelse
- Arbejder under sterile forhold, frø og dyrke Mv1Lu eller HaCaT epitelceller i kultur kolber bruge serum-suppleret medium. Opdater medium én gang hver 24-48 h. Efter cellerne nå 80% sammenløb, frigøre celler ved hjælp af en passende metode, dvs., trypsinization9.
Bemærk: Mv1Lu og HaCaT epitelial cellelinjer er kulturperler bruger Maibritt VITH og DEMEM næringssubstrat, henholdsvis, suppleret med 2 mM L-glutamin, og inkuberes ved 37 ° C med en kontrolleret atmosfære med 5% CO2. Hver cellelinje skal analyseres grundigt for at bestemme celle koncentration og timing, der kræves for at nå fuld confluency. Typisk for Mv1Lu eller HaCaT celler, 2-4 x 104 eller 4-6 x 104 celler/brønd, udsås henholdsvis i en 175 cm2 kultur kolbe, og 80% sammenløbet udbytter op til 35 x 106 Mv1Lu eller 1 x 107 HaCaT celler. - I enten en 12-godt eller 24-godt kultur plade, frø i hver brønd 2 mL af celler. Opdater medium, når hver 24-48 h. sikre celle numre er høj nok til at nå 100% sammenløbet efter 2 eller 3 dage.
- Når cellerne kommer til sammenløbet, fjerne serum-suppleret medium og vaskes to gange med frisk serumfrit medium. Hold celler i serumfrit medium for 24 timer før den ridse.
Bemærk: Mv1Lu eller HaCaT celler ikke har særlige substrat krav; men for cellelinjer modtagelige for afmontering spontant i serumfrit betingelser, før overfladebehandling af kultur plade overfladen ved hjælp af en poly-L-lysin løsning bør overvejes10.
- Arbejder under sterile forhold, frø og dyrke Mv1Lu eller HaCaT epitelceller i kultur kolber bruge serum-suppleret medium. Opdater medium én gang hver 24-48 h. Efter cellerne nå 80% sammenløb, frigøre celler ved hjælp af en passende metode, dvs., trypsinization9.
- Éncellelag ridser
- Arbejder i et sterilt miljø, scratch kultur éncellelag ved kraftigt at trække den smalle slutningen af en 20 µL eller 200 µL steril mikropipette tip, afhængigt af den ønskede scratch bredde. Holde spidsen vinkelret på kultur overfladen for at maksimere afstanden homogenitet.
- Placer kultur plader over en mørk overflade klart overvåge celle éncellelag. Hvis det er nødvendigt, skal du udføre to vinkelrette ridser (Kors-formet) på hver brønd at studere 4 migration områder.
- Vask fritliggende celler ved forsigtigt at fjerne næringssubstratet og forsigtigt tilføje frisk serumfrit medium. Gentag to gange, eller indtil mest løstliggende celler er blevet fjernet.
- Arbejder i et sterilt miljø, scratch kultur éncellelag ved kraftigt at trække den smalle slutningen af en 20 µL eller 200 µL steril mikropipette tip, afhængigt af den ønskede scratch bredde. Holde spidsen vinkelret på kultur overfladen for at maksimere afstanden homogenitet.
- Eksperimentel procedure og dataindsamling
- Tage op til 4 forbehandling reference billeder centreret på scratch hullet fra hver brønd med en omvendt fase-kontrast mikroskop indarbejde en CCD kamera. Vælg interesse områder ved at tilpasse kanten af mikroskopfelt til tilstødende skæringspunktet for ridser.
Bemærk: Typisk, billeder er erhvervet ved hjælp af en 10 x forstørrelse og en 1.280 x 1.024 pixel billedstørrelse. At vælge interesse områder som beskrevet ovenfor hjælper til nem lokalisering og validering af op til 4 målinger pr. brønd. - Når alle billeder er erhvervet, udpege behandling brønde; udveksle medium i brøndene med friske medium, der indeholder udvalgte behandlinger.
Bemærk: Alternativt for kemikalier eller forbindelser, der ikke forstyrrer næringssubstratet homogenitet, behandlinger kan podes direkte ind i substratet. - Inkuber ridset pladen (37 ° C med kontrolleret atmosfære indeholdende 5% CO2) indtil betingelser under observation nå 90% scratch gap lukning. Undgå fuld lukning.
Bemærk: Samlede gap lukning annullerer efterbehandling billedsamling som reference områder er ikke kan påvises og tid reference for gap lukning ikke kan fastslås. I tilfælde af Mv1Lu eller HaCaT celler skal 16-19 h nå 90% sammenløb. - Stop celle migration ved at fastsætte cellerne; forsigtigt erstatte det eksperimentelle næringssubstratet med 1 mL af 4% formalin i PBS. Inkuber i 15 min. ved RT.
- Vaske cellerne for at fjerne overskydende formalin; forsigtigt erstatte løsning i brøndene med friske PBS. Gentag mindst to gange.
Bemærk: På dette stadium, efter forsegling, plader kan opbevares ved 4 ° C på ubestemt tid. - Tage efterbehandling reference billeder af hver brønd fra de oprindelige reference områder erobret efter aflysning. Bruge samme udstyret (inverterede optisk fasekontrast-mikroskop indarbejde et CCD kamera) og tilsvarende billedindstillinger (forstørrelse og digital opløsning/tæthed).
Bemærk: For celler, overføre individuelt og fylde hullet uafhængigt af dannelsen af en sammenhængende front (fx, MDA-MB-231 brystkræft menneskelige celler), tidsforløb billeder kan tillade beregning af individuelle celle migration hastigheder.
- Tage op til 4 forbehandling reference billeder centreret på scratch hullet fra hver brønd med en omvendt fase-kontrast mikroskop indarbejde en CCD kamera. Vælg interesse områder ved at tilpasse kanten af mikroskopfelt til tilstødende skæringspunktet for ridser.
- Billedanalyse og kvantificering af migration
- Bruge billedbehandling software (fxImageJ), definere scratch gap grænser og bestemme gap overfladen for op til fire målinger i forbehandling billeder. Registrering af data som "forbehandling gap overflade" (PREGAP). Gentag den samme procedure for efterbehandling billeder. Registrering af data som "efterbehandling gap overflade" (POSTGAP).
- Åbn det optagede billede ved hjælp af ImageJ. I menuen "billede" indstille billedtypen til 8 bit. I menuen "processen" gå til "filtre" undermenu og anvende "afvigelse" filtrering.
- I menuen "billede" indtaste "justere" undermenu og sæt tærsklen til sort og hvid (B & W), "Mørk baggrund" er ikke markeret. Gå til "binær" undermenu i menuen "proces", og vælg "udfylde huller".
- Vælg "sæt målinger" i menuen "analysere" og aktivere "område". Derefter trække området målbare efter overflytning kant konturen dermed afgrænse kløften.
- Vælg "analysere partikler" i menuen "analysere" og "samlet areal" værdier for det udtrukne område overflade.
- Indføre PREGAP og POSTGAP samlede areal værdier i et regneark til at kvantificere absolutte migration for hvert sæt af individuelle prøver som forskellen på gap overflade målinger: PREGAP − POSTGAP [arbitrære enheder]. Derudover normalisere absolutte migration data for hver betingelse til kontrolprøver: (prøve / kontrol) * 100 [%].
Bemærk: For celler, overføre individuelt og fylde hullet uafhængigt af dannelsen af en sammenhængende front, (fx, MDA-MB-231 brystkræft menneskelige celler), den absolutte migration kan beregnes ved at tælle celler invaderer en central strip enten i kontrolelementet eller de behandlede prøver. - Plot kvantificering udgange (Se figur 1). Udføre statistisk analyse, hvis nødvendigt.
- Bruge billedbehandling software (fxImageJ), definere scratch gap grænser og bestemme gap overfladen for op til fire målinger i forbehandling billeder. Registrering af data som "forbehandling gap overflade" (PREGAP). Gentag den samme procedure for efterbehandling billeder. Registrering af data som "efterbehandling gap overflade" (POSTGAP).
2. kunstige Migration Front Assay for topografiske undersøgelser
- Celle éncellelag forberedelse
- Arbejder i sterile forhold, placere et lag af steriliseret runde coverslips i tomme kultur plader, indtil pladens overflade er helt dækket.
Bemærk: Op til 12 og 33 coverslips passer på 5 cm og 10 cm diameter plader, henholdsvis. - På pladen kultur forsigtigt frø en tilstrækkelig mængde af celler i en koncentration, der giver mulighed for 100% sammenløbet efter 2 eller 3 dage. Sørg for, at ingen coverslip overlapper nærliggende coverslips og forhindre coverslips fra flydende ved hjælp af blide tryk med en steril mikropipette spids. Opdater medium hver 24-48 h.
Bemærk: Hver cellelinje skal analyseres grundigt for at bestemme celle koncentration og timing, der kræves for at nå fuld confluency. Typisk for Mv1Lu eller HaCaT celler, er 2-3 x 106 eller 2,5-4 x 106 celler/10 cm-diameter plade, henholdsvis seedet. For mindre plader nedtrappes celle numre. - Når cellerne kommer til sammenløbet, fjerne serum-suppleret medium og erstatte med frisk serumfrit medium. Holde cellerne i serumfrit medium for 24 timer, før den kunstige sår er udført.
Bemærk: Mv1Lu eller HaCaT celler ikke har særlige substrat krav; men for cellelinjer modtagelige for afmontering spontant i serumfrit betingelser, før overfladebehandling af kultur overfladen ved hjælp af en poly-L-lysin løsning bør overvejes10.
- Arbejder i sterile forhold, placere et lag af steriliseret runde coverslips i tomme kultur plader, indtil pladens overflade er helt dækket.
- Éncellelag sårede
- Brug steril pincet, forsigtigt flytte en coverslip til en ren 10 cm plade der indeholder friske serumfrit medium. Undgå at beskadige éncellelag ved at holde coverslip i periferien med pincet. Undgå alt for store pres, som kan resultere i coverslip brud.
- Skabe kunstige sår ved at trække en steriliseret barberblad i en tværgående linje over midten af coverslips. Trække 3-4 mm og tilbage, for at helt for at fjerne centrale éncellelag strip. At sikre ingen celle debris forbliver fastgjort til de sårede kanter.
Bemærk: på en 12-mm diameter runde coverslip, snittet er lavet på i midten af coverslip. Sørg for at efterlade en stribe af celler overfor den vigtigste front stor nok (mindst 2 mm bred) at undgå at vippe af coverslip i følgende trin. - Overføre sårede coverslips med celler opad, til en ren 6-godt plade indeholdende mindst 2 mL frisk serumfrit medium. Passe op til 4 sårede coverslips/godt.
- Forsigtigt vaskes to gange med friske serumfrit medium at fjerne fritliggende celler.
- Eksperimentel procedure og prøveudtagning
- Forsigtigt udveksling medium i brøndene med friske medium, der indeholder udvalgte behandlinger.
Bemærk: Alternativt for kemikalier eller forbindelser, der ikke forstyrrer næringssubstratet homogenitet, behandlinger kan podes direkte ind i substratet. Gå videre med forsigtighed for at undgå enhver potentiel celle detachement. - Holde pladen inde i en celle inkubator (37 ° C, 5% CO2) til den ønskede eksperimentelle timing.
- Stop celle migration ved at fastsætte cellerne; forsigtigt erstatte det eksperimentelle næringssubstratet med 1 mL af 4% formalin i PBS. Inkuber i 15 min. ved RT.
NOTE: Tid kursus eksperimenter, fjerne prøverne fra kultur plade og ordne dem i en separat plade til at undgå formalin dampe påvirker de andre, igangværende forsøgsbetingelser. - Vaske cellerne for at fjerne overskydende formalin; forsigtigt erstatte løsning i brøndene med friske PBS. Gentag mindst to gange.
Bemærk: På dette stadium, efter forsegling, plader kan opbevares ved 4 ° C på ubestemt tid.
- Forsigtigt udveksling medium i brøndene med friske medium, der indeholder udvalgte behandlinger.
- Immunofluorescens (IF) og topologiske analyse
- Udføre, hvis farvningen og imaging på individuelle coverslips som beskrevet andetsteds3,4,11.
- Permeabilize i 10 min ved at nedsænke coverslips i 0,3% Triton X-100 opløsning i PBS.
- Blok i 30 min. ved hjælp af følgende blokerende løsning: 0,3% bovint serumalbumin; 10% føtal bovint Serum; 5% skummetmælk; 0,3% Triton X-100 løsning i PBS.
Bemærk: Blokering løsning uden mælk kan forberedes i forvejen og opbevares ved-20 ° C. - Inkuber i 1 time ved stuetemperatur i et fugtigt kammer, med primær antistof fortyndet i mælk-fri blokerende løsning. Placere coverslips hovedet i 15 µL antistof løsning til at sikre korrekt fordeling.
Bemærk: Antistof arbejdsfortynding er variabel og afhænger af antistof i brug. For eksempel, kræver kanin anti-c-Jun antistof en 1/100 fortynding. - Vaskes tre gange ved at dyppe coverslips i i 0,1% Triton X-100 opløsning i PBS.
- Inkubér coverslips i sekundær antistof fortyndet i mælk-fri blokerende buffer i 30 min.
Bemærk: Antistof arbejdsfortynding er variabel og afhænger af antistof i brug. Gede-anti-kanin (488) kræver f.eks en 1/400 fortynding for optimal opløsning. Andre mærkning reagenser som phalloidin og Hoechst-33258 kan føjes til inkubation buffer på dette stadium. - Vaskes tre gange ved at dyppe coverslips i 0,1% Triton X-100 løsning i PBS.
- Mount coverslips hovedet i en 10 µL montering media drop (f.eks.Vectashield) placeret på et objektglas. Forlade dias i mørke ved stuetemperatur natten til montering medium hærdning. Bagefter, opbevares ved 4 ° C i mørke på ubestemt tid.
- Få enten epifluorescensmikroskop eller konfokalmikroskopi billeder af strukturelle forandringer på den overfører forreste kant.
Bemærk: Topologisk undersøgelser kan udføres af flisebelægning billeder fra overflytter forsiden til den indre éncellelag. Semi-kvantitative undersøgelser er muligt af software baseret analyse på lokale fluorescens intensiteter.
- Udføre, hvis farvningen og imaging på individuelle coverslips som beskrevet andetsteds3,4,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kunstige sår Scratch Assay for kvantitative undersøgelser: vurdering af Epidermal vækstfaktor (EGF) fremme af Migration:
EGF er et velkendt inducer af epitelceller spredning og migration, og dermed en positiv kontrol for kvantificering migration forfremmelse. Mv1Lu og HaCaT celle encellelag blev brugt i såret scratch assays og forbehandling billeder blev opnået. Efter podning med 10 ng/mL EGF, blev cellerne inkuberes i 19 h før fiksering og efterbehandling billeder. Spredning blev holdt på et minimum ved at opretholde serum sult betingelser. Både før og efter behandling sæt af billeder blev analyseret ved hjælp af ImageJ og de centrale hullet arealer blev fastsat. Eksperimentet blev kørt i to eksemplarer, registrering af fire målinger for hver brønd. Kvantificering af de absolutte migration blev beregnet som forskellen på overflader: (PREGAP − POSTGAP). Der var en større vandrende potentiale i stimuleret Mv1Lu cellerne (figur 1A) i forhold til de stimuleret HaCaT celler (figur 1B). Forskellene er forklaret af celle kilder, bliver slimhinden epitelceller og hud keratinocytter, henholdsvis.
Kunstige Migration Front Assay for topografiske undersøgelser: variationer i Cytoskeletal kropsbygning og rumlige udtryk for C-Jun:
Celle migration indebærer løbende og dybe ændringer i strukturen cytoskeleton for at opretholde celle fortrængning. HaCaT celle encellelag blev brugt i migration front assays under kontrol og stimulation. Behandling med EGF potentiates cytoskeletal dynamik, som er observeret af hvis og laser scanning mikroskopi (LSM; Figur 2A). EGF behandling resulterer også i robust Mitogen-Activated Protein (kort) kinaser signalering og c-JUN overekspression. Flisebelægning LSM billeder giver mulighed for konfiguration af rumlige mønstre. Øget udtryk for c-JUN på celler støder op til overflytning forsiden kan nemt afsløret af software billedanalyse; her, gennemført vi en regnbue skala for den grønne kanal, hvilket svarer til c-JUN mærkning (figur 2B).
Figur 1. Fremme af migration af EGF i celler, Mv1Lu og HaCaT. Fase-kontrast mikroskopi billeder af de sårede område af Mv1Lu (A) og HaCaT (B) celler blev taget under kontrol betingelser og i forhold til billeder af de celler, der er behandlet med 10 ng/mL EGF til 19 h i serumfrit betingelser. Repræsentative micrographs viser omfanget af scratch gap og lukning fremstillet efter såret med en 20 µL mikropipette spids. Forstørrelse = 10 x; Skalalinjen = 100 µm. celle migration var kvantificeres og repræsenteret som variation af området forskelle mellem behandlinger og kontrolprøver for hver analyse (arbitrære enheder; AU). Plottet er repræsentant for otte uafhængige målinger for hver betingelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Actin filamenter og c-JUN udtryk ændringer fremmes af EGF i overflytter celler, HaCaT. (A) natten over 10 ng/mL EGF behandling fremmer dybtgående ændringer i kropsbygning af actin filamenter i overfører HaCaT celler. Celler forrest migration i kontrol betingelser skildre et stramt struktureret actin filamenter cytoskeleton, mens celler behandles med EGF viser dårlig actin filamenter organisation migration foran. Forstørrelse = 63 x; Skalalinjen = 20 µm. F-Actin er farvekodede rød, og Hoechst er repræsenteret ved en blå farve. (B) når immuno-fluorescens bruges i kombination med LSM imaging til at studere c-JUN udtryk efter 10 ng/mL EGF behandling på overflytter HaCaT celler, flisebelægning kompositioner afsløre rumlige udtryk mønstre. Billeder af c-Jun fluorescens (grøn) blev omdannet til pseudo-farve for at vise intensiteten af c-Jun farvning. Rainbow farveskala repræsenterer fluorescens intensitet for c-Jun, svarende til colormaps på de rigtige paneler for EGF og kontrol. Co farvning med phalloidin (rød) og Hoechst-33258 (blå) blev brugt til at vise cellestruktur og kerner, henholdsvis. Billeder er taget af en Konfokal mikroskop. Bemærk de stigende udtryk niveauer af nukleare c-Jun i områder nærmer sig den overfører front. Skalalinjen = 40 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På huden eller slimhinderne forstyrrelser gendannes barriere funktion af mange celletyper, herunder fibroblaster eller epitel og immun celler handlinger. Conjointly, disse celler undergår en kompleks proces, der involverer apoptose, spredning, differentiering og vigtigere, fibroblast og epitelial celle migration, som er den ultimative mekanisme, der er ansvarlig for genoprettelse af forstyrret væv og den lukning af overfladiske epitelial hul1,12 således, at studere celle migration hjælper netop beskriver den fysiologiske opførsel af epitelceller, mens også bestemme modulerende potentiale behandlinger for sår healing.
Udfører kunstige sår på forskellige forskning dyremodeller giver mulighed for replikering af denne komplekse proces i nærheden af fysiologiske forhold2, og således vurderingen af nogle patologiske tilstande eller virkningerne af farmaceutiske behandlinger13. Men denne tilgang ofte resulterer i dyre og komplicerede logistik, samt belastende eksperimentelle procedurer, der kan generere data i en forsinket mode13. Tværtimod, giver in vitro- cellekultur en mere praktisk ramme for forske opførsel af celler, der er involveret i sårheling proces. Mens primære cellekulturer af epitelceller udgør en farbar vej, kan det være vanskeligt at indhente og håndtere de celler, hvilket kan komplicere dataindsamlingen. For eksempel, ud over den typiske lav-passage begrænsning af primære kulturer savn primære humane keratinocytter en fibroblast fodring lag for vækst i vitro3. Tværtimod, udgør veletablerede epitelcelle kultur linjer, som Mv1Lu eller HaCaT, en hindring-fri forskning model at funktioner adfærd og karakteristika som de primære kultur celler3,4, 14,15. Netop, studere sårheling bevarer disse to cellelinjer vigtige træk i deres evne til at migrere og stoppe spredning på grund af celle til celle kontakt hæmning ved sammenløbet16,17.
Scratch assays er en pålidelig og alsidig metode til kvantificering af de migrerende kapaciteter af forskellige celletyper, især epitel og kræftceller. I tilfælde af kræftceller, blevet scratch-metoden foreslået for vurdering af invasive potentiale. Men denne fremgangsmåde falder kort som en indikator for invasiv sammenlignet med mere specifikke metoder bygger på udtryk for metalloproteases nødvendige for gennemtrængende ekstracellulære matrix18,19. Tværtimod, er scratch assays pålidelige for vurderingen af vandrende udførelsen af epitelceller og effekten af forskellige behandlinger på denne egenskab. I modsætning til kræft celler linjer, som ofte viser dårlig samhørighed og evnen til at vokse på flere lag, Mv1Lu, HaCaT og andre epitelcelle linjer form tæt forbundet "vækst øer", som udvider deres margener i en proces, afhængigt af både spredning, men mere vigtigere på celle migration. Derfor anvendes sparsom eller sub sammenflydende celle tæthed betingelser konventionelt for at studere virkningerne af forskellige behandlinger på de vandrende fysiologi; især når efterfølgende molekylærbiologiske teknikker anvendes, som denne celle minimerer miljø kontakt hæmning mens maksimere forholdet mellem aktivt overfører celler. Dog for epitelceller udgør ikke sammenflydende betingelser den eksklusive vigtigt allerede eksisterende kontakt hæmning påvirkninger, for eksempel i form af epigenetisk regulering. Således, for at studere sårheling, sammenflydende betingelser medfører øget troskab af modellen.
For at opnå præcise skøn, bør samtidige faktorer påvirker kropsbygning af epitelcelle lag eller bidrager til migration behandles. Mens sammenløbet ønskes, er det vigtigt at undgå overdreven celle tæthed eller flerlaget kulturer, idet disse forhold kan påvirke negativt. Derfor spredning styres normalt af sult i serumfrit medier eller ved tilsætning af kemikalier som Mitomycin C, som irreversibelt arrestere celleproliferation af DNA crosslinking3,20, 21. brug af den ene eller den anden er baseret på opførsel af specifikke cellelinjer; Mitomycin C er især indiceret når reducerede serum tilskud er nødvendig for at undgå massiv celle detachement. Der er tilfældet for HEK-293T celler, hvor pre belægning kultur overfladen ved hjælp af poly-L-lysin er en god mulighed for at undgå Mytomycin C behandling. Frigivelsen af inflammatoriske faktorer, der kan ændre migration skal også løses. Forskellige strategier er blevet brugt, primært baseret på silikone skær til at efterligne afbrydelse af epitel overfladen opnåede med scratch assay22. Mens skær generere allerede eksisterende huller, der tillader celle migration efter at fjerne silikone stykke, bygger metoden scratch direkte på at fjerne nogle af de epitelial éncellelag til at generere kløften. Præference på hvordan man kan generere kløften afhængig skær evne til at beskytte kultur overfladebehandling (dvs, kultur plade eller poly-L-lysin) fra skader under ridser, samtidig også minimere frigivelsen af faktorer fra beskadigede celler, der kan kompromittere celle kultur adfærd23. Selv om disse karakteristika kan være nyttig for nogle eksperimentelle indstillinger, dvs., vurdere af kræftceller til at migrere, i vores erfaring fundet vi betydelige ulemper for ved hjælp af skær i sårheling undersøgelser. Mv1Lu celler er i stand til at vedhæfte silikone Indsæt ydre overflade, hvilket resulterer i utilsigtet rivning af celle éncellelag ved fjernelse af silikone-stykker. Også, selv om HaCaT celler ikke vedhæfte til silikone, fandt vi en formindsket evne til disse celler skal overflyttes til Indsæt-genereret huller. Der omfang, inflammation og migration er tæt forbundet svar, og disse synes at være kritiske sammen i forbindelse med sårheling i HaCaT celler. Desuden, da anvende en plastik tip til skrabe kultur overflade har ingen synlig konsekvens på celler evne til at genbefolke hul for HaCaT celler, sådan adfærd antyder at ekstracellulære matrix rester i mellemrummet kan guide migration i en lignende måde som dermis i et fysisk sår.Den vigtigste kilde til variation forbliver dog skrabe proceduren sig selv, som brugen af en plastik tip til at gøre såret ikke gengiver altid den samme størrelse hul. Vi har observeret variationer op til 20% blandt forskellige prøver, på grund af manglende pres og placeringen af tip i forbindelse med bunden. Disse variationer kan adresseres ved såret éncellelag med en mere stiv objekt; dog ville nogen ridser på plastik overflade bringe den frie bevægelighed for cellerne. Så skal variationer i den indledende bunden tages i betragtning at beregne migration; typisk, ved at øge antallet af måling pr. betingelse.
Ud over bestemmelsesgrænsen, kan anvende såret procedurer sammen med klassiske hvis teknikker kvalitativt vurdere de molekylære processer i celle migration. Epitelceller evne til at vokse på coverslips er velkendte; i fortiden, variationer af scratch-undersøgelser, som involverede celler migrerer på coverslips udsættes for forskellige betingelser efterfulgt af fastsættelse og farvning for sammenligning inden for sår-bunden eksperimentel opsætning24. Her, fandt vi at skabe bred hullerne i encellelag vokser på coverslips giver mulighed for udvide den eksperimentelle tid kurser3,4,7. Desuden, i disse forsøg, hvis stigninger sporingskapaciteten af proceduren til potentielt studere nogen præcis cellulært og subcellulært mekanismer involveret, og det er kun begrænset af tilgængeligheden af antistoffer egnet til denne teknik og den celler af interesse. Prøver på coverslips bruges til hvis er monteret på objektglas, som giver mulighed for udvidede bevarelse. Dette hjælpemidler anvendelse af eksperimenterende opsætninger, der kræver lange studieperioder, som "fliser" tilgange fremvist her og andetsteds3,4,7. Mens "fliser"-strategi integrerer rumlige mønstre med temporale data for rekonstruere de mekanismer, der er involveret i migration, kan gennemførelsen af software analyseværktøjer give semi-kvantitative vurderinger baseret på lokale fluorescens intensitet, og yderligere berige kvalitet for de opnåede oplysninger. Vores erfaring giver flisebelægning også mulighed for at studere celle-positionelle information til udtryk af proteiner i denne type af assay. Dette positionelle oplysninger har vist sig at være afgørende for at forstå og bedre oversætte virkningerne af forskellige agenter på celle migration, især i opsætninger hvor placeringen af epitelceller er meget vigtig for at bestemme funktionsmåden vandrende3 ,4,14,15.
Begge procedurerne viser stor bekvemmelighed af ukompliceret gennemførelse, samt producere kvalitetsdata. Således, disse tilgange, der er baseret på mikroskopi undersøgelser, tilbyde en unik og stærk ramme at studere både dynamik og morfologiske ændringer involveret i epitelcelle adfærd og reaktion på behandlinger i løbet af sårheling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der er nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi ønsker at give tak til ældre medlemmer af laboratoriet, der hjælper med at forbedre og forfine disse teknikker til at dets faktiske tilstand: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada og Dr. Antonia Alcaraz-García. Vi står i gæld til Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca for kraftigt støtte udviklingen af disse teknikker. Også til Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Planlægge Estatal jeg + D + jeg og Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant nr.: PI13/00794); www.isciii.es. omkostninger FEDER "Una manera de hacer Europa". Vi takker også Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca og FFIS for administrativ støtte og bistand. Endelig vil vi gerne give en særlig tak til Dr. Isabel Martínez-Argudo og den Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo for deres venlige støtte i villigt afgivende den Biomedicin og bioteknologi laboratorium til at gøre muligt filmet til en del af dette papir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it? Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
