Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

الحمض النووي-المغناطيسي الجسيمات ربط التحليل بتشتت الضوء الديناميكي والغرواني الكهربي

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56815
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, 2Central European Institute of Technology, Brno University of Technology

Summary

ويصف هذا البروتوكول توليف الجزيئات المغناطيسية وتقييم خصائصها ربط الحمض النووي عن طريق نثر الضوء الديناميكي والغرواني الكهربي. يركز هذا الأسلوب على رصد التغيرات في حجم الجسيمات، وعلى بوليديسبيرسيتي والرئيسية إمكانات زيتا لسطح الجسيمات التي تلعب دور في ملزمة لمواد مثل الحمض الريبي النووي.

Abstract

عزل الحمض النووي المغناطيسي الجسيمات باستخدام حقل ذو أهمية فائقة في بحوث التكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. ويصف هذا البروتوكول تقييم جزيئات الحمض النووي المغناطيسي ملزمة عن طريق نثر الضوء الحيوي (DLS) وتشتت الضوء الغرواني الكهربي (ELS). تحليل حسب DLS توفر معلومات قيمة عن الخصائص الفيزيائية للجسيمات بما في ذلك حجم الجسيمات، بوليديسبيرسيتي، وزيتا المحتملة. ويصف هذا الأخير تهمة السطحية للجسيمات التي تلعب دوراً رئيسيا في الربط الكهربائي من مواد مثل الحمض النووي. وهنا يستغل تحليل مقارن التعديلات الكيميائية ثلاثة جسيمات نانوية والمجهرية الدقيقة وتأثيراتها على الحمض النووي ملزم وشطف. التعديلات الكيميائية التي تشعبت بولييثيلينيميني، ويجري التحقيق في تريثوكسيسيلاني إيثيل أورثوسيليكاتي و (3-أمينوبروبيل). لما الحمض النووي المعارض شحنة سالبة، فمن المتوقع أن تنخفض إمكانيات زيتا لسطح الجسيمات عند ربط الحمض النووي. وينبغي تشكيل المجموعات تؤثر أيضا على حجم الجسيمات. من أجل التحقيق في كفاءة هذه الجسيمات في العزلة وشطف الحمض النووي، مختلطة الجسيمات مع الحمض النووي في انخفاض الأس الهيدروجيني (~ 6) وقوة الأيونية عالية وجفاف البيئة. تغسل الجسيمات في المغناطيس وثم الحمض النووي هو الوتيد بالمخزن المؤقت تريس-HCl (pH = 8). ويقدر عدد نسخ الحمض النووي باستخدام الكمية البلمرة المتسلسل (PCR). تقييم ومقارنة إمكانات زيتا وحجم الجسيمات، بوليديسبيرسيتي وبيانات PCR الكمي. دائرة الأراضي والمساحة هو الثاقبة ودعم أسلوب التحليل الذي يضيف منظورا جديداً لعملية فحص جسيمات لعزل الحمض النووي.

Introduction

عزل الحمض النووي إحدى الخطوات الأكثر أهمية في مجال البيولوجيا الجزيئية. تطوير أساليب استخراج الحمض النووي تأثيراً كبيرا على الناشئة مجالات علم الجينوم وميتاجينوميكس والتخلق وترانسكريبتوميكس. وهناك مجموعة واسعة من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية لعزل الحمض النووي بما في ذلك الطبية (أدوات الطب الشرعي/التشخيص وتنبؤاتها المؤشرات الحيوية)، والتطبيقات البيئية (الجينومية التنوع البيولوجي وانتشار مسببات المرض والمراقبة). كان هناك طلب متزايد لتنقية وعزل الحمض النووي من مواد مختلفة، وفي مستويات مختلفة مثل الدم، البول، والتربة، والخشب، وأنواع أخرى من العينات. 1 , 2 , 3 , 4

جزيئات نانو والصغيرة الحجم مناسبة لعزل الحمض النووي بسبب تلك المساحة السطحية العالية، ولا سيما عندما أنهم يمكن أن تكون معطلة بحقل مغناطيسي. الخصائص الفيزيائية للجسيمات، مثل الحجم أو التهمة، يمكن أن تؤثر إلى حد كبير قدرتها على ربط الجزيئات الحيوية المستهدفة. 5 لزيادة تعزيز ربط الجزيئات الحيوية واستقرار الجزيئات، يمكن أن تستخدم مختلف التعديلات الكيميائية (طلاء السطح). العديد من الاستراتيجيات المختلفة لربط تصنف وفقا للتفاعلات التساهمية وغير التساهمي. 6 حجم الجسيمات يؤثر تأثيراً مباشرا على خصائصها المغناطيسية، بينما يمكن أن تكون مصممة تكوين الجسيمات بإدراج معدنية أو سبائك أو غيرها من المواد التي يمكن أن تؤثر في كثافة، المسامية، وسطح. وهناك 7 لا طريقة يمكن الاعتماد عليها لقياس تهمة السطحية لجزيئات صغيرة. بدلاً من ذلك، يمكن قياس القدرة الكهربائية في الطائرة المتأخرة (بعض المسافة بعيداً عن سطح نانوحبيبات). 8 هذه القيمة يسمى زيتا المحتملة وهو أداة قوية التي تستخدم عادة للتقييم لنانو-ويمثل الاستقرار عن طريق دائرة الأراضي والمساحة. 9 نظراً لقيمته اعتماداً كبيرا ليس فقط على درجة الحموضة وقوة الأيونية البيئة المشتتة، ولكن أيضا على الخصائص السطحية للجسيمات، فإنه يمكن أيضا أن تثبت التغييرات في هذا السطح الناجمة عن التفاعل بين الجسيمات وجزيء من الفائدة. 10

من ناحية أخرى، تحدث بنية الحمض النووي في ظروف المجففة (نموذج أ-الحمض النووي) المعارض والتشكلات المضغوطة التي تيسر لها هطول الأمطار (تجميع) عند مقارنة إلى عادة شكل ب-الحمض النووي. كهرباء (الأيونية والسندات ح) هي القوى الرئيسية السيطرة على ربط الحمض النووي للمواد الأخرى بسبب ما فوسفات ستيريكالي موجوداً وقواعد النيتروجين (لا سيما جوانين). 7 , 10

في هذا العمل، ويتم تحليل التعديلات الكيميائية الممثل ثلاثة جسيمات نانوية مغناطيسية والمجهرية الدقيقة (الشكل 1A). يتم وصف أسلوب التوليف والتعديل الكيميائي لجسيمات نانوية والمجهرية الدقيقة. حل ملزم، أن اتفاقات المبادئ النظرية لترسيب الحمض النووي (درجة الحموضة، القوة الأيونية، والجفاف)، يستخدم لتقييم الحمض النووي ملزم وشطف. يتم استخدام PCR الكمي لتقييم كفاءة شطف الحمض النووي من جسيمات نانوية الممثل والمجهرية الدقيقة (الشكل 1B). حجم الجسيمات ومؤشر بوليديسبيرسيتي وزيتا المحتملة هي المعالم الهامة التي يتم استخدامها لتصور التغيرات الفيزيائية التي تحدث على سطح الجسيمات (الشكل 1). من المهم التأكيد على أن وصف السطح المغناطيسي الجسيمات الكيميائية. وبينما كانت هذه الخطوة خارج نطاق هذا البروتوكول، يمكن تطبيق العديد من التقنيات الحديثة للتحقيق في كفاءة التعديلات الكيميائية. 11 , 12 , 13 , 14 فورييه تحويل مطيافية الأشعة تحت الحمراء (FTIR) يمكن استخدامها لتقييم طيف الأشعة تحت الحمراء لسطح الجسيمات وذلك مقارنة بطيف المعدلات الكيميائية الحرة. مطيافية إلكترون الأشعة السينية (XPS) هو تقنية أخرى يمكن استخدامها لتحديد تكوين عنصري من سطح المادة. يمكن استخدام أساليب أخرى الكهروكيميائية والمجهرية والطيفية تسليط الضوء على نوعية التوليف الجسيمات. ويبرز هذا العمل منظورا جديداً لتحليل الحمض النووي المغناطيسي الجسيمات التفاعل عن طريق دائرة الأراضي والمساحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-توليف جسيمات نانوية مغناطيسية

  1. استقرت توليف لجسيمات نانوية مغناطيسية مع سترات (منبس)
    1. إضافة 20 ملمول فيكل 3 ∙ 6 ح 2 س (5.406 ز) و 10 مليمول من فيكل 2 ∙ ح 4 2 س (1.988 ز) في 20 مل ماء المقطر مزدوجة deoxygenated (ddd المياه). إثارة الحصول على الحل بقوة في الكأس تحت الغلاف الجوي 2 ن استخدام محرض ميكانيكية حتى يتم الحصول على حل شفافة-
    2. تحت التحريك الميكانيكي السريع، إضافة 150 مل م 1 NH 4 أوه، قطره قطره باستخدام القمع إسقاط (تأخذ ح 1 أو أكثر إذا لزم الأمر). نقل الحل في سفينة سكريوابلي بعد إضافة جميع NH 4 أوه. برغي الحل السفينة والحرارة عند 75 درجة مئوية للحد الأدنى 30
      تنبيه: تصنف NH 4 يا أكالة وتشكل خطرا على البيئة.
      ملاحظة: تعد NH 4 يا الحل من الدرجة العالية 28% NH 4 يا في المياه باستخدام مياه deoxygenated.
    3. جمع متسرعا أسود استخدام المغناطيس، والمياه والصرف الصحي باستخدام 100 مل الماء ddd. كرر 3 مرات. إضافة 50 مل من 0.5 م الصوديوم ثلاثي سترات ثنائي هيدرات تعمد إلى. برغي السفينة.
      ملاحظة: استخدم deoxygenated حل ثنائي هيدرات سترات الصوديوم الثلاثية-
    4. إعادة تفريق في ترسبات عبر سونيكاتيون (35 كيلو هرتز، سعة 100 ٪) وسفينة الحرارة عند 80 درجة مئوية حاء 1
      ملاحظة: هناك حاجة إلى سونيكاتور طاقة كافية.
    5. السماح لتبرد الحل إلى درجة حرارة الغرفة. جمع متسرعا باستخدام مغناطيس وإزالة المادة طافية. إعادة تفريق الطين الأسود في 50 مل مياه ddd باستخدام سونيكاتور (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-
      6. نقل مختبرين (~ 25 مل) في أنابيب الطرد المركزي 50 مل
    6. وإضافة 20 مل الأسيتون. الطرد المركزي في 2400 x ز لمدة 10 دقائق وإزالة سوبيرناتانتس.
    7. إعادة تفريق متسرعا وحل ضد الماء باستخدام جهاز الغسيل الكلوي الوقف الوزن الجزيئي المنخفض (500-1,000 دا) لحجم مناسب ل 24 h. دياليزي
      ملاحظة: تحضير جهاز الغسيل الكلوي وفقا للشركة المصنعة ' متطلبات s-
  2. توليف لجسيمات نانوية مغناطيسية معدلة مع تشعبت بولييثيلينيميني (MNPs_PEI)
    1. إضافة 2 مل من الحصول عليها منبس الحل (~0.1 g/mL) في كوب زجاج. إضافة 38 مل من الماء ddd و sonicate (35 كيلو هرتز، سعة 100 ٪) التعليق (10 دقيقة)-
    2. تحت التحريك الميكانيكي السريع، إضافة 10 مل من 10% تشعبت بولييثيلينيميني (متوسط كاتشين 25). إثارة الحل حاء 3 اللاحقة
    3. جمع يعجل باستخدام المغناطيس وإزالة المادة طافية. إعادة تفريق متسرعا في 20 مل من الماء ddd. كرر 5 مرات ثم sonicate بتعليق نهائي (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-
  3. تعديل توليف للجسيمات جسيمات نانوية مغناطيسية مع السليكا (MNPs_TEOS)
    1. إضافة 10 مل من الحصول عليها منبس الحل (~0.1 g/mL) في كوب زجاج. إضافة 60 مل من المياه و 130 مل من الإيثانول. Sonicate الحل وإضافة 6 مل من 28% NH 4 يا.
    2. تحت التحريك الميكانيكي السريع، إضافة 1 مل من الرصاص رباعي الإيثيل أورثوسيليكاتي. إثارة الحل ل h. 12 اللاحقة
    3. جمع ترسبات سوداء باستخدام المغناطيس وغسله باستخدام 50 مل إيثانول (3 مرات) و 50 مل من الماء (3 مرات). إعادة تفريق الجزيئات في 10 مل ddd المياه و sonicate بتعليق (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-
  4. توليف لجسيمات نانوية مغناطيسية معدلة مع المجموعات الأمينية (MNPs_APTES)
    1. إضافة 5 مل حل MNPs_TEOS التي تم الحصول عليها (~0.1 g/mL) في كوب زجاج. إضافة 45 مل من المياه و 50 مل من الإيثانول. Sonicate الحل (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-
    2. تحت التحريك الميكانيكي السريع، إضافة 0.5 مل تريثوكسيسيلاني (3-أمينوبروبيل). إثارة الحل حاء 3 اللاحقة
    3. جمع ترسبات سوداء باستخدام المغناطيس وغسله باستخدام 50 مل إيثانول (3 مرات) و 50 مل من الماء (3 مرات). إعادة تفريق الجزيئات في 5 مل ddd المياه و sonicate بتعليق (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-

2. مغناطيسية المجهرية الدقيقة توليف

  1. استقرت توليف المغناطيسي المجهرية الدقيقة مع سترات (يتولى)
    1. إضافة 25 مل م 2 كنو 3 ومل 12.5 م 1 كوه ومل 205.875 ddd المياه داخل وعاء سكريوابل. إضافة مل 6.675 م 1 فيسو 4 أثناء إثارة المغناطيسية. الفور نقل السفينة إلى حمام مائي مسخن (90 درجة مئوية) حاء 2
      ملاحظة: إعداد كنو 3 وحلول كوه في ddd المياه-
    2. السماح لتبرد الحل إلى درجة حرارة الغرفة. جمع الأسود متسرعا استخدام المغناطيس، والمياه والصرف الصحي باستخدام 50 مل الماء ddd (5 مرات). إضافة 50 مل من 0.5 م الصوديوم ثلاثي سترات ثنائي هيدرات تعمد إلى. برغي السفينة.
    3. ريديسبيرسي ترسبات عبر سونيكيشن (35 كيلو هرتز، سعة 100 ٪) وسفينة الحرارة عند 80 درجة مئوية لترسبات سوداء جمع حاء 1 استخدام المغناطيس، والمياه والصرف الصحي باستخدام 50 مل الماء ddd (10 مرات).
      4. يتولى تعديل
    4. مع تشعبت بولييثيلينيميني (MMPs_PEI)، السيليكا (MMPs_TEOS) والمجموعات الأمينية (MMPs_APTES) مماثلة لبروتوكول منبس. راجع الأقسام 2.2، 2.3 و 2.4، على التوالي لمزيد من التفاصيل.
  2. توليف المغناطيسي المجهرية الدقيقة المعدلة مع تشعبت بولييثيلينيميني (MMPs_PEI)
    1. إضافة 5 مل من محلول يتولى (~0.1 g/mL) في كوب زجاج. إضافة 38 مل من الماء ddd و sonicate الحل (35 كيلو هرتز، سعة 100%، 10 دقيقة). تحت التحريك الميكانيكية السريعة إضافة 10 مل من 10% تشعبت بولييثيلينيميني (متوسط كاتشين 25). إثارة الحل حاء 3 اللاحقة
    2. جمع متسرعا باستخدام مغناطيس وإزالة المادة طافية. ريديسبيرسي متسرعا في 20 مل ماء المقطر مزدوجة. كرر 5 مرات ثم sonicate الحل النهائي (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-
  3. توليف المغناطيسي المجهرية الدقيقة المعدلة مع السليكا (MMPs_TEOS)
    1. إضافة 5 مل من محلول يتولى (~0.1 g/mL) في كوب زجاج. إضافة 60 مل من المياه و 130 مل من الإيثانول. Sonicate تعليق (35 كيلو هرتز، سعة 100 ٪) وإضافة 6 مل من 28% NH 4 يا.
    2. تحت التحريك الميكانيكي السريع، إضافة 1 مل من الرصاص رباعي الإيثيل أورثوسيليكاتي. إثارة الحل ل h. 12 اللاحقة
    3. جمع ترسبات سوداء باستخدام مغناطيس وغسله باستخدام 50 مل إيثانول (3 مرات) و 50 مل من الماء (3 مرات). ريديسبيرسي الجسيمات في 5 مل الماء ddd و sonicate بتعليق (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-
  4. توليف المغناطيسي المجهرية الدقيقة المعدلة مع المجموعات الأمينية (MMPs_APTES)
    1. أضف 3 مل من محلول MMPs_TEOS (~0.1 g/mL) في كوب زجاج. إضافة 45 مل من المياه و 50 مل من الإيثانول. Sonicate التعليق (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-
    2. تحت التحريك الميكانيكي السريع، إضافة 0.5 مل تريثوكسيسيلاني (3-أمينوبروبيل). إثارة الحل حاء 3 اللاحقة
    3. جمع ترسبات سوداء باستخدام المغناطيس وغسله باستخدام 50 مل إيثانول (3 مرات) و 50 مل من الماء (3 مرة). ريديسبيرسي الجسيمات في 3 مل من الماء ddd و sonicate بتعليق (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-

3. مغناطيسية الجسيمات حجم تحليل استخدام DLS

  1. حجم الجسيمات في المياه
    1. استخدام DLS الصك الذي ينطبق على زاوية للكشف عن تشتت الخلفي (رقم 173) وطول موجه شعاع من 633 نانومتر.
      ملاحظة: العودة ونثر DLS مناسبة لعينات مركزة حيث يمكن تجنب تشتت متعددة. الجانب نثر (كاشف زاوية 90°) ونثر الأمام (كاشف زاوية 15 درجة) DLS تصلح لجسيمات أصغر ومختلطة الجسيمات، على التوالي.
    2. السابقة للقياس في الماء، sonicate الجسيمات للحد الأدنى 3
      ملاحظة: استخدم الحل المخفف للجسيمات. ولهذا الغرض، مزيج ميليلتر 9.6 الجسيمات مع 96 ميليلتر من الماء.
    3. بعناية "الماصة؛" 50 ميليلتر من الجسيمات الحل إلى مطاط البوليستيرين الترعة وتجنب تكوين فقاعات.
      ملاحظة: لكل عينة، استخدام المتاح ومبومو (انظر الجدول للمواد)-
      4. ملاحظة
    4. وضوح ومبومو واتجاه شعاع ضوء. إدراج الخلية في صاحب العينة وإغلاق الدائرة.
    5. استخدم المعلمات التالية للقياس: درجة الحرارة: 25 درجة مئوية؛ والانكسار المرحلة المشتتة (الحديد): 2.344؛ والانكسار المشتتة البيئة (المياه): 1.333
      ملاحظة: إجراء قياس الانكسار استخدام إنكسار لنتائج أكثر دقة، لا سيما عند وضع مواد رواية أو المختلطة-

4. إعداد المخزون الحمض النووي، والجسيمات المغناطيسية والمخزن المؤقت ملزم

العازلة 10 ملم HCL تريس
  1. الأسهم الحمض النووي
    1. استخدام (pH = 8) لتمييع ومخزن للحمض النووي. استخدام عينة الحمض النووي قياسية التي يمكن توسيعها على وجه التحديد مع بروتوكول بكر مباشرة في المختبر (انظر الفرع 5-2 لإعدادات رد الفعل والظروف). لتضخيم 498 زوج قاعدي (bp) الجين xis من عاثية λ التحكم، استخدم كبسولة تفجير التالية. إلى الأمام التمهيدي: 5 '-ككتجكتكتجككجكتكاكجك-3Ɔ عكس التمهيدي: 5 '-تككجاتااااكجتكجاتجاكاتتجك-3 '
    2. "بكر تنقية" المنتج باستخدام أدوات تنقية الحمض النووي التجاري-
      ملاحظة: مجموعات تجارية باستخدام السليكا المستندة إلى العمود الداخلي العائد > 100 نانوغرام/ميليلتر تنقية الحمض النووي-
    3. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام أسلوب سبيكتروفوتوميتريك (امتصاص في 260 nm). تمييع الأسهم الحمض النووي من 10 11 نسخة/ميليلتر كما هو موضح أعلاه للحلول العامل من 10 10، 10 9، 10 8، و 10 7 نسخة/ميليلتر.
      ملاحظة: يمكن حساب عدد نسخ منتج PCR وفقا للمعادلة التالية، بافتراض متوسط الوزن الجزيئي هو دا 650 لكل شركة بريتيش بتروليوم:
      نسخ الحمض النووي/ميليلتر = (الكمية في نانوغرام/ميليلتر * 6.022x10 23 نسخ/مول)/(498 bp * 650 غ/مول من بي بي * 1 x 10 9 نانوغرام/غرام)
  2. المغناطيسي الجسيمات
    1. السماح للجسيمات للرواسب دون المغناطيس وإزالة المادة طافية. مزيج 01:20 v/v نسبة الجزيئات المغناطيسية مع المياه ddd (الجسيمات: المياه)-
      ملاحظة: النهج القائم على وحدة تخزين تستخدم لوصف كميات من الجسيمات المغناطيسية نظراً لسهولة من الصعب مقارنة الجماهير تساوي منبس ويتولى.
  3. ملزمة المخزن المؤقت
    1. للإعداد السريع لحل HCL خلات الصوديوم 0.75 متر (pH = 6)، مزيج 1 مل خلات الصوديوم م 3 مع 3 مل من 1 مم HCL.
      ملاحظة: يمكن تخزين كافة الحلول المستخدمة في الربط في 4 ° جيم-مذكرة بأن درجة الحرارة منخفضة يزيد بشكل ملحوظ ملزمة لا سيما في حالة الحل الإيثانول. التحكم بعناية في درجة حرارة الحلول لإمكانية تكرار نتائج أفضل ودقة الفحص.

5. اختبار "الكفاءة للحمض النووي العزل استخدام الكمية بكر"

  1. عزل الحمض النووي بواسطة تعديل يتولى أو منبس
    1. استخدام لوحة 96-جيدا ومغناطيس مخصصة للوحة 96-جيدا لتجارب صغيرة الحجم-
    2. استخدام خليط الحل الملزمة التالية: تعديل ميليلتر 8 يتولى أو منبس، 10 ميليلتر الصوديوم خلات-HCl (0.75 م، ودرجة الحموضة = 6)، 60 ميليلتر إيثانول 85%، 10 ميليلتر الحمض الخلوي الصبغي (10 10 نسخ الحل).
    3. مزيج جيد من قبل بيبيتينج ومكان لوحة على المغناطيس لمدة 3 دقائق. بينما اللوحة على المغناطيس، إزالة الحل وإضافة 100 ميليلتر من الإيثانول 85% للغسيل.
    4. إزالة الإيثانول.
      ملاحظة: تسمح الإيثانول لتجف لبضع ثوان ولكن لا تدع الجسيمات الجافة الإفراط أو إظهار الشقوق. إذا الجسيمات الجافة الإفراط سيكون من الصعب حل مع الحل شطف.
    5. إزالة اللوحة من المغناطيس وإضافة 40 ميليلتر من شطف الحل. مزيج جيد من قبل بيبيتينج. ضع اللوحة مرة أخرى على المغناطيس وجمع الحمض النووي الوتيد (~ 37 ميليلتر). تخزين الوينت في-20 درجة مئوية إلى مزيد من التحليل.
  2. PCR الكمي
    1. استخدام أجهزة الإشعال التي استخدمت لإعداد الأوراق المالية الحمض النووي في خطوة 4.1.1 التحديد الكمي لنسخ الجين xis، وفقا للبروتوكول من جانب حداد وآخرون- 10
    2. إعداد مزيج الرئيسي حل وفقا لكمية عينات لفحصها، ثم توزيع الخليط في أنابيب PCR أو لوحة خلفية بيضاء 96-جيدا-
    3. استخدام الكميات التالية لوحدة كاملة من مزيج PCR ميليلتر 20: 10 ميليلتر بوليميريز/إينتيركالاتينج خليط الصبغة (انظر الجدول للمواد)، 2 ميليلتر عينة الحمض النووي، 2 ميليلتر الأمام التمهيدي (10 ميكرومتر)، 2 ميليلتر عكس التمهيدي (10 ميكرون)
    4. إعداد ثيرموسيكلير وفقا للبرنامج التالي: 95 درجة مئوية عن 120 s، دورات 40 (95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 64 درجة مئوية لمدة 15 s، 68 درجة مئوية ل 45 s)، 68 درجة مئوية للحد الأدنى 5
      5. حساب عتبة دورة
    5. تريبليكاتيس استخدام المقاييس وعينات، وتشييد منحنى قياسي لتقدير عدد نسخ الحمض النووي التي يتم استردادها في كل عينة. الأداة المستخدمة هنا ينفذ هذا تلقائياً.
    6. هنا، يقدر عدد نسخ الحمض النووي شطف إجمالي حجم (~ 40 ميليلتر). يمكن أن تختلف النسبة المئوية للحمض النووي استرداد المقابلة للمبلغ الأصلي إضافة إلى ربط الحل (تماما 10 نسخ 11) إلى ما بعد الفترة من 0 إلى 100-

6. الحمض النووي-المغناطيسي الجسيمات ربط تحليل استخدام DLS

تجارب
  1. ملزم للحمض النووي
    1. للحجم الكبير (في أنبوب 1.5 مل)، استخدام خليط الحل الملزمة التالية: تعديل ميليلتر 96 يتولى أو منبس، 120 ميليلتر الصوديوم خلات-HCl (0.75 م، ودرجة الحموضة = 6)، 720 ميليلتر إيثانول 85%، 120 ميليلتر الحمض الخلوي الصبغي (10 10 نسخ الحل) أو 120 العازلة HCL تريس ميليلتر (10 ملم، ودرجة الحموضة = 8) لعنصر التحكم.
  2. تحليل المحتملة زيتا
    1. حلول ملزمة تحضير اثنين، أحدهما مع الحمض النووي وآخر مع المخزن المؤقت تريس-HCL لعنصر التحكم كما هو موضح في الخطوة 6.1.1. لتجنب تكوين فقاعات، بعناية "الماصة؛" 800 ميليلتر من خليط ملزمة في خلية المتاح.
      ملاحظة: استخدم ومبومو القابل للقياس من السطح زيتا المحتملة (انظر الجدول للمواد)-
  3. استخدم المعلمات التالية لقياس على صك DLS: نموذج Smoluchowski مع F(ka) 1.5، درجة الحرارة: 25 درجة مئوية، والانكسار المرحلة المشتتة (الحديد): 2.344، الانكسار المشتتة البيئة (المياه): 1.333.
    ملاحظة: معدل الحمض النووي المغناطيسي الجسيمات التفاعل يؤثر تأثيراً مباشرا على قياس replicates. قياس واحد بالصك يأخذ s 60-70. هنا، كلف هذا الصك لأخذ القياسات 10 مع 1 دقيقة فترات التأخير. للبساطة، سيظهر النتائج في الوقت = 0، 2، 4، 6، 8، 10، 12، 14، 16 و 18 دقيقة من القراءة الأولى-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا للتوليف الكيميائي وتعديل المغناطيسي الجسيمات، توليف ستة جزيئات مغناطيسية وتحليل للحمض النووي ملزم. ويرد في الجدول 1موجزاً للتحليل. بمقارنة حجم الجسيمات في الماء وفي حل ملزم، فمن الواضح أن جميع الجزيئات المجمعة في ربط الحل بطيات 2-22. كذلك تجميع بعض الجسيمات إلى طيات أكثر حضور الحمض النووي؛ ولكن هذا كان لا ترتبط مباشرة مع استرجاع الحمض النووي الكشف عنها بواسطة PCR الكمي (الجدول 1). مقارنة زيتا المحتملة (قياسات 10 في فواصل زمنية دقيقة ~ 2) الجسيمات في عناصر التحكم مقابل مع الحمض النووي أظهرت انخفاض حاد في الجسيمات الثلاثة؛ إلا وهي: MNPs_APTES، MMPs_TEOS و MMPs_APTES (الشكل 2). ولوحظت أيضا الاتجاهات في زيتا المحتملة مع مرور الوقت، تظهر الاختلافات في القراءات الثلاث الأولى قبل أنها استقرت في معظم الحالات (الشكل 3). ولوحظ تباين بعد التعرض للحمض النووي معظمها في يتولى (الشكل 2). ولاحظ الانحراف المعياري أقل إهمال القراءات الثلاث الأولى تمثل أول 5 دقائق بعد التعرض لجزيئات الحمض النووي (الجدول 1).

عموما عرض التحليل الوارد في الجدول 1 يبين الخصائص المختلفة لربط الحمض النووي-الجسيمات كما يعزى إلى حجم الجسيمات المغناطيسية والتعديلات الكيميائية. بإيجاز، جسيمات نانوية MNPs_PEI زيادة في الحجم بعد ربط الحمض النووي من طيات الأربعة مع أي تغيير كبير في مؤشر polydispersity أو زيتا المحتملة. ومع ذلك، لم يكن الحمض النووي يمكن استرجاعها في هذا الإجراء. جسيمات نانوية MNPs_TEOS زيادة في الحجم وانخفضت في فهرس بوليديسبيرسيتي مع تغير غير ملحوظ في زيتا المحتملة بعد التعرض للحمض النووي، لكنها كانت الجسيمات أفضل في معدلات استرداد 20.3%. جسيمات نانوية MNPs_APTES انخفاضا طفيفا في حجم وشكل ملحوظ في زيتا المحتملة عند التعرض للحمض النووي. MMPs_PEI المجهرية الدقيقة لم تظهر التغير في الحجم عند التعرض للحمض النووي، ومع ذلك زيادة في مؤشر بوليديسبيرسيتي وانخفضت انخفاضا طفيفا في زيتا المحتملة. MMPs_TEOS المجهرية الدقيقة أظهرت خصائص الحجم بديلة لما نانوحبيبات النظراء أي MNPs_TEOS. من المستغرب، أنهم تناقص ملحوظ في زيتا المحتملة ولكن ليس خارج نطاق المعروضة بواسطة MNPs_TEOS. MMPs_APTES زيادة في حجم الجسيمات عند التعرض للحمض النووي، وانخفضت أيضا في زيتا المحتملة. من المهم أن نلاحظ أن كلا من MNPs_APTES و MMPs_APTES الاحتفاظ بأحجام مماثلة بعد التعديل الكيميائية على الرغم من حقيقة أن جعلوا من مختلفة الحجم السلائف. وقد أظهروا أيضا خصائص ربط مماثلة. وأظهرت MNPs_TEOS تم اكتشاف أي تغيير كبير في زيتا المحتملة بقيمها إلى أقصى حد أدنى في هذه الدراسة.

متابعة مع مرور الوقت لزيتا المحتملة وأظهرت قيم الاستقرار بعد 5-10 دقيقة، لا سيما في حالة منبس (الشكل 3 ألفو 3 ج و 3E). تم العثور على اتجاه مستمر في زيتا المحتملة في بعض القراءات يتولى (الشكل 3B, 3D و 3F). في بعض الحالات، تقابل الاختلافات في زيتا المحتملة للتغيرات في حجم الفهرس والجسيمات بوليديسبيرسيتي ولكن ليس مع استرجاع الحمض النووي قبل شطف.

Figure 1
الشكل 1: نظام البروتوكول. (أ) التعديلات الكيميائية المغناطيسي الجسيمات بما في ذلك بولييثيلينيميني تشعبت، والسليكا والمجموعات الأمينية. (ب) الخطوات عزل الحمض النووي باستخدام المخزن المؤقت ملزم والمغناطيسي الجسيمات معطلة في المغناطيس، تليها PCR الكمي. (ج) تحليل ملزمة الحمض النووي-الجسيمات باستخدام دائرة الأراضي والمساحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: إمكانات زيتا للجسيمات المغناطيسية الممثلة في وجود وعدم وجود الحمض النووي- بسبب التعرض للحمض النووي تظهر انخفاض زيتا المحتملة في MNPs_APTES و MMPs_TEOS و MMPs_APTES. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (N = 10). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: إمكانات زيتا من الجزيئات المغناطيسية الممثل مع مرور الوقت في وجود وعدم وجود الحمض النووي- وتم قياس إمكانات زيتا للجسيمات في ربط الحل في وقت = 0، 2، 4، 6، 8، 10، 12، 14، 16 و 18 دقيقة الفجوة بين منحنيات السيطرة مقابل مع الحمض النووي المحتمل زيتا واضحة في حالات MMPs_TEOS و MNPs_APTES و MMPs_APTES. (أ) إمكانات زيتا MNPs_PEI إيجابية للغاية مما يشير إلى لا تفاعلات. (ب) تناقص إمكانات زيتا MMPs_PEI مع مرور الوقت مما يوحي بوجود تفاعل بطيء جداً بين الجزيئات والحمض النووي. (ج) إمكانيات زيتا MNPs_TEOS كانت سلبية للغاية في غياب ووجود الحمض النووي. (د) يظهر إمكانات زيتا MMPs_TEOS القيم الأدنى في وجود الحمض النووي بالمقارنة مع عناصر التحكم. (ه) يظهر إمكانات زيتا MNPs_APTES القيم الأدنى في وجود الحمض النووي بالمقارنة مع عناصر التحكم. (و) يبين إمكانات زيتا MMPs_APTES قيم أقل في وجود الحمض النووي عند مقارنتها بعناصر التحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الخصائص MNPs_PEI MNPs_TEOS MNPs_APTES MMPs_PEI MMPs_TEOS MMPs_APTES
حجم الجسيمات (nm)
في المياه 141.8 91.3 1106.4 825.0 1281.3 1281.3
في حل ملزم 531.2 1990.1 3091.0 2669.0 2669.0 1990.1
في بيندين
ز الحل مع الحمض النووي 1990.1 3091.0 2669.0 2669.0 1990.1 4145.4 لاحظ تغير زيادة زيادة زيادة مؤشر بوليديسبيرسيتي في المياه 0.237 0.240 0.219 0.410 0.281 0.206 في حل ملزم 0.225 0.773 0.090 0.107 0.374 0.397 في حل ملزم مع الحمض النووي 0.240 0.298 0.282 0.301 0.387 0.319 لاحظ تغير وانخفضت زيادة زيادة زيتا المحتملة (mV) * في حل ملزم 42.29 -27.83 33.23 30.80 -6.86 -0.66 (±SD) 1.15 1.17 2.89 8.99 7.99 5.42 في حل ملزم مع الحمض النووي 41.81 -25.97 12.28 27.81 -23.67 -15.22 (±SD) 2.02 0.80 2.21 4.33 0.95 4.28 لاحظ تغير وانخفضت وانخفضت وانخفضت الكمية بكر استرجاع * * عدد "نسخ الحمض النووي" تم استردادها 1.22E + 03 1.01E + 09 3.18E + 06 1.44E + 06 3.76E + 08 6.88E + 06 (±SD) 8.05E + 02 7.55E + 07 2.83E + 06 1.98E + 06 1.08E + 08 3.33 E + 06 نسبة استرجاع الحمض النووي 0.0 20.3 0.1 0.0 7.5 0.1 (±SD) 0.0 1.5 0.1 0.0 2.2 0.1 * فقط مستقرة القياسات بعد 5 دقائق ملزم ترد (N = 7). * * R² = 0.940 تريبليكاتيس معايير.

الجدول 1: توصيف الجسيمات المغناطيسية الممثل وقدراتهم لربط واسترجاع الحمض النووي- عند التعرض لحل ملزم، أظهرت جميع الجزيئات التجميع (زيادة في حجم الجسيمات). عندما الحمض النووي كان حاضرا في ربط الحل، زيادة حجم الجسيمات كانت مرئية في MNPs_PEI و MNPs_TEOS و MMPs_APTES. وكانت الجسيمات نظم بوليديسبيرسي في الحل، لا سيما MNPs_TEOS الذي أصبح أقل بوليديسبيرسيد عند ربط الحمض النووي ملزم. MNPs_APTES أظهرت زيادة في مؤشر بوليديسبيرسيتي وانخفاض في زيتا المحتملة عند التعرض للحمض النووي. MMPs_TEOS و MMPs_APTES كبيرة وأظهرت انخفاضا في زيتا المحتملة عند التعرض للحمض النووي. MNPs_TEOS و MMPs_TEOS وأظهرت أعلى معدلات لاسترجاع الحمض النووي من 20.3 في المائة و 7.5 في المائة، على التوالي، كما يتضح من PCR الكمي. MNPs_APTES و MMPs_APTES وأظهرت معدلات استرجاع الحمض النووي 0.1%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول، كانت المبادئ النظرية التي تشرح الحمض النووي ملزم بالجسيمات المغناطيسية عن طريق زيتا المحتملة تحت السؤال. ويصف البروتوكول التوليف وتعديل جسيمات نانوية مغناطيسية والمجهرية الدقيقة. كما يتم وصف طريقة لإعداد حل التحكم وربط الحمض النووي. تظهر هاتان الاستراتيجيتان هنا لفحص الحمض النووي-الجسيمات التفاعلات: النهج الكمي PCR ودائرة الأراضي والمساحة. DLS يوفر ثلاثة مؤشرات للتغيرات الفيزيائية الكيميائية في الجزيئات: حجم الجسيمات، ومؤشر بوليديسبيرسيتي وزيتا المحتملة. التغييرات حجم الجسيمات تشير مباشرة إلى التجميع أو التفكك. قيمة مؤشر Polydispersity يصف توزيع الأنواع الجسيمات في النظام تتراوح بين مونوديسبيرسيد (مؤشر < 0.05) لدرجة عالية من بوليديسبيرسيد (مؤشر > 0.7). زيتا المحتملة يمكن أن تصنف الجسيمات وفقا لتهمة السطحي حيث جزيئات بالغة الإيجابية تظهر القيم أكبر من 30 mV والجسيمات سلبية للغاية إظهار قيم أقل من-30 أم. كما كان متوقعا، انخفض احتمال زيتا بوليتشارجيد المغناطيسي الجسيمات في ربط حل نسبيا عند الجسيمات تعرضوا للحمض النووي. الاستثناء لهذه القاعدة هو MNPs_TEOS. تختلف هذه الجسيمات فقط حيث أنها تمتلك شحنة سطحية سلبية للغاية فريدة من نوعها (الشكل 2). وهذا يوحي بأن القوة الأيونية لعبت دوراً هاما في تماسك الجزيئات والحمض النووي والايونات الإيجابية. من ناحية أخرى، يمكن أن يبين التغيرات في حجم الجسيمات دور هطول الأمطار/تجميع جزيئات الحمض النووي أثناء عملية الربط، لا سيما في وجود خيوط الحمض النووي أطول.

أثناء تجميع جزيئات مغناطيسية والتعديلات الكيميائية، هناك العديد من الخطوات الهامة التي تتطلب الاهتمام: أولاً، إمكانية تكرار نتائج أسلوب التوليف يتوقف إلى حد كبير على كميات دقيقة من السلائف الكيميائية المستخدمة في تسيطر توليفي فضلا عن إثارة جيدة وفي الوقت المناسب إضافة NH4يا. للحصول على عدد سكان المتجانس من الجسيمات (من مماثلة حجم وشكل، والكثافة والتكوين)، من المهم أن اتبع sonication وخطوات إثارة تماما عندما أصدر تعليمات. ثانيا، في كثير من الحالات الواقعية التعديلات الكيميائية لا التنبؤ بحقيقة ما هو على السطح المغناطيسي الجسيمات. مطلوب خطوة توصيف شامل للتأكد من أن التركيب الكيميائي لسطح الجسيمات، كما هو موضح في المقطع مقدمة. بين التقنيات المستخدمة عادة، يعتمد الباحثون على فتير، XPS، كهربية، والتحليل الطيفي، فضلا عن دائرة الأراضي والمساحة.

وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الخطوات الحاسمة مطلوبة خلال DLS القياسات والتحليل: أولاً، يؤثر اختيار ربط الحل على خطوات مختلفة بما في ذلك التوافق الكيميائي مع جزيئات الحمض النووي وأيضا الخواص الطيفية. اختيار الانكسار ملزمة مادة الحل والجسيمات يمكن استناداً إلى الدراسات السابقة أو تقييمه بواسطة طرق. ثانيا، ينبغي أن ترصد التفاعلات بين الجسيمات والأقطاب في الترعة عناية كما يمكن أن تؤثر على عملية الحد من أكسدة/القياس. ثالثا، كما هو مبين في الشكل 3، يمكن أن يكون معدل الربط دالة للزمن. من الأهمية بمكان مراعاة استقرار التفاعل، وهذا ميزة كبيرة لتطبيق DLS في مثل هذه الدراسات. هنا، هو رصد المراقب تجميع الجسيمات والتغيرات الفيزيائية في الوقت الحقيقي. رابعا، يمكن تعيين polydispersity نظام القيود على نطاق التحليل. قيمة فهرس Polydispersity أدناه 0.05 يصف نظام مونوديسبيرسيد بينما القيم أعلاه 0.7 وصف نظام بوليديسبيرسيد لأحجام مختلفة من الجسيمات. حجم الجسيمات والتوزيع للجسيمات المختلفة الأنواع يمكن دراستها باستخدام أنواع مختلفة من دائرة الأراضي والمساحة، بما في ذلك العودة-مبعثرة، منتشرة في الجانب ومتناثرة إلى الأمام، كما ورد في البروتوكول قسم 3.1. وأخيراً، sonication الجسيمات قبل اختبار من الواضح أنه يمكن أن يؤثر على خواصها الفيزيائية (مثل الحجم والمساحة السطحية) وإذا فعلت مفرطة يمكن أن يسبب إطلاق سراح بعض التعديلات الكيميائية.

في هذا البروتوكول، تتم مقارنة المعلومات التي حصل عليها عن طريق دائرة الأراضي والمساحة للبيانات التي يحصل عليها من قبل كمية بكر، بكر المعروف أيضا في الوقت الحقيقي. هذا الأخير هو معيار الذهب للكشف وكوانتيتيشن من الحمض النووي. 15 يستخدم تقنية PCR على نطاق واسع في المختبرات والمستشفيات والجامعات. ومع ذلك، عند اختبار الحمض النووي التعرض للرواية والمواد المركبة من المهم أن تتخذ كيمياء PCR في الاعتبار. إنزيم بوليميريز، العنصر الأساسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل، حساس لبعض الموانع الكيميائية ومحسنات. بالإضافة للضوابط الداخلية، اختبار المواد الاصطناعية، وحسن الممارسة المخبرية يمكن أن تساعد في الحد من التحيز في نتائج PCR. آليات العمل لمثبطات ومحسنات تختلف بين المواد الكيميائية التي تربط مباشرة إلى بوليميريز وغيرهم أن يخلب الأيونات من Mg2 +-بوليميريز تعتمد في الحل. بعض الأفكار حول عزل الحمض النووي يصعب الحصول على استخدام فحص PCR. يمكن إظهار DLS الحالات عندما الحمض النووي بربط الجسيمات ولكن بدلاً من ذلك يتم غسلها أو لا الوتي (الحمض النووي لم يتم الكشف عن طريق PCR). على سبيل المثال، MNPs_APTES و MMPs_APTES كبيرة وأظهرت انخفاض في زيتا المحتملة عند التعرض للحمض النووي (الجدول 1) ولكن اكتشفت في شطف الحمض النووي لم ترتبط بهذه النتائج. فمن الممكن لتعديل الربط، الغسيل وشطف حلول للتحكم في إطلاق الحمض النووي من جسيمات. دائرة الأراضي والمساحة أسلوب أسرع نسبيا لتقييم التفاعلات بين الجسيمات الحمض النووي. الاستقرار ومعدل التفاعل ويمكن أيضا ملاحظة بهذه الطريقة (الشكل 3)، التي يمكن أن تؤثر على أساس الوقت المستخدم في جزيئات مغناطيسية-البروتوكولات عزل الحمض النووي.

التحديات التي تواجه استخدام DLS في التحليل على التوالي إلى الأمام. يتطلب هذا الأسلوب حجم عينة كبيرة نسبيا للتحليل (~ 1 مل) بالمقارنة مع بكر. بعض المعلمات مثل الانكسار تتطلب تقييما حذراً عند استخدام الحلول الجديدة في العينات. وعلاوة على ذلك، من الشائع جداً لمراقبة الأكسدة/الحد من ردود الفعل على أقطاب كهربائية من الترعة عند اختبار مادة جديدة. تقييم دقيق ومعرفة التركيب الكيميائي للعينة يمكن أن تساعد في تقييم إمكانية إعادة استخدام ومبومو نفسه. تجدر الإشارة إلى أن التحليل DLS محدودة لخصوصية وحساسية المقدمة من بكر، ومع ذلك يوفر نوعا مختلفاً من البصيرة إلى عملية ربط الحمض النووي-الجسيمات.

مثل جميع التقنيات الطيفية، تهدف التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لدائرة الأراضي والمساحة لتطوير قياسات أكثر دقة وحساسية. يمكن تحقيق ذلك بتوفير فهم أفضل لطبيعة المواد التي اختبرت جسديا وكيميائيا. وبعبارة أخرى، أن الخصائص البصرية والتفاصيل المتعلقة بالتركيب الكيميائي هي المفتاح للحصول على بيانات دقيقة وحساسة من دائرة الأراضي والمساحة. الخصائص البصرية يمكن اكتسابها من خلال طرق، بينما التركيب الكيميائي للجزيئات/سطح جزيئات يمكن دراستها باستخدام تقنيات مختلفة مثل فتير XPS وكهربيه وسائر الطرق الطيفية. في هذا البروتوكول، يمكن تحسين حل ملزم باستخدام مختلف نقاط القوة الأيونية، وكلاء التجفيف الأخرى (مثل الكحول)، ومختلف درجة الحموضة ودرجات الحرارة المنخفضة. من ناحية أخرى، يتم ترك التعديلات الكيميائية لسطح الجسيمات للخيال الصيدليات.

تطوير مواد لعزل الحمض النووي سيواصل الارتفاع في العقود القادمة مع مزيد من التركيز على خصوصية والنقاء والحد من الكشف. نوعية أساليب الاستخراج دوراً هاما في الدراسات المتعلقة بنطاق خلية مفردة، مجداول اتاجينوميك وعينات من أصول غير عادية. في الوقت الحاضر، من المهم القيام بتحليل DLS جسيمات نانوية والمجهرية الدقيقة المعدلة مع أنواع مختلفة من المواد. مطلوب هذه الخطوة قبل إنشاء نموذج نظرية قوية التي تصف سلوك التفاعلات الحمض النووي-الجسيمات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

من المسلم به إلى حد كبير الدعم المالي المقدم من مؤسسة العلوم التشيكية (مشروع GA CR 17-12816S) وعام 2020 سيتيك (LQ1601).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iron(III) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 207926 Magnetic particle synthesis
Iron(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich 380024 Magnetic particle synthesis
Iron(II) sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich F8263 Magnetic particle synthesis
Acetone Penta 10060-11000 Magnetic particle synthesis
Sodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich W302600 Magnetic particle synthesis
Tetraethyl orthosilicate Sigma-Aldrich 131903 Magnetic particle synthesis
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140 Magnetic particle synthesis
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 Sigma-Aldrich 408727 Magnetic particle synthesis
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 221228-M  Magnetic particle synthesis
Ethanol Penta 71250-11000 Magnetic particle synthesis
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P6083 Magnetic particle synthesis
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 1.05012 Magnetic particle synthesis
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) Spectrum labs G235063 Magnetic particle synthesis
Overhead Stirrer witeg Labortechnik GmbH DH.WOS01035 Magnetic particle synthesis
Waterbath Memmert GmbH + Co. 84198998 Magnetic particle synthesis
Sonicator Bandelin 795 Magnetic particle synthesis
BRAND UV cuvette micro Sigma-Aldrich BR759200-100EA Cuvette for size measurement
BRAND cap for UV-cuvette micro Sigma-Aldrich BR759240-100EA Cuvette caps for size measurement
Folded Capillary Zeta Cell Malvern DTS1070 Cuvette for zeta potential measurement
Zetasizer Nano ZS Malvern ZEN3600 Device for measurement of size and zeta potential
Infinite 200 PRO
NanoQuant instrument		 Tecan 396 227 V1.0, 04-2010 device for measurement of DNA concentration
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit Sigma-Aldrich QR0100 PCR kit
Mastercycler pro S instrument Eppendorf 6325 000.013 Thermocycler
MinElute kit Qiagen 28004 DNA purification kit
Sodium acetate Sigma-Aldrich S7670 DNA binding

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
  2. Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
  3. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
  4. Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
  5. Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
  6. Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
  7. Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).
  8. Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
  9. Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
  10. Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
  11. Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
  12. Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
  13. Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
  14. Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
  15. Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).

Tags

الكيمياء، 129 قضية، وعزل الحمض النووي، والجسيمات المغناطيسية، التعديل الكيميائية الحيوية أدى إلى تناثر الضوء، PCR الكمي
الحمض النووي-المغناطيسي الجسيمات ربط التحليل بتشتت الضوء الديناميكي والغرواني الكهربي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haddad, Y., Dostalova, S., Kudr, J., … More

Haddad, Y., Dostalova, S., Kudr, J., Zitka, O., Heger, Z., Adam, V. DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering. J. Vis. Exp. (129), e56815, doi:10.3791/56815 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter