Summary
Этот протокол описывает синтез магнитных частиц и оценки их ДНК связывающих свойств через динамический и электрофоретической рассеяния света. Этот метод сосредоточена на мониторинге изменений в размер частиц, их полиизопрена и крупных Зета потенциал поверхности частиц, которые играют роль в привязке материалов, таких как ДНК.
Abstract
Изоляции ДНК, используя магнитные частицы — это поле большое значение в области биотехнологии и молекулярной биологии исследований. Этот протокол описывает оценки ДНК магнитные частицы, привязка через Динамическое рассеяние света (DLS) и электрофоретической рассеяния света (ПУЖ). Анализ DLS предоставляет ценную информацию о физико-химических свойств частиц, включая размер частиц, полиизопрена и Зета потенциал. Последний описывает поверхности заряд частицы, которая играет важную роль в электростатических привязки материалов, таких как ДНК. Здесь сравнительный анализ эксплуатирует три химической модификации наночастиц и микрочастиц и их влияния на привязки ДНК и элюции. Химические изменения, разветвленных polyethylenimine, исследованы тетраэтилсвинца (3-аминопропил) и orthosilicate triethoxysilane. Поскольку ДНК экспонатов отрицательный заряд, ожидается, что потенциал Зета поверхности частиц будет уменьшаться после связывания ДНК. Формирование кластеров следует также влияет на размер частиц. Для того, чтобы исследовать эффективность этих частиц в изоляции и элюции ДНК, частицы смешиваются с ДНК в низкий рН (~ 6), высокой ионной силы и обезвоживание среды. Частицы помыты на магнит и затем ДНК является этого eluted путем буфера Tris-HCl (рН = 8). Номер копии ДНК оценивается с помощью количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР). Зета потенциал, размер частиц, полиизопрена и количественного PCR данные оцениваются и сопоставляются. DLS — глубокий и поддерживая метод анализа, который добавляет новую перспективу в процесс скрининга частиц для изоляции ДНК.
Introduction
ДНК изоляция является одним из наиболее важных шагов в области молекулярной биологии. Развитие методов извлечения нуклеиновой кислоты имеет большое влияние на новых полях геномики, метагеномики, epigenetics и transcriptomics. Существует широкий спектр биотехнологии для изоляции ДНК, включая медицинские (инструменты судебно-/ диагностические и прогностические biomarkers) и прикладных экологических исследований (метагеномных биоразнообразия, распространением возбудителя и наблюдения). Там было растущий спрос для очистки и изоляции ДНК из различных материалов и в различных масштабах, таких как крови, мочи, почвы, дерево и другие виды выборок. 1 , 2 , 3 , 4
Нано - и микро размера частицы подходят для изоляции ДНК из-за их высокой поверхности и особенно, когда они могут быть поставлены на прикол в с помощью магнитного поля. Физико-химических свойств частиц, таких как размер или заряд, может значительно влияние их способность связывания биомолекул целевой. 5 для дальнейшего расширения связывания биомолекул и стабилизации частиц, различные химические модификации (поверхность покрытия) может быть использован. Много различных стратегий для привязки классифицируются согласно ковалентных и non ковалентные взаимодействий. 6 размер частиц непосредственно влияет на их свойства намагниченности, а состав частиц может быть адаптирована путем включения металла, сплава или других материалов, которые могут влиять на его плотность, пористость и поверхности. 7 Существует нет надежного способа измерения поверхностного заряда мелких частиц. Вместо этого электрический потенциал на плоскости скольжения (на некотором расстоянии от поверхности наночастиц) может быть измерена. 8 это значение называется Зета потенциал и это мощный инструмент, который обычно используется для оценки нано - и тонкодисперсный стабильности через DLS. 9 поскольку ее значение зависит не только от рН и ионной силы дисперсионные окружающей среды, но и на характеристики поверхности частиц, он может также оказаться изменения в этой поверхности, вызванные взаимодействия между частицы и молекулы интерес. 10
С другой стороны структура ДНК в условия сушеный (форма A-ДНК) экспонатов уплотненного конформации, которые облегчают свое высыпание (агрегирование) по сравнению с обычно происходит формы B-ДНК. Электростатические (ионные и H-Бонд) основных сил, контролируя связывания ДНК с другими материалами благодаря их труднодоступных доступной фосфат и азота базы (особенно гуанином). 7 , 10
В этой работе, анализируются три представителя химической модификации магнитные наночастицы и микрочастиц (рис. 1A). Описан метод синтеза и химическая модификация наночастиц и микрочастиц. Решение, что придает теоретические принципы ДНК осадков (рН, ионной силы и обезвоживания), используется для оценки ДНК привязки и элюции. Количественная ПЦР используется для оценки эффективности элюции ДНК от представителя наночастиц и микрочастиц (Рисунок 1B). Размер частиц, индекс полиизопрена и Зета потенциальных являются важными параметрами, которые используются для визуализации физико-химические изменения, которые происходят на поверхности частиц (рис. 1 c). Важно подчеркнуть на химических характеристик поверхности магнитных частиц. Хотя этот шаг выходит за рамки настоящего Протокола, могут применяться несколько современных методов для изучения эффективности химической модификации. 11 , 12 , 13 , 14 инфракрасной спектроскопии преобразование Фурье (FTIR) может использоваться для оценки инфракрасный спектр частиц поверхности и сравнить его с спектр бесплатно химические модификаторы. Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) является другой метод, который может использоваться для определения элементного состава материала поверхности. Другие электрохимические, микроскопические и спектроскопические методы может использоваться для пролить свет на качество частиц синтеза. Эта работа освещает новые перспективы для анализа ДНК магнитные взаимодействия частиц через DLS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. магнитные наночастицы синтез
- , синтез магнитные наночастицы стабилизировалось с цитрат (MNPs)
- добавить 20 ммоль FeCl 3 ∙ 6 H 2 O (5.406 g) и 10 ммоль FeCl 2 ∙ 4 H 2 O (1.988 g) в 20 мл венозная двойной дистиллированную воду (ddd). Перемешать, получено решение энергично в стакан под N 2 атмосферы с помощью механической мешалкой до получения прозрачного раствора.
- Под быстрое механическое перемешивание, добавить 150 мл 1 M NH 4 OH, по капле используя воронку снижается (принять 1 час или больше, если это необходимо). Передача решения в ввертной судна после добавления всех NH 4 OH. Винт решение судна и тепла при 75 ° C на 30 мин
Предупреждение: NH 4 OH классифицируется как агрессивных и опасных для окружающей среды.
Примечание: Подготовьте NH 4 OH раствор из высококачественного 28% NH 4 OH в воде с использованием венозная воды. - Собирать черный осадок с помощью магнита и мыть его с помощью 100 мл воды ddd. Повторите 3 раза. Добавьте 50 мл 0,5 М tri натрия цитрат дигидрат ускорять. Винт корабля.
Примечание: Используйте венозная решение tri натрия цитрат дигидрат. - Повторно дисперсных осадок через sonication (35 кГц, амплитуда 100%) и тепла судна на 80 ° C в течение 1 ч.
Примечание: Sonicator достаточную мощность требуется. - Дайте решение остыть до комнатной температуры. Сбор осадка с помощью магнита и удалить супернатант. Повторно дисперсных Черная грязь в 50 мл воды ddd, с помощью sonicator (35 кГц, амплитуда 100%).
- Передача аликвоты (~ 25 мл) в 50 мл пробирок и добавляют 20 мл ацетона. Центрифуга в 2400 x g 10 мин и удалить supernatants.
- Повторно дисперсных преципитата и dialyze решение против воды с помощью низкой молекулярной массой отсечения диализа устройства (500-1000 Da) подходящего объема за 24 ч.
Примечание: Подготовьте диализа устройство согласно данным производителя ' s требования к.
- Синтез магнитные наночастицы, модифицированные с разветвленной polyethylenimine (MNPs_PEI)
- Добавить 2 мл полученного раствора MNPs (~0.1 г/мл) в стеклянный стакан. Добавление 38 мл воды ddd и sonicate подвеска (10 мин) (35 кГц, амплитуда 100%).
- Под быстрое механическое перемешивание, добавить 10 мл 10% разветвленных polyethylenimine (средняя 25 кДа). Перемешать раствор для последующих 3 h.
- Сбор осадка с помощью магнита и удалить супернатант. Повторно дисперсных осадок в воде ddd 20 мл. Повторите 5 раз, а затем sonicate окончательный подвеска (35 кГц, амплитуда 100%).
- Синтез магнитные наночастицы частиц изменен с силикой (MNPs_TEOS)
- Добавить 10 мл полученного раствора MNPs (~0.1 г/мл) в стеклянный стакан. Добавьте 60 мл воды и 130 мл этанола. Sonicate раствор и добавить 6 мл 28% NH 4 OH.
- Под быстрое механическое перемешивание, добавить 1 мл orthosilicate тетраэтилсвинца. Перемешать раствор для последующих 12 h.
- Собирать черный осадок с помощью магнита и мыть его с использованием 50 мл этанола (3 раза) и 50 мл воды (3 раза). Повторно дисперсных частиц в 10 мл ddd воды и sonicate подвеска (35 кГц, амплитуда 100%).
- Синтез магнитные наночастицы, изменение с аминогруппами (MNPs_APTES)
- Добавить 5 мл полученного раствора MNPs_TEOS (~0.1 г/мл) в стеклянный стакан. Добавьте 45 мл воды и 50 мл этанола. Sonicate решение (35 кГц, амплитуда 100%).
- Под быстрое механическое перемешивание, добавить 0,5 мл (3-аминопропил) triethoxysilane. Перемешать раствор для последующих 3 h.
- Собирать черный осадок с помощью магнита и мыть его с использованием 50 мл этанола (3 раза) и 50 мл воды (3 раза). Повторно дисперсных частиц в 5 мл ddd воды и sonicate подвеска (35 кГц, амплитуда 100%).
2. Магнитные микрочастицы синтез
- , синтез магнитных микрочастицы стабилизировалось с цитрат (MMPs)
- Добавить 25 мл 2 М 3 KNO, 12,5 мл 1 м Кох и 205.875 мл воды ddd в ввертной сосуд. Добавьте 6.675 мл 1 М FeSO 4 во время магнитные перемешивания. Сразу же передачи судна на разогретой водяной бане (90 ° C) за 2 ч.
Примечание: Подготовьте KNO 3 и Кох решения в ddd воды. - Дайте решение остыть до комнатной температуры. Собирайте черный осадок с помощью магнита и мыть его с помощью 50 мл воды ddd (5 раз). Добавьте 50 мл 0,5 М tri натрия цитрат дигидрат ускорять. Винт корабля.
- Redisperse осадок через тепла судна на 80 ° C в течение 1 ч. собирать черный осадок с помощью магнита и мыть его с помощью 50 мл воды ddd (10 раз) и sonication (35 кГц, амплитуда 100%).
- Изменить равенству с разветвленной polyethylenimine (MMPs_PEI), кремний (MMPs_TEOS) и амино группы (MMPs_APTES), аналогичные MNPs протокола. Обратитесь к разделам 2.2, 2.3 и 2.4, соответственно, для получения более подробной информации.
- Добавить 25 мл 2 М 3 KNO, 12,5 мл 1 м Кох и 205.875 мл воды ddd в ввертной сосуд. Добавьте 6.675 мл 1 М FeSO 4 во время магнитные перемешивания. Сразу же передачи судна на разогретой водяной бане (90 ° C) за 2 ч.
- Синтез магнитных микрочастицы, модифицированные с разветвленной polyethylenimine (MMPs_PEI)
- Добавить 5 мл MMPs раствора (~0.1 г/мл) в стеклянный стакан. Добавление 38 мл воды ddd и sonicate решение (35 кГц, амплитуда 100%, 10 мин). Под быстрым механического перемешивания добавьте 10 мл 10% разветвленных polyethylenimine (средняя 25 кДа). Перемешать раствор для последующих 3 h.
- Сбора осадка с помощью магнита и удалить супернатант. Redisperse осадок в 20 мл двойной дистиллированной воды. Повторите 5 раз, а затем sonicate окончательного решения (35 кГц, амплитуда 100%).
- Синтез магнитных микрочастицы, изменение с силикой (MMPs_TEOS)
- Добавить 5 мл MMPs раствора (~0.1 г/мл) в стеклянный стакан. Добавьте 60 мл воды и 130 мл этанола. Sonicate подвеска (35 кГц, амплитуда 100%) и добавить 6 мл 28% NH 4 OH.
- Под быстрое механическое перемешивание, добавить 1 мл orthosilicate тетраэтилсвинца. Перемешать раствор для последующих 12 h.
- Собирать черный осадок с помощью магнита и мыть его с использованием 50 мл этанола (3 раза) и 50 мл воды (3 раза). Redisperse частиц в 5 мл воды ddd и sonicate подвеска (35 кГц, амплитуда 100%).
- Синтез магнитных микрочастицы, изменение с аминогруппами (MMPs_APTES)
- Добавить 3 мл MMPs_TEOS раствора (~0.1 г/мл) в стеклянный стакан. Добавьте 45 мл воды и 50 мл этанола. Sonicate подвеска (35 кГц, амплитуда 100%).
- Под быстрое механическое перемешивание, добавить 0,5 мл (3-аминопропил) triethoxysilane. Перемешать раствор для последующих 3 h.
- Собирать черный осадок с помощью магнита и мыть его с использованием 50 мл этанола (3 раза) и 50 мл воды (3 времени). Redisperse частиц в 3 мл воды ddd и sonicate подвеска (35 кГц, амплитуда 100%).
3. Магнитные частицы размера анализ с помощью DLS
- Размер частиц в воде
- использования DLS инструмент, который применяет детектор угол рассеяния обратно (173 °) и длиной волны света 633 нм.
Примечание: Рассеяния обратно DLS подходит для концентрированных образцов где можно избежать многократного рассеяния. Сторона рассеяния (детектор угол 90°) и вперед рассеяния (детектор угол 15°) DLS подходят для мелких частиц и смешанные частицы, соответственно. - Перед измерением в воде, sonicate частиц на 3 мин
Примечание: Используйте разбавленный раствор частиц. Для этой цели смесь 9.6 мкл частиц с 96 мкл воды. - Тщательно Пипетка 50 мкл раствора частиц в вспененный латекс кюветы и избежать образования пузырьков.
Примечание: Для каждого образца, использовать одноразовые кюветы (см. таблицу материалов). - Отметить четкость кювет и направление пучка света. Вставка ячейки в держателе образца и закрыть камеру.
- Используйте следующие параметры для измерения: температура: 25 ° C; преломления дисперсионные фазы (железо): 2.344; преломления дисперсионные среды (вода): 1.333
Примечание: Выполнять измерения показателя преломления, используя рефрактометр для более точных результатов, особенно при разработке роман или гибридных материалов.
- использования DLS инструмент, который применяет детектор угол рассеяния обратно (173 °) и длиной волны света 633 нм.
4. Подготовка ДНК шток, магнитные частицы и привязки буфера
- ДНК фондовая
- использования 10 мм трис-HCL буфере (рН = 8) для разведения и хранения ДНК. Используйте стандартный образец ДНК, которая может быть усилена с прямой протокол постановки ПЦР в лаборатории (см. раздел 5.2 для реакции параметров и условий). Для того чтобы усилить пары 498 (bp) xis гена от бактериофага λ элемента управления, используйте следующие грунтовки. Вперед грунтовка: 5 ' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Обратный грунтовка: 5 ' - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 '
- очистить ПЦР продукта с использованием коммерческих комплект очистки ДНК.
Примечание: Коммерческие наборы, с помощью процедуры на основе столбцов кремнезема доходность > 100 нг/мкл очищенная ДНК. - Измерения концентрации ДНК спектрофотометрическим методом (поглощение на 260 Нм). Разбавить ДНК акций 10 копий 11/мкл, как указано выше для рабочих растворов из 10 10 10 9, 10 8 и 10 7 копий/мкл.
Примечание: Количество копий продукта PCR можно рассчитать по следующему уравнению, предполагая средней молекулярной массой 650 Да для каждой bp:
ДНК копий/мкл = (количество в нг/мкл * 6.022x10 23 копий/моль) / (498 bp * 650 g/mol bp * 1 х 10 9 нг/г)
- магнитные частицы
- позволяют частицы осадка без магнита и удалить супернатант. Смешать 1:20 v/v соотношение магнитных частиц с ddd водой (частицы: вода).
Примечание: Подход на основе объема используется для описания количество магнитных частиц, поскольку равные массы MNPs и равенству были легко трудно сравнивать.
- позволяют частицы осадка без магнита и удалить супернатант. Смешать 1:20 v/v соотношение магнитных частиц с ddd водой (частицы: вода).
- Привязка буфера
- для быстрой подготовки 0,75 М раствор натрия ацетат HCL (рН = 6), смешать с 3 мл 1 мм HCL 1 мл раствора ацетата натрия 3 М.
Примечание: Все решения, используемые в привязке можно хранить при 4 ° C. Обратите внимание, что низкая температура значительно увеличивает привязки, особенно в случае этанола раствор. Тщательно контролировать температуру решений для лучшей воспроизводимости и точности скрининга.
- для быстрой подготовки 0,75 М раствор натрия ацетат HCL (рН = 6), смешать с 3 мл 1 мм HCL 1 мл раствора ацетата натрия 3 М.
5. Тестирование эффективности ДНК изоляции с помощью количественного PCR
- ДНК изоляции к равенству или MNPs
- используют 96-луночных тарелку и магнит, настроенные для 96-луночных пластина для малого объема экспериментов.
- Использовать следующие привязки решения смесь: 8 мкл изменение равенству или MNPs, 10 мкл натрия ацетат HCl (0,75 М, pH = 6), 60 мкл 85% этанола, 10 мкл ДНК (10 10 копий раствор).
- Смесь хорошо, закупорить и место пластину на магните за 3 мин. В то время как пластину на магните, удалить решение и 100 мкл 85% этанола для мытья.
- Удаление этанола.
Примечание: Разрешить этанола для просушки на несколько секунд, но не позволяйте частицы слишком сухой или трещин. Если частицы чрезмерно сухой они будет трудно растворить с Элюирующий раствор. - Удалить пластину из магнита и 40 мкл Элюирующий раствор. Смешайте хорошо закупорить. Поместите пластины обратно на магните и собирать eluted ДНК (~ 37 мкл). Хранить элюента при-20 ° C до дальнейшего анализа.
- Количественного PCR
- использовать грунты, которые были использованы для подготовки акций ДНК в шаге 4.1.1 для количественного определения копии гена xis, согласно протоколу, Хаддад и др. 10
- приготовляют раствор мастер смеси по объему проб для проверки, а затем распределить смесь ПЦР трубы или белом фоне плиту 96-луночных.
- Использовать следующие количества полный объем 20 мкл смеси ПЦР: 10 мкл полимеразы / вставочный краситель смеси (см. таблицу материалов), 2 мкл пример ДНК, 2 мкл вперед грунт (10 мкм), 2 мкл обратный грунт (10 мкм)
- Настройка Термоциклер по следующей программе: 95 ° C в течение 120 s, 40 циклов (95 ° C 15 s, 64 ° C 15 s, 68 ° C на 45 s), 68 ° C за 5 мин
- Использование triplicates стандарты и образцы, рассчитать порог цикла и построить калибровочной кривой оценить количество копий ДНК, извлеченные в каждом образце. Инструмент, используемый здесь выполняет это автоматически.
- Здесь, количество копий ДНК оценивается для всего элюции тома (~ 40 мкл). Процент ДНК получены соответствующие первоначальная сумма добавляется обязательную силу решение (полностью 10 11 экземпляров) может меняться за пределами интервала 0 к 100.
6. ДНК магнитные частицы привязки анализ с помощью DLS
- Связывания ДНК
- для большого объема экспериментов (в 1,5 мл), используйте следующие привязки решения смесь: 96 мкл изменение равенству или MNPs, 120 мкл натрия ацетат HCl (0,75 М, pH = 6), 720 мкл 85% этанола, 120 мкл ДНК (10 10 копий решения) или 120 мкл буфера Tris-HCL (10 мм, pH = 8) для элемента управления.
- Анализ потенциальных Зета
- подготовить две привязки решения, один с ДНК, а другой с трис-HCL буфере для элемента управления, как описано в шаге 6.1.1. Чтобы избежать образования пузырьков, тщательно Пипетка 800 мкл привязки смеси в ячейку одноразовые.
Примечание: Используйте одноразовые кюветы для измерения поверхности Зета потенциальных (см. таблицу материалов).
- подготовить две привязки решения, один с ДНК, а другой с трис-HCL буфере для элемента управления, как описано в шаге 6.1.1. Чтобы избежать образования пузырьков, тщательно Пипетка 800 мкл привязки смеси в ячейку одноразовые.
- Используйте следующие параметры для измерения на DLS инструмент: Смолуховский модель с F(ka) 1.5, температура: 25 ° C, преломления дисперсионные фазы (железо): 2.344, преломления дисперсионные среды (вода): 1.333.
Примечание: Уровень ДНК магнитные взаимодействия частиц непосредственно влияет на измерение реплицирует. Однократное измерение документа занимает 60-70 s. Здесь инструмент было поручено принять 10 измерений с 1 мин интервалом задержки. Для простоты, результаты будут показаны в время = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 18 мин в первом чтении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя протокол, описанные здесь для химического синтеза и модификации магнитных частиц, шесть магнитные частицы были синтезированы и проанализированы для связывания ДНК. Краткий отчет о анализа показано в таблице 1. Сравнивая размер частиц в воде и в растворе привязки, становится ясно, что все частицы объединяются в обязательное решение, 2-22 складок. Некоторые частицы далее статистически более складки присутствии ДНК; Однако это не было непосредственно связано с ДНК поиска определяется количественным PCR (Таблица 1). Сравнение Зета потенциальных (10 измерений в ~ 2 мин интервалами) частиц в элементах управления по сравнению с ДНК показал резкое падение трех частиц; а именно: MNPs_APTES, MMPs_TEOS и MMPs_APTES (рис. 2). Также были отмечены тенденции в Зета потенциальным временем, показаны различия в первых трех чтениях, прежде чем они стабилизируются в большинстве случаев (рис. 3). Изменения после воздействия ДНК основном наблюдалось в равенству (рис. 2). Нижняя стандартное отклонение было отмечено пропуск первых трех чтениях, представляющая первые 5 мин после воздействия частиц к ДНК (Таблица 1).
Общий вид анализа в таблице 1 показывает различные характеристики привязки ДНК частица, приписываемых размер магнитных частиц и химические изменения. Кратко MNPs_PEI наночастиц увеличенные в размере после привязки ДНК в четыре раза без значительного изменения в полиизопрена индекс или Зета потенциал. Однако ДНК не извлеченных в этой процедуре. MNPs_TEOS наночастиц увеличился в размерах и сократился в полиизопрена индекс с незаметные изменения в Зета потенциальных после воздействия ДНК, но они были лучшие частицы ставок их поиска на 20,3%. MNPs_APTES наночастиц незначительно сократилась в размерах и заметно в потенциальных под воздействием ДНК Зета. MMPs_PEI микрочастицы не показывают изменения в размер под воздействием ДНК, однако они увеличение индекса полиизопрена и несколько снизился в Зета потенциал. MMPs_TEOS микрочастицы показан альтернативный размер характеристики их наночастиц коллегами т.е. MNPs_TEOS. Удивительно они заметно снизилась в Зета потенциальных, но не за пределами диапазона от MNPs_TEOS. MMPs_APTES увеличение размера частиц под воздействием ДНК и также снизилась в Зета потенциал. Важно отметить, что MNPs_APTES и MMPs_APTES сохранить аналогичных размеров, после того, как химическая модификация, несмотря на тот факт, что они были сделаны из разных размеров прекурсоров. Они также продемонстрировали аналогичные свойства привязки. MNPs_TEOS показали, никаких существенных изменений в Зета потенциал по их значениям в низких экстремальных были обнаружены в этом исследовании.
Следить за течением времени для потенциальных Зета показал стабилизации значения после 5-10 мин, особенно в случае MNPs (Рисунок 3A, 3 C и 3E). Непрерывная тенденция в Зета потенциал был найден в некоторых MMPs чтений (Рисунок 3В, 3D и 3F). В некоторых случаях вариации в Зета потенциальных соответствует вариации в полиизопрена индекс и размер частиц, но не с извлечения ДНК, элюирование.
Рисунок 1: Схема протокола. (A) химические модификации магнитных частиц, включая разветвленные полиэтиленимина, кремний и амино группы. (B) ДНК изоляции шаги с помощью привязки буфер и магнитные частицы, иммобилизованных на магнит, следуют количественного PCR. (C) анализ привязки ДНК частиц с помощью DLS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: потенциал представителя магнитных частиц в присутствии и отсутствии ДНК Зета. Подверженности ДНК вызвало видно уменьшение Зета потенциал в MNPs_APTES, MMPs_TEOS и MMPs_APTES. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение (N = 10). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Зета потенциал представителя магнитных частиц с течением времени в присутствии и отсутствии ДНК. Зета потенциал частиц в обязательное решение было измерено время = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 18 минут разрыв между Зета потенциальные кривые управления против с ДНК очевидны в случае MMPs_TEOS, MNPs_APTES и MMPs_APTES. (A) Zeta потенциал MNPs_PEI является весьма положительной, указывающее без взаимодействий. (B) Zeta потенциал MMPs_PEI снизилась с течением времени, предлагая очень медленно взаимодействие между частицами и ДНК. (C) Zeta потенциал MNPs_TEOS был весьма отрицательным в отсутствие и наличие ДНК. (D) Zeta потенциал MMPs_TEOS показывает более низкие значения в присутствии ДНК по сравнению с элементами управления. (E) Zeta потенциал MNPs_APTES показывает более низкие значения в присутствии ДНК по сравнению с элементами управления. (F) Zeta потенциал MMPs_APTES показывает более низкие значения в присутствии ДНК по сравнению с элементами управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Характеристики | MNPs_PEI | MNPs_TEOS | MNPs_APTES | MMPs_PEI | MMPs_TEOS | MMPs_APTES |
| Размер частиц (Нм) | ||||||
| в воде | 141.8 | 91.3 | 1106.4 | 825.0 | 1281.3 | 1281.3 |
| в привязку решения | 531.2 | 1990.1 | 3091.0 | 2669.0 | 2669.0 | 1990.1 |
| в обяз |
Таблица 1: характеристика представитель магнитные частицы и их способности связывать и извлекать ДНК. Под воздействием решение все частицы показал агрегации (увеличение размера частиц). Когда ДНК присутствовал в обязательное решение, увеличение размера частиц был виден в MNPs_PEI, MNPs_TEOS и MMPs_APTES. Частицы были полидисперсных систем в обязательное решение, особенно MNPs_TEOS, которая стала меньше Полидисперсный после связывания ДНК. MNPs_APTES показал увеличение индекса полиизопрена и уменьшения потенциальных под воздействием ДНК Зета. MMPs_TEOS и MMPs_APTES, показал большое снижение потенциальных под воздействием ДНК Зета. MNPs_TEOS и MMPs_TEOS показал самые высокие темпы извлечения ДНК 20,3% и 7,5%, соответственно, как показано на количественного PCR. MNPs_APTES и MMPs_APTES показали показатели извлечения ДНК 0,1%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе теоретические принципы, которые объясняют ДНК привязки магнитные частицы через Зета потенциальных были под вопросом. Протокол описывает синтеза и модификации магнитные наночастицы и микрочастиц. Способ подготовки элемента управления и привязки решения ДНК также описаны. Здесь показаны две стратегии для проверки взаимодействия ДНК частиц: Количественная ПЦР и DLS подходы. DLS предоставляет три показатели физико-химических изменений в частицы: размер частиц, индекс полиизопрена и Зета потенциал. Изменения размера частиц непосредственно указывают агрегации или дезинтеграции. Значение индекса полиизопрена описывает распределение видов частиц в системе, начиная от монодисперсными (индекс < 0,05) до весьма Полидисперсный (индекс > 0,7). Зета потенциал можно классифицировать частиц по поверхности заряда, где весьма позитивные частицы Показать значения больше чем 30 МВ и весьма отрицательные частицы показывают значения, ниже -30 МВ. Как предсказано потенциал Зета polycharged магнитных частиц в обязательную силу решения относительно сократились, когда частицы были подвержены ДНК. Исключение из этого правила является MNPs_TEOS. Эти частицы отличаются только в том, что они обладают уникальным весьма отрицательный заряд поверхности (рис. 2). Это свидетельствует о том, что ионной силы играют важную роль в проведении частицы, ДНК и положительных ионов вместе. С другой стороны изменения в размер частиц может указывать роль осадков/агрегации ДНК-частиц во время процесса привязки, особенно в присутствии более нитей ДНК.
Во время синтеза магнитные частицы и химической модификации, существует несколько важных шагов, которые требуют внимания: во-первых, воспроизводимость метода синтеза во многом зависит от точных количеств химических прекурсоров, используемых в синтеза, а также хорошее перемешивание и своевременно управлять добавлением NH4OH. Приобрести гомогенизированные населения частиц (аналогичного размера, формы, плотность и состав), важно следовать sonication и перемешивания шаги тщательно проинструктировано. Во-вторых во многих случаях реалистичные химические модификации не предсказать реальность того, что находится на поверхности магнитных частиц. Всеобъемлющее описание шаг необходим для подтверждения химический состав поверхности частицы, как описано в разделе Введение. Среди используемых методов исследователи полагаются на ФУРЬЕ, XPS, электрохимии, спектроскопии, а также DLS.
Кроме того, во время DLS измерений и анализа требуются некоторые важнейшие шаги: во-первых, выбор привязки решения влияет на различные шаги, включая химическую совместимость с частицами и ДНК, а также спектральных свойств. Выбор преломления привязки решения и частиц материала может быть основаны на предыдущих исследований или оценена рефрактометрия. Во-вторых взаимодействие между частицами и электродов в кюветы должны контролироваться тщательно как процесс окисления/сокращения может повлиять на измерение. В-третьих как показано на рисунке 3, уровень привязки может быть функцией времени. Очень важно соблюдать стабильность взаимодействия, и это является основным преимуществом для применения DLS в таких исследованиях. Здесь наблюдателя является мониторинг агрегации частиц и физико-изменения в режиме реального времени. В-четвертых полиизопрена системы можно задать ограничения сферы охвата анализа. Полиизопрена значение индекса ниже 0,05 описывает систему монодисперсными хотя выше 0,7 значения описывают Полидисперсный систему различных размеров частиц. Размер частиц и распределения различных частиц, что виды могут быть изучены с помощью различных типов списков, включая обратно рассеянном, сторона разбросаны и вперед разбросаны, как указано в протоколе раздел 3.1. Наконец sonication частиц до тестирования, очевидно, что может повлиять на их физические свойства (например , размер и площадь поверхности), и если сделано чрезмерно это может вызвать освобождение некоторых химических изменений.
В этом протоколе информацию, полученную через DLS сравнивается с данными количественного PCR, также известный как в реальном масштабе времени PCR. Последний является золотым стандартом для обнаружения и количественный ДНК. 15 ПЦР техника широко используется в лабораториях, больницах и университетах. Однако когда тестирование ДНК подверженности Роман и синтезированных материалов важно принять химии ПЦР во внимание. Полимераза фермент, ключевым элементом цепной реакции полимеразы, чувствителен к некоторых химических ингибиторов и усилители. Помимо внутреннего контроля, тестирования из синтетических материалов и хорошо лабораторная практика может помочь уменьшить предубеждения в результаты ПЦР. Химических веществ, которые напрямую связать полимеразы и другие, которые хелат ионов от мг2 +различаются механизмы действий ингибиторы и усилители-зависимых полимеразы в растворе. Некоторые идеи на ДНК изоляции трудно получить используя PCR скрининг. DLS можно показать случаи, когда ДНК связывается с частицами, но довольно мыть или не элюировать (ДНК не обнаружено методом ПЦР). К примеру MNPs_APTES и MMPs_APTES, показали значительное снижение Зета потенциал по ДНК воздействия (Таблица 1), но ДНК, обнаруженных в элюции сделал не коррелируют с эти результаты. Это позволяет изменить привязку, Стиральная, элюирование решения для контроля выпуска ДНК от частиц. DLS — это сравнительно быстрый метод для оценки взаимодействия ДНК частиц. Стабильность и скорость взаимодействия может также наблюдаться этим методом (рис. 3), который может повлиять на время, используемое в магнитные частицы - основанный протоколы изоляции дна.
Для использования в анализе DLS стоят прямо вперед. Этот метод требует объем сравнительно большой выборки для анализа (~ 1 мл), по сравнению с ПЦР. Некоторые параметры как преломления требуют тщательной оценки при использовании новых решений в образцах. Кроме того это очень часто можно наблюдать реакции окисления/сокращение на электродах кюветы при тестировании Роман материала. Тщательной оценки и знаний химического состава образца может помочь оценить возможности повторного использования же кювет. Стоит отметить что DLS анализ ограничивается специфичность и чувствительность, предоставляемые ПЦР, но он предоставляет различные виды понимание процесса привязки ДНК частиц.
Как все спектроскопических методов модификации и устранение DLS цель для разработки более точных и чувствительных измерений. Это может быть достигнуто путем предоставления лучшего понимания характера материалов, протестированных физически и химически. Другими словами оптические свойства и детали химического состава являются ключом для получения точных и конфиденциальных данных от DLS. Оптические свойства может быть приобретена рефрактометрия, в то время как химический состав частиц / поверхности частиц могут быть изучены различные методы, такие как FTIR, XPS, электрохимии и другими спектральными методами. В этом протоколе привязки решения можно улучшить с помощью различных ионных сильные, другие обезвоживания агентов (например изопропиловый спирт), различных рН и низких температурах. С другой стороны химической модификации поверхности частиц остается химиков воображения.
Разработка материалов для изоляции ДНК будет продолжать расти в ближайшие десятилетия с уделением большего внимания специфичности, чистоты и предел обнаружения. Качество методов извлечения играет важную роль в исследованиях по одной ячейке масштаба, мetagenomic весы и образцы необычных происхождения. В настоящее время это важно для выполнения анализа DLS наночастиц и микрочастицы, модифицированные с различных видов материалов. Этот шаг требуется до создания сильной теоретическую модель, которая описывает поведение взаимодействия ДНК частиц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Финансовой поддержке CEITEC 2020 (LQ1601) и чешский научного фонда (проект GA CR 17-12816S) сильно признал.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
| Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
| Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
| ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
| Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
| Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
| Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
| BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
| BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
| Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
| Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
| SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
| Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |
References
- Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
- Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
- Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
- Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
- Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
- Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).
- Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
- Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
- Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
- Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
- Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
- Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
- Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
