Summary
Este manuscrito describe cómo incisión-como lesiones sobre monocapas de células epiteliales cultivadas convenientemente modelo herida curativo en vitro, permitiendo la proyección de imagen de confocal o microscopia de la exploración del laser, y que puede proporcionar alta calidad datos cuantitativos y cualitativos para el estudio de comportamiento de la célula y los mecanismos implicados en la migración.
Abstract
Migración celular es un aspecto obligatorio de la cicatrización de heridas. Creación artificial heridas en modelos animales de investigación a menudo resultados en procedimientos experimentales costosos y complicados, mientras que potencialmente carece de precisión. Cultivo in vitro de líneas celulares epiteliales proporciona una plataforma conveniente para investigar el comportamiento migratorio de células en la cicatrización de heridas y el impacto de los tratamientos en estas células. La fisiología de las células epiteliales se estudia a menudo en condiciones no-confluentes; sin embargo, este enfoque no puede asemejarse a las condiciones de cicatrización natural. Alterar la integridad del epitelio por medio mecánico genera un modelo realista, pero puede impedir la aplicación de técnicas moleculares. Por lo tanto, técnicas de microscopía basado son óptimas para estudiar la migración de células epiteliales in vitro. Aquí se detallan dos métodos específicos, el ensayo de rayado herida artificial y el análisis de frente de migración artificial, que puede obtener datos cuantitativos y cualitativos, respectivamente, sobre el comportamiento migratorio de las células epiteliales.
Introduction
Migración celular es necesaria para la cicatrización de heridas, ya que es responsable para el cierre final de la brecha epitelial y la restauración de la superficie perturbada1. Realizar heridas artificiales en modelos animales permite la replicación de este complejo proceso en cerca de condiciones fisiológicas2. Sin embargo, este enfoque resulta a menudo en procedimientos experimentales costosos y complicados, que potencialmente carecen de precisión para el estudio de procesos distintos, debido a la intrincada naturaleza del proceso de cicatrización.
Cultivo in vitro de líneas celulares epiteliales proporciona una útil alternativa a modelos animales para investigar el papel que juegan estas células en la cicatrización de la herida y los efectos del tratamiento sobre el comportamiento migratorio de la célula. La fisiología de las células epiteliales a menudo se estudiados por técnicas moleculares con las culturas no-confluentes3,4,5,6; sin embargo, la interrupción de la integridad del epitelio generalmente se logra mediante finas incisiones mecánicas. En cultivo celular, esto implica que una cantidad insignificante de células puede estar expuesta a la brecha de la herida, y representan una muestra demasiado pequeña para técnicas de biología molecular. Sin embargo, estas lesiones pueden estudiarse a escala microscópica, aprovechando las propiedades migratorias innatas de algunas líneas de células epiteliales, como la célula epitelial de pulmón de visón (Mv1Lu) o el celular de queratinocitos humanos espontáneamente inmortalizadas (HaCaT) líneas.
Aquí describimos un método para microscopía que es conveniente obtener datos cuantitativos sobre la migración de células epiteliales en el contexto de3,4,7,8de cicatrización. Por otra parte, se presentan métodos adicionales que son útiles para estudiar los cambios cualitativamente moleculares y morfológicos que se producen en monocapas epiteliales durante la migración. En general, estos métodos proporcionan un marco para estudiar la dinámica y cambios morfológicos con el comportamiento de la célula epitelial y la respuesta a tratamientos durante la cicatrización de heridas.
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Protocol
1. artificial herida rasguño ensayo para estudios cuantitativos
- Preparación de monocapa de células
- Trabajando bajo condiciones estériles, de semillas y crecen las células epiteliales Mv1Lu o HaCaT en frascos de cultivo con medio de suplementos de suero. Actualizar media una vez cada 24-48 h. Después de que las células alcanzan el 80% de confluencia, separar las células utilizando un método adecuado, es decir, tripsinización9.
Nota: Mv1Lu y HaCaT líneas celulares epiteliales son cultivadas con medio de cultivo EMEM y DEMEM, respectivamente, suplementados con 2 mM L-glutamina y se incubaron a 37 ° C con una atmósfera controlada de 5% CO2. Cada línea celular debe ensayarse cuidadosamente para determinar la concentración de células y el tiempo necesarios para llegar a confluencia completo. Típicamente para las células Mv1Lu o HaCaT, 2-4 x 104 o 4-6 x 104 células/pozo, respectivamente, se siembran en un matraz de cultivo de 175 cm2 , y en el 80% confluencia rinde hasta 35 x 106 Mv1Lu o células HaCaT de 1 x 107 . - En tanto un plato de cultura bien de 12 o 24 pocillos, la semilla en cada pozo 2 mL de células. Actualizar media una vez cada 24-48 h. Asegúrese de números de celular son lo suficientemente altas como para llegar a confluencia 100% después de 2 o 3 días.
- Después de que las células alcanzan confluencia, quitarlo del medio suplementada con suero y lavar dos veces con medio libre de suero fresco. Mantener las células en medio libre de suero durante 24 h antes del rayado.
Nota: Las células Mv1Lu o HaCaT no tienen requisitos de sustrato especial; sin embargo, para las líneas celulares susceptibles a separar espontáneamente en condiciones libres de suero, la capa de la superficie de la placa de cultivo con una solución de poli-l-lisina se debe considerar10.
- Trabajando bajo condiciones estériles, de semillas y crecen las células epiteliales Mv1Lu o HaCaT en frascos de cultivo con medio de suplementos de suero. Actualizar media una vez cada 24-48 h. Después de que las células alcanzan el 80% de confluencia, separar las células utilizando un método adecuado, es decir, tripsinización9.
- Rasguño de monocapa
- Trabajar en un ambiente estéril, rayar la monocapa de cultivo arrastrando firmemente el extremo estrecho de 20 μl o punta de micropipeta estéril 200 μL, dependiendo de la anchura deseada del rasguño. Mantenga la punta perpendicular a la superficie de cultivo para maximizar la homogeneidad del espacio.
- Coloque las placas sobre una superficie oscura para monitorear claramente la monocapa celular. Si es necesario, realizar dos rayas perpendiculares (en forma de Cruz) en cada pocillo para estudiar hasta 4 áreas de migración.
- Lavar las células separadas quitando suavemente el medio de cultivo y suavemente agregar medio fresco libre de suero. Repetir dos veces, o hasta que se han eliminado las células de más.
- Trabajar en un ambiente estéril, rayar la monocapa de cultivo arrastrando firmemente el extremo estrecho de 20 μl o punta de micropipeta estéril 200 μL, dependiendo de la anchura deseada del rasguño. Mantenga la punta perpendicular a la superficie de cultivo para maximizar la homogeneidad del espacio.
- Colección de datos y procedimiento experimental
- Tomar hasta 4 imágenes de referencia de tratamiento centrados en el espacio cero de cada bien utilizando un microscopio invertido de contraste de fases, incorporando una cámara CCD. Seleccionar áreas de interés alineando el borde del campo del microscopio hasta la intersección adyacente de arañazos.
Nota: Normalmente, imágenes adquiridas mediante un aumento de 10 x y un tamaño de 1.280 x 1.024 píxeles de la imagen. Selección de áreas de interés como se describe anteriormente ayudas para fácil localización y validación de 4 mediciones por pozo. - Una vez que todas las imágenes son adquiridas, designar pozos de tratamiento; cambio medio en los pozos con medio fresco que contiene tratamientos seleccionados.
Nota: Alternativamente, para productos químicos o compuestos que no perturban la homogeneidad del medio de cultivo, los tratamientos pueden ser inoculados directamente en el medio de cultivo. - Incube la placa rayada (37 ° C con una atmósfera controlada que contiene 5% CO2) hasta que las condiciones de cierre de brecha cero observación alcance el 90%. Evitar el cierre completo.
Nota: Cierre de la brecha Total anula colección cuadro después del tratamiento como áreas de referencia no son detectables y no se puede establecer la referencia de tiempo para el cierre de la brecha. En el caso de las células Mv1Lu o HaCaT, 16-19 h son necesaria para llegar a 90% de confluencia. - Detener la migración de la célula mediante la fijación de las células; Vuelva a colocar el medio de cultivo experimental con 1 mL de formol al 4% en PBS. Incubar por 15 min a TA.
- Lavar las células para quitar el exceso con formol; Vuelva a colocar la solución en los pocillos con PBS fresco. Repetir al menos dos veces.
Nota: En esta etapa, después de sellar, las placas pueden almacenarse a 4 ° C indefinidamente. - Tomar imágenes de referencia después del tratamiento de cada pocillo de las áreas de referencia originales capturadas después de rascarse. Utilice el mismo equipo (microscopio invertido de contraste de fase óptica incorpora una cámara de CCD) y la correspondiente configuración de imagen (aumento y densidad de resolución digital).
Nota: Para las células que migran individualmente y llenan el vacío independientemente de la formación de un frente coherente (p. ej., células humanas de cáncer de mama MDA-MB-231), las imágenes del curso del tiempo pueden permitir el cálculo de las velocidades de migración de célula individual.
- Tomar hasta 4 imágenes de referencia de tratamiento centrados en el espacio cero de cada bien utilizando un microscopio invertido de contraste de fases, incorporando una cámara CCD. Seleccionar áreas de interés alineando el borde del campo del microscopio hasta la intersección adyacente de arañazos.
- Análisis de imagen y cuantificación de la migración
- Utilizando el software (por ejemplo, ImageJ) de procesamiento de imágenes, definir límites de gap cero y determinar la superficie de espacio para hasta cuatro mediciones en cuadros de tratamiento previo. Registrar los datos como "superficie de brecha de tratamiento" (PREGAP). Repita el mismo procedimiento para los cuadros después del tratamiento. Registrar los datos como "superficie de separación después del tratamiento" (POSTGAP).
- Abra la imagen grabada con ImageJ. En el menú "imagen", establece el tipo de imagen en 8 bits. En el menú de "proceso", ir al submenú de "filtros" y aplicar "varianza" filtrado.
- En el menú "imagen", introduzca "ajustar" la submenú y umbral ajustado a blanco y negro (B & W), asegúrese de no seleccionar "Fondo oscuro". En el menú de "proceso", vaya al submenú "binario" y selecciona "llenar agujeros".
- En el menú "analizar", seleccione "establecer medidas" y activar "área". Dibuje el área mensurable siguiendo el contorno de borde migrando así delimitar el espacio.
- En el menú "analizar", seleccionar "analizar las partículas" y anote los valores de "superficie total" para la superficie del área dibujada.
- Introducir valores de superficie total PREGAP y POSTGAP en una hoja de cálculo para cuantificar la migración absoluta para cada conjunto de muestras individuales como la diferencia de superficie medidas de brecha: − PREGAP POSTGAP [unidades arbitrarias]. Además, normalizar datos de migración absoluta de cada condición para muestras de control: (muestra / CONTROL) * 100 [%].
Nota: Para las células que migran individualmente y llenan el vacío independientemente de la formación de un frente coherente (p. ej., células humanas de cáncer de mama MDA-MB-231), la migración absoluta puede calcularse contando las células invaden una central en la tira el control o las muestras tratadas. - Trama de salidas de la cuantificación (ver figura 1). Realizar análisis estadísticos si es necesario.
- Utilizando el software (por ejemplo, ImageJ) de procesamiento de imágenes, definir límites de gap cero y determinar la superficie de espacio para hasta cuatro mediciones en cuadros de tratamiento previo. Registrar los datos como "superficie de brecha de tratamiento" (PREGAP). Repita el mismo procedimiento para los cuadros después del tratamiento. Registrar los datos como "superficie de separación después del tratamiento" (POSTGAP).
2. artificial migración ensayo frontal para estudios topográficos
- Preparación de monocapa de células
- Trabajar en condiciones estériles, coloque un cubreobjetos redondo esterilizada en placas vacías hasta la superficie de la placa está cubierta totalmente.
Nota: Hasta 12 y 33 cubreobjetos caben en 5 cm y placas de 10 cm de diámetro, respectivamente. - En la placa de cultivo, semilla suavemente un volumen adecuado de las células a una concentración que permite la confluencia 100% después de 2 o 3 días. Asegúrese de que no cubreobjetos superpone cubreobjetos vecinos e impiden que cubreobjetos flotante aplicando presión suave con una punta de micropipeta estériles. Actualizar el medio cada 24-48 h.
Nota: Cada línea celular debe ensayarse cuidadosamente para determinar la concentración de células y el tiempo necesarios para llegar a confluencia completo. Típicamente para las células Mv1Lu o HaCaT, 2-3 x 106 o 2.5-4 x 106 células/10 placa de cm de diámetro, respectivamente, se siembran. Para placas más pequeñas, un número de células debe ser reducido. - Después de que las células alcanzan confluencia, quitarlo del medio suplementada con suero y reemplazar con medio libre de suero fresco. Mantener las células en medio libre de suero durante 24 h antes de la herida artificial se lleva a cabo.
Nota: Las células Mv1Lu o HaCaT no tienen requisitos de sustrato especial; sin embargo, para las líneas celulares susceptibles de extraer espontáneamente en condiciones libres de suero, la capa de la superficie de cultivo con una solución de poli-l-lisina se debe considerar10.
- Trabajar en condiciones estériles, coloque un cubreobjetos redondo esterilizada en placas vacías hasta la superficie de la placa está cubierta totalmente.
- Herir la monocapa
- Utilizando pinzas estériles, mueva suavemente un cubreobjetos sobre una placa de 10 cm limpio con medio libre de suero fresco. Evite dañar la monocapa manteniendo el cubreobjetos en la periferia con las pinzas. Evitar la presión excesiva que puede resultar en rotura del cubreobjetos.
- Crear heridas artificiales arrastrando una navaja esterilizada en una línea transversal sobre el centro de los cubreobjetos. Arrastre 3-4 mm y atrás, con el fin de eliminar completamente la franja central de la monocapa. Asegúrese de que no hay restos de células permanece adherido a los bordes de la herida.
Nota: en un diámetro de 12 mm redondo cubreobjetos, la incisión se realiza en el medio del cubreobjetos. Asegúrese de dejar una capa de las células frente a la fachada principal bastante grande (al menos 2 mm de ancho) para evitar la inclinación del cubreobjetos en los siguientes pasos. - Transferencia de cubreobjetos heridos con celdas hacia arriba, a una placa de 6 pozos limpios que contienen al menos 2 mL fresco medio sin suero. Caben hasta 4 cubre-objetos heridos/pozo.
- Suavemente Lave dos veces con el fresco medio libre de suero para eliminar las células separadas.
- Muestreo y procedimiento experimental
- Intercambio suavemente el medio de los pozos con medio fresco que contiene tratamientos seleccionados.
Nota: Alternativamente, para productos químicos o compuestos que no perturban la homogeneidad del medio de cultivo, los tratamientos pueden ser inoculados directamente en el medio de cultivo. Proceder con precaución para evitar cualquier potencial desprendimiento celular. - Mantenga la placa dentro de una incubadora de la célula (37 ° C, 5% CO2) para el deseado momento experimental.
- Detener la migración de la célula mediante la fijación de las células; Vuelva a colocar el medio de cultivo experimental con 1 mL de formol al 4% en PBS. Incubar por 15 min a TA.
Nota: Para tiempo curso experimentos, extraer las muestras de la placa de cultivo y fijarlas en una placa separada para evitar que los vapores de formol que afectan a las condiciones experimentales, curso. - Lavar las células para quitar el exceso con formol; Vuelva a colocar la solución en los pocillos con PBS fresco. Repetir al menos dos veces.
Nota: En esta etapa, después de sellar, las placas pueden almacenarse a 4 ° C indefinidamente.
- Intercambio suavemente el medio de los pozos con medio fresco que contiene tratamientos seleccionados.
- Inmunofluorescencia (IF) y análisis topológico
- Realizar tinción de IF y la proyección de imagen en cubreobjetos individuales como describe3,4,11.
- Permeabilizar por 10 min sumergiendo cubreobjetos en una solución de Tritón X-100 0.3% en PBS.
- Bloque de 30 minutos con la solución de bloqueo siguiente: 0,3% albúmina de suero bovino; Suero bovino fetal 10%; 5% de leche descremada; 0.3% solución Triton X-100 en PBS.
Nota: Bloqueo solución sin leche se puede preparar con antelación y almacenado a-20 ° C. - Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda, con anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo sin leche. Coloque el cubreobjetos boca abajo en la solución de 15 μl del anticuerpo para asegurar una distribución adecuada.
Nota: La dilución de trabajo del anticuerpo es variable y depende de los anticuerpos en uso. Por ejemplo, los anticuerpos anti-c-Jun requiere una dilución 1/100. - Lavar tres veces sumergiendo el cubreobjetos en una solución de Tritón X-100 0.1% en PBS.
- Incubar el cubreobjetos en el anticuerpo secundario diluido en solución amortiguadora de bloqueo leche durante 30 minutos.
Nota: La dilución de trabajo del anticuerpo es variable y depende de los anticuerpos en uso. Por ejemplo, el cabra-anti-conejo (488) requiere una dilución de 1/400 para una resolución óptima. Otros reactivos Etiquetadoras como phalloidin y Hoechst 33258 pueden agregarse para el tampón de incubación en este momento. - Lavar tres veces sumergiendo el cubreobjetos en solución al 0,1% Tritón X-100 en PBS.
- Monte el cubreobjetos boca abajo en una 10 μl montaje media gota (p. ej., Vectashield) coloca en un portaobjetos de microscopio. Dejo las diapositivas en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche para el endurecimiento medio del montaje. Luego, almacenar a 4 ° C en la oscuridad indefinidamente.
- Obtener epifluorescencia o imágenes de microscopia confocal de los cambios estructurales que ocurren en el borde delantero de la migración.
Nota: Pueden realizarse estudios topológicos por mosaico de fotos del frente de migración a la monocapa interna. Estudios semi cuantitativos son posibles mediante el análisis de software basada en intensidades de fluorescencia local.
- Realizar tinción de IF y la proyección de imagen en cubreobjetos individuales como describe3,4,11.
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Representative Results
Ensayo memoria herida artificial para estudios cuantitativos: determinar el Factor de crecimiento epidérmico (EGF) promoción de la migración:
EGF es un conocido inductor de la proliferación de células epiteliales y migración y un control positivo para la cuantificación de promoción de la migración. Monocapas de células Mv1Lu y HaCaT fueron utilizadas en los ensayos de rayado de herida y se obtuvieron imágenes de tratamiento previo. Después de la inoculación con EGF de 10 ng/mL, las células fueron incubadas durante 19 h antes de la fijación y fotos después del tratamiento. Proliferación se mantuvo al mínimo manteniendo condiciones de inanición de suero. Juegos de antes y después del tratamiento de imágenes se analizaron con ImageJ y se determinaron las áreas del espacio central. Se ejecutó el experimento por duplicado, registrando cuatro mediciones para cada pozo. Cuantificación de la migración absoluta se calculó como la diferencia de superficies: (− PREGAP POSTGAP). Había un mayor potencial migratorio en las células estimuladas de Mv1Lu (figura 1A) en comparación con las células HaCaT estimuladas (figura 1B). Las diferencias se explican por las fuentes de células, siendo la mucosa de las células epiteliales y queratinocitos, la piel respectivamente.
Análisis frontal migración artificial para estudios topográficos: variaciones en la conformación de citoesqueleto y expresión espacial de C-Jun:
Migración de la célula implica continuos y profundos cambios de la estructura del citoesqueleto para mantener el desplazamiento de la célula. Monocapas de células HaCaT fueron utilizadas en los ensayos de migración delantera bajo condiciones de control y estimulación. Tratamiento con EGF potencializa la dinámica del citoesqueleto, que es observada por IF y láser microscopía (LSM; Figura 2A). Tratamiento del EGF también resultado robusto kinases de proteína Mitogen-Activated (mapa) señalización y sobreexpresión de c-JUN. Mosaico imágenes LSM permite la configuración de patrones espaciales. Aumento de la expresión de c-JUN en células adyacentes en el frente de migración puede ser fácilmente revelado por análisis de imagen de software; aquí, hemos implementado una escala arco iris para el canal verde, que corresponden a c-JUN etiquetado (figura 2B).
Figura 1. Promoción de la migración por EGF en células Mv1Lu y HaCaT. Imágenes de microscopía de contraste de fase de la zona herida de Mv1Lu (A) y células HaCaT (B) fueron tomadas bajo condiciones de control y comparación con imágenes de las células tratadas con 10 ng/mL EGF para 19 h en condiciones libres de suero. Fotografías representativas muestran el grado de gap cero y cierre obtenido tras herir con una punta de micropipeta de 20 μl. Magnificación = 10 x; Barra de escala = 100 μm. célula de migración fue cuantificada y representada como la variación de las diferencias de área entre los tratamientos y las muestras de control para cada ensayo (unidades arbitrarias; UA). La trama es representante de ocho mediciones independientes para cada condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Filamentos de actina y los cambios de la expresión de c-JUN promovidos por EGF en la migración de las células HaCaT. Tratamiento (A) durante la noche 10 ng/mL EGF promueve cambios profundos en la conformación de los filamentos de actina en la migración de las células HaCaT. Las células en el frente de migración de las condiciones de control de retratar un citoesqueleto de filamentos de actina firmemente estructurado, mientras que las células trataron con EGF Mostrar organización de filamentos de actina pobre en el frente de migración. Magnificación = 63 x; Barra de escala = 20 μm. F-actina es codificada por colores rojo, y Hoechst está representado por un color azul. (B) cuando la inmuno-fluorescencia se utiliza en combinación con la proyección de imagen de LSM para estudiar la expresión de c-JUN después del tratamiento 10 ng/mL EGF sobre la migración de las células HaCaT, composiciones de azulejos revelan patrones de expresión espacial. Imágenes de fluorescencia (verde) de c-Jun fueron convertidos en pseudo-color para mostrar la intensidad de la coloración de c-Jun. La escala del arco iris de color representa la intensidad de la fluorescencia para el c-Jun, correspondiente a colormaps en los paneles derecho de EGF y Control. Co la coloración con phalloidin (rojo) y Hoechst-33258 (azul) se utilizó para mostrar la estructura de la célula y núcleos, respectivamente. Imágenes fueron tomadas por un microscopio confocal. Tenga en cuenta los mayores niveles de expresión de nuclear c-Jun en áreas cerca del frente de migración. Barra de escala = 40 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Sobre la piel o membrana mucosa de la interrupción, se restaura la función barrera por las acciones de numerosos tipos celulares, incluyendo fibroblastos o células epiteliales e inmunes. Conjuntamente, estas células se someten a un complejo proceso que involucra la apoptosis, proliferación, diferenciación e importante, fibroblastos y epitelial celular la migración, que es el último mecanismo responsable de la restauración del tejido interrumpido y la cierre de la brecha epitelial superficial1,12 por lo tanto, estudiar la migración de la célula ayuda a describir precisamente el comportamiento fisiológico de las células epiteliales, mientras que también determinar el potencial modulador de tratamientos para la herida sanación.
Realizar heridas artificiales en modelos animales de investigación permite la replicación de este complejo proceso en cerca de2de las condiciones fisiológicas y, por tanto la evaluación de algunas condiciones patológicas o los efectos de productos farmacéuticos tratamientos13. Sin embargo, este enfoque genera a menudo costosa y complicada logística, así como los onerosos procedimientos experimentales que pueden generar datos en una manera retrasada13. Por el contrario, en vitro cultivo celular proporciona un marco más conveniente para investigar el comportamiento de células implicadas en el proceso de cicatrización. Mientras que el cultivo de células primarias de las células epiteliales constituye una opción viable, puede ser difícil de obtener y manejar las células, que pueden complicar la recolección de datos. Por ejemplo, además de la restricción de paso baja típica de cultivos primarios, primarios keratinocytes humanos necesitan un fibroblasto alimentación capa de crecimiento en vitro3. Por el contrario, las líneas de cultura de célula epitelial bien establecida, como Mv1Lu o HaCaT, constituyen un modelo de investigación sin obstáculos eso comportamiento de funciones y características como las de cultivo primario de células de3,4, 14,15. Precisamente, para el estudio de la cicatrización de heridas, estas dos variedades de células conservan rasgos críticos en su capacidad de migrar y detener proliferación debido a la inhibición de contacto célula a célula a confluencia16,17.
Ensayos de rayado son un método fiable y versátil para cuantificar las capacidades migratorias de diversos tipos celulares, especialmente epiteliales y las células cancerosas. Para el caso de las células cancerosas, el método de rasguño se ha propuesto para la evaluación de potencial invasor. Sin embargo, este enfoque se queda corto como indicador de invasividad en comparación con métodos más específicos basándose en la expresión de metaloproteasas para penetrar en la matriz extracelular18,19. Por el contrario, ensayos de rayado son confiables para evaluar el rendimiento migratorio de las células epiteliales y el efecto de diferentes tratamientos en este rasgo. En contraste con las líneas de células de cáncer, que con frecuencia presentan pobre cohesión y la capacidad de crecer en varias capas, Mv1Lu, HaCaT y otras células epiteliales líneas forma estrechamente asociado "crecimiento islas", que amplía su margen en un proceso dependiendo tanto proliferación, pero más importantemente sobre migración de la célula. En consecuencia, las condiciones de densidad escasa o el confluente de la célula se utilizan convencionalmente para el estudio de los efectos de diferentes tratamientos sobre la fisiología migratoria; especialmente cuando se aplican técnicas de biología molecular posterior, como este celular medio ambiente minimiza inhibición de contacto mientras que maximizar la proporción de migración activa de células. Sin embargo, para las células epiteliales, las condiciones no-confluentes plantean el riesgo de excluir influencias importantes de inhibición de contacto existente, por ejemplo en la forma de regulación epigenética. Por lo tanto, para estudiar la cicatrización de heridas, confluentes condiciones confieren mayor fidelidad del modelo.
Para obtener estimaciones precisas, deben abordarse factores concomitantes que afectan a la conformación de la capa de células epiteliales o contribuir a la migración. Mientras que la confluencia es deseada, es importante evitar densidad celular excesiva o culturas varias capas, ya que estas afecciones pueden afectar negativamente. Por lo tanto, proliferación comúnmente es controlada por inanición en medios libres de suero o por la adición de productos químicos como Mitomycin C, que irreversiblemente detener proliferación celular por ADN reticulación3,20, 21. el uso de uno u otro se basa en el comportamiento de las líneas celulares específicas; Mitomicina C está especialmente indicada cuando se requiere suplementación con suero para evitar desprendimiento masivo de células. Es el caso de las células HEK-293T, donde la capa de la superficie de cultivo con poli-l-lisina es una buena opción para evitar el tratamiento de C Mytomycin. La liberación de factores inflamatorios que pueden alterar la migración también debe ser abordado. Se han utilizado diferentes estrategias, basada principalmente en los rellenos de silicona para imitar la interrupción de la superficie epitelial conseguida el rasguño de análisis22. Mientras inserta genera brechas existentes que permiten la migración de la célula después de retirar la pieza de silicona, el método de rasguño se basa directamente en la eliminación de algunas de la monocapa epitelial para generar el vacío. Preferencia sobre cómo generar el desfase depende de la capacidad de partes movibles para proteger la capa superficial de la cultura (es decir, placa de cultivo o poli-l-lisina) de daño durante el rascado, minimizando también la liberación de factores de las células dañadas que pueden comprometer la célula cultura conducta23. Aunque estas características podrían ser útiles para algunos ajustes experimentales, es decir, evaluar la capacidad de las células cancerosas para migrar, en nuestra experiencia encontramos inconvenientes importantes para el uso de insertos en los estudios de cicatrización. Las células Mv1Lu son capaces de fijar a la superficie exterior inserto de silicona, que da sin querer desgarrar la monocapa celular sobre retiro de las piezas de silicona. Además, aunque las células HaCaT no sujete a la silicona, encontramos una capacidad disminuida de estas células a migrar en espacios generados por el relleno. Medida, la inflamación y la migración son respuestas estrechamente asociadas, y parecen estar juntos en el contexto de la cicatrización de heridas en las células HaCaT. Por otra parte, puesto que aplicar una punta de plástico para rayar la superficie de cultivo tiene ninguna consecuencia aparente en la capacidad de las células para repoblar el espacio, en el caso de células HaCaT, tal comportamiento sugiere que restos de la matriz extracelular en la brecha que guíen la migración en de la misma manera como dermis en una herida natural.Sin embargo, la principal fuente de variación sigue siendo el procedimiento de raspado, como el uso de una punta de plástico para hacer la herida no siempre hacen la misma brecha de tamaño. Hemos observado variaciones de hasta un 20% entre diferentes muestras, debido a la inconsistencia de la presión y la posición de la punta en el momento de cero. Estas variaciones pueden abordarse por herir la monocapa con un objeto más rígido; sin embargo, cualquier rasguño en la superficie de plástico se pondría en peligro la libre circulación de las células. Por lo tanto, las variaciones en el cero inicial deben tenerse en cuenta para calcular la migración; Normalmente, al aumentar el número de medición según condición.
Además de la cuantificación, aplicando procedimientos heridos junto con técnicas clásicas de IF cualitativo puede evaluar los procesos moleculares de la migración de la célula. La capacidad de las células epiteliales crecen en cubreobjetos es conocido; en el pasado, las variaciones de la scratch ensayos involucrados las células migran sobre cubreobjetos expuestos a diferentes condiciones, seguidas de fijación y tinción para la comparación dentro de la herida-cero configuración experimental24. Aquí, encontramos que la creación de espacios amplia en monocapas sobre cubreobjetos permite para extender el tiempo experimental cursos3,4,7. Por otra parte, en estos experimentos, si aumenta las capacidades de detección del procedimiento potencialmente estudiar cualquier precisa mecanismos celulares y subcelulares involucradas, y sólo está limitado por la disponibilidad de anticuerpos adecuados para esta técnica y la células de interés. Muestras sobre el cubreobjetos usado pues si se montan en portaobjetos de microscopio, que permiten la preservación prolongada. Esto ayuda a la aplicación de configuraciones experimentales que requieren períodos largos de estudio, como los enfoques de "mosaico" habían presentado aquí y en otros lugares3,4,7. Mientras que la estrategia de "mosaico" integra patrones espaciales con los datos temporales para la reconstrucción de los mecanismos implicados en la migración, la aplicación de herramientas de análisis de software puede proporcionar evaluaciones semicuantitativa basadas en fluorescencia local intensidad y enriquecer aún más la calidad de la información obtenida. En nuestra experiencia, mosaico ofrece también la posibilidad de estudiar la información posicional de la célula para la expresión de proteínas en este tipo de análisis. Esta información posicional ha demostrado ser crucial para entender y traducir mejor los efectos de diferentes agentes de migración de la célula, especialmente en configuraciones donde la posición de las células epiteliales es muy importante para determinar su comportamiento migratorio3 ,4,14,15.
Ambos procedimientos descritos demuestran la gran conveniencia de implementación sin complicaciones, así como producir datos de calidad. Así, estos enfoques basados en estudios de la microscopia, ofrecen un marco único y poderoso para el estudio de la dinámica y cambios morfológicos implicados en el comportamiento de la célula epitelial y respuesta a tratamientos durante la cicatrización de heridas.
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Disclosures
Los autores declaran que no existe ningún conflicto de interés.
Acknowledgments
Queremos dar las gracias a los miembros más antiguos de laboratorio que ayudan a mejorar y perfeccionar estas técnicas a su estado actual: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada y Dr. Antonia Alcaraz García. Estamos agradecidos al Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca para apoyar fuertemente el desarrollo de estas técnicas. También el Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Plan Estatal I + D + I y el Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (beca Nº: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER "Una manera de hacer Europa". También agradecemos a Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca y FFIS para asistencia y apoyo administrativo. Por último, queremos dar un agradecimiento especial a Dr. Isabel Martínez-Argudo y la Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad de Castilla-la Mancha, Toledo por su apoyo en ceder voluntariamente el Biomedicina y biotecnología laboratorio para hacer posible la parte filmada de este documento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
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