DNA-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica

Summary

Questo protocollo descrive la sintesi delle particelle magnetiche e valutazione delle loro proprietà di legame al DNA tramite dispersione della luce dinamica ed elettroforetica. Questo metodo si concentra sul monitoraggio dei cambiamenti nella dimensione delle particelle, loro polidispersità e potenziale zeta della superficie delle particelle che svolgono importanti ruolo nell'associazione di materiali come il DNA.

Abstract

Isolamento di DNA usando particelle magnetiche è un campo di grande importanza nella ricerca di biologia molecolare e biotecnologia. Questo protocollo descrive la valutazione del DNA-magnetoscopico vincolante tramite diffusione dinamica della luce (DLS) e dispersione della luce elettroforetica (ELS). Analisi di DLS fornisce preziose informazioni sulle proprietà fisico-chimiche delle particelle tra cui la dimensione delle particelle, polidispersità e potenziale zeta. Quest'ultimo descrive la carica superficiale della particella che svolge un ruolo importante nell'associazione elettrostatica di materiali come il DNA. Qui, un'analisi comparativa sfrutta tre modifiche chimiche di nanoparticelle e microparticelle e loro effetti sul legame del DNA e di eluizione. Modificazioni chimiche di ramificata polyethylenimine, tetraetile ortosilicato e (3-amminopropil) trietossisilano sono studiati. Poiché DNA esibisce una carica negativa, si prevede che il potenziale zeta della superficie della particella diminuirà legandosi di DNA. Formando dei cluster dovrebbe essere estesa anche dimensione delle particelle. Al fine di indagare l'efficacia di queste particelle in isolamento ed eluizione del DNA, le particelle sono mescolate con DNA a basso pH (~ 6), alta forza ionica e ambiente di disidratazione. Le particelle vengono lavate il magnete e quindi il DNA è eluito dal tampone Tris-HCl (pH = 8). Numero di copie di DNA è stimato usando reazione a catena quantitativa della polimerasi (PCR). Potenziale Zeta, dimensione delle particelle, polidispersità e dati quantitativi di PCR sono valutati e confrontati. DLS è un perspicace e sostenere il metodo di analisi che aggiunge una nuova prospettiva al processo di proiezione di particelle per isolamento del DNA.

Introduction

Isolamento del DNA è uno dei passi più importanti nella biologia molecolare. Lo sviluppo di metodi di estrazione dell'acido nucleico ha grande impatto sui campi emergenti della genomica, metagenomica, epigenetica e trascrittomica. C'è una vasta gamma di applicazioni biotecnologiche per isolamento del DNA compreso medico (strumenti forensi/diagnostica e biomarcatori prognostici) e applicazioni ambientali (biodiversità metagenomica, la prevalenza del patogeno e sorveglianza). C'è stata la crescente domanda di purificare e isolare il DNA da materiali diversi e in diverse scale come sangue, urina, terra, legno e altri tipi di campioni. ^{1 , 2 , 3 , 4}

Particelle di nano - e micro-imprese sono adatte per isolamento del DNA a causa della loro elevata area superficiale e in particolare quando essi possono essere immobilizzati da un campo magnetico. Proprietà fisico-chimiche delle particelle, ad esempio dimensioni o carica, può notevolmente influenzare la loro capacità di legare biomolecole di destinazione. ⁵ per migliorare ulteriormente l'associazione di biomolecole e stabilizzare le particelle, diverse modificazioni chimiche (rivestimenti superficiali) possono essere utilizzati. Le diverse strategie per l'associazione sono classificate secondo le interazioni covalenti e non covalenti. ⁶ la dimensione delle particelle influenza direttamente la loro proprietà di magnetizzazione, considerando che la composizione delle particelle può essere adattato per incorporazione di metallico, lega o altri materiali che possono influire sulla sua densità, porosità e superficie. ⁷ non c'è alcun modo affidabile per misurare la carica superficiale di piccole particelle. Invece, il potenziale elettrico piano di scivolamento (certa distanza dalla superficie delle nanoparticelle) può essere misurata. ⁸ questo valore è chiamato potenziale zeta ed è un potente strumento che solitamente utilizzato per la valutazione della stabilità di nano e microparticelle tramite liste di distribuzione. ⁹ poiché il suo valore dipende non solo il pH e forza ionica dell'ambiente dispersivo, ma anche le caratteristiche della superficie delle particelle, può anche dimostrare i cambiamenti in questa superficie causata dall'interazione tra la particelle e molecola di interesse. ¹⁰

D'altra parte, la struttura del DNA in condizioni disidratate (modulo A-DNA) esposizioni compattato conformazioni che facilitano la relativa precipitazione (aggregazione) rispetto a comunemente che si verificano forma B-DNA. Elettrostatica (ionico e H-bond) sono le principali forze che controllano l'associazione del DNA da altri materiali a causa di loro fosfato stericamente accessibile e azoto basi (in particolare guanina). ^{7 , 10}

In questo lavoro, sono analizzate tre modifiche chimiche rappresentative di nanoparticelle magnetiche e microparticelle (Figura 1A). Il metodo di sintesi e modificazione chimica di nanoparticelle e microparticelle è descritto. Una soluzione di associazione, che accordi ai principi teorici di precipitazione del DNA (pH, forza ionica e disidratazione), viene utilizzata per valutare l'eluizione e grippaggio del DNA. PCR quantitativa viene utilizzata per valutare l'efficienza di eluizione del DNA dalla rappresentante nanoparticelle e microparticelle (Figura 1B). Dimensione delle particelle, l'indice di polidispersione e potenziale zeta sono parametri importanti che vengono utilizzati per visualizzare le modifiche fisico-chimiche che si verificano sulla superficie della particella (Figura 1). È importante sottolineare la caratterizzazione chimica della superficie della particella magnetica. Mentre questo passaggio era oltre l'ambito del presente protocollo, diverse moderne tecniche possono essere applicate per studiare l'efficienza delle modificazioni chimiche. ^{11 , 12 , 13 , 14} spettroscopia infrarossa trasformata di Fourier (FTIR) può essere utilizzata per valutare lo spettro infrarosso della superficie della particella e confrontarlo con lo spettro dei modificatori chimici gratis. Spettroscopia fotoelettronica a raggi x (XPS) è un'altra tecnica che può essere utilizzata per identificare la composizione elementare della superficie del materiale. Altri metodi elettrochimici, microscopiche e spettroscopiche utilizzabile per far luce sulla qualità della sintesi delle particelle. Questo lavoro evidenzia una nuova prospettiva per l'analisi di interazioni DNA-magnetiche di particelle tramite liste di distribuzione.

Protocol

1. sintesi di nanoparticelle magnetiche

1. sintesi di nanoparticelle magnetiche stabilizzato con citrato (MNPs)
   1. aggiungere 20 mmol di FeCl ₃ ∙ 6 H ₂ O (5,406 g) e 10 mmol di FeCl ₂ ∙ 4 H ₂ O (1,988 g) in 20 mL di acqua distillata doppia deossigenata (ddd acqua). Mescolare ottenuti soluzione vigorosamente in Becher sotto atmosfera di ₂ N tramite agitatore meccanico fino ad ottenuta una soluzione trasparente.
   2. Sotto agitazione meccanica rapida, aggiungere 150 mL di 1m NH ₄ OH, goccia a goccia utilizzando imbuto (prendere 1 ora o più se necessario). Dopo aver aggiunto tutti gli NH ₄ OH, trasferire la soluzione in un recipiente avvitabile. Avvitare la soluzione nave e calore a 75 ° C per 30 min.
      Attenzione: NH ₄ OH è classificato come corrosivo e pericoloso per l'ambiente.
      Nota: Preparare soluzione NH ₄ OH alto grado 28% NH ₄ OH in acqua usando acqua deossigenata.
   3. Raccogliere il precipitato nero utilizzando il magnete e lavare con 100 mL di acqua di ddd. Ripetere 3 volte. Aggiungere 50 mL di 0.5 M tri-sodio citrato diidrato di precipitare. Avvitare la nave.
      Nota: Utilizzare deossigenata soluzione di tri-sodio citrato diidrato.
   4. Ri-disperdere il precipitato tramite sonicazione (35 kHz, ampiezza del 100%) e nave di calore a 80 ° C per 1 h.
      Nota: È necessario un sonicatore di potenza sufficiente.
   5. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente. Raccogliere il precipitato utilizzando un magnete e rimuovere il surnatante. Ri-disperdere fango nero in 50 mL di acqua di ddd utilizzando sonicatore (35 kHz, ampiezza del 100%).
   6. Trasferire aliquote (~ 25 mL) in provette da centrifuga 50 mL e aggiungere 20 mL di acetone. Centrifugare a 2400 x g per 10 min e rimuovere i surnatanti.
   7. Ri-disperdere precipitato e Dializzare soluzione contro acqua utilizzando il dispositivo di dialisi di taglio basso peso molecolare (Da 500-1.000) di volume adatto per 24 h.
      Nota: Preparare il dispositivo di dialisi secondo produttore ' requisiti di s.
2. Sintesi di nanoparticelle magnetiche modificate con ramificati polyethylenimine (MNPs_PEI)
   1. aggiungere 2 mL di soluzione ottenuta allontaneranno (~0.1 g/mL) in un becher di vetro. Aggiungere 38 mL di acqua di ddd e Sonicare (35 kHz, ampiezza del 100%) la sospensione (10 min).
   2. Sotto agitazione meccanica rapida, aggiungere 10 mL di 10% si è ramificata polyethylenimine (media 25 kDa). Mescolare la soluzione per le successive 3 h.
   3. Raccogliere precipitare con magnete e rimuovere il surnatante. Ri-disperdere precipitato in 20 mL di acqua di ddd. Ripetere 5 volte quindi sottoporre ad ultrasuoni la sospensione finale (35 kHz, ampiezza del 100%).
3. Sintesi di nanoparticelle magnetiche particelle modificato con silice (MNPs_TEOS)
   1. aggiungere 10 mL della soluzione ottenuta allontaneranno (~0.1 g/mL) in un becher di vetro. Aggiungere 60 mL di acqua e 130 mL di etanolo. Sottoporre ad ultrasuoni soluzione e aggiungere 6 mL di 28% NH ₄ OH.
   2. Sotto agitazione meccanica rapida, aggiungere 1 mL di ortosilicato. Mescolare la soluzione per le successive 12 h.
   3. Raccogliere precipitato nero con magnete e lavarlo con 50 mL di etanolo (3 volte) e 50 mL di acqua (3 volte). Ri-disperdere le particelle in 10 mL di ddd acqua e Sonicare la sospensione (35 kHz, ampiezza del 100%).
4. Sintesi di nanoparticelle magnetiche modificate con gruppi amminici (MNPs_APTES)
   1. aggiungere 5 mL della soluzione ottenuta MNPs_TEOS (~0.1 g/mL) in un becher di vetro. Aggiungere 45 mL di acqua e 50 mL di etanolo. Sottoporre ad ultrasuoni soluzione (35 kHz, ampiezza del 100%).
   2. Sotto agitazione meccanica rapida, aggiungere 0,5 mL di trietossisilano (3-amminopropil). Mescolare la soluzione per le successive 3 h.
   3. Raccogliere precipitato nero con magnete e lavarlo con 50 mL di etanolo (3 volte) e 50 mL di acqua (3 volte). Ri-disperdere le particelle in 5 mL di ddd acqua e Sonicare la sospensione (35 kHz, ampiezza del 100%).

2. Sintesi di microparticelle magnetiche

1. sintesi di microparticelle magnetiche stabilizzato con citrato (MMPs)
   1. aggiungere 25 mL di 2m KNO ₃, 12,5 mL di 1 M di KOH e 205,875 mL di acqua di ddd in un vaso avvitabile. Aggiungere mL 6,675 di 1m FeSO ₄ durante l'agitazione magnetica. Immediatamente la nave trasferimento ad un bagno di acqua preriscaldata (90 ° C) per 2 h.
      Nota: Preparare soluzioni KOH in ddd e KNO ₃ acqua.
   2. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente. Raccogliere il precipitato nero utilizzando il magnete e lavare con 50 mL di acqua di ddd (5 volte). Aggiungere 50 mL di 0.5 M tri-sodio citrato diidrato di precipitare. Avvitare la nave.
   3. Redisperse il precipitato tramite sonicazione (35 kHz, ampiezza del 100%) e nave di calore a 80 ° C per raccogliere precipitato nero h. 1, utilizzando il magnete e lavare con 50 mL di acqua di ddd (10 volte).
   4. Modificare MMPs con ramificati polyethylenimine (MMPs_PEI), silice (MMPs_TEOS) ed i gruppi amminici (MMPs_APTES) simile al protocollo allontaneranno. Fare riferimento alle sezioni 2.2, 2.3 e 2.4, rispettivamente per maggiori dettagli.
2. Sintesi di microparticelle magnetiche modificate con ramificati polyethylenimine (MMPs_PEI)
   1. aggiungere 5 mL di soluzione di MMPs (~0.1 g/mL) in un becher di vetro. Aggiungere 38 mL di acqua di ddd e Sonicare la soluzione (35 kHz, ampiezza del 100%, 10 min). Sotto agitazione meccanica rapida aggiungere 10 mL di 10% si è ramificata polyethylenimine (media 25 kDa). Mescolare la soluzione per le successive 3 h.
   2. Raccogliere precipitato utilizzando un magnete e rimuovere il surnatante. Redisperse precipitato in 20 mL di acqua distillata doppia. Ripetere 5 volte quindi sottoporre ad ultrasuoni la soluzione finale (35 kHz, ampiezza del 100%).
3. Sintesi di microparticelle magnetiche modificate con silice (MMPs_TEOS)
   1. aggiungere 5 mL di soluzione di MMPs (~0.1 g/mL) in un becher di vetro. Aggiungere 60 mL di acqua e 130 mL di etanolo. Sottoporre ad ultrasuoni sospensione (35 kHz, ampiezza del 100%) e aggiungere 6 mL di 28% NH ₄ OH.
   2. Sotto agitazione meccanica rapida, aggiungere 1 mL di ortosilicato. Mescolare la soluzione per le successive 12 h.
   3. Raccogliere precipitato nero utilizzando un magnete e lavarlo con 50 mL di etanolo (3 volte) e 50 mL di acqua (3 volte). Redisperse particelle in 5 mL di acqua di ddd e Sonicare la sospensione (35 kHz, ampiezza del 100%).
4. Sintesi di microparticelle magnetiche modificate con gruppi amminici (MMPs_APTES)
   1. aggiungere 3 mL di soluzione di MMPs_TEOS (~0.1 g/mL) in un becher di vetro. Aggiungere 45 mL di acqua e 50 mL di etanolo. Sottoporre ad ultrasuoni la sospensione (35 kHz, ampiezza del 100%).
   2. Sotto agitazione meccanica rapida, aggiungere 0,5 mL di trietossisilano (3-amminopropil). Mescolare la soluzione per le successive 3 h.
   3. Raccogliere precipitato nero con magnete e lavarlo con 50 mL di etanolo (3 volte) e 50 mL di acqua (3 volte). Redisperse particelle in 3 mL di acqua di ddd e Sonicare la sospensione (35 kHz, ampiezza del 100%).

3. Magnetiche delle particelle dimensione analisi utilizzando DLS

1. dimensione delle particelle in acqua
   1. uso un DLS strumento che si applica un angolo di rilevatore di dispersione posteriore (173 °) e una lunghezza d'onda del fascio di 633 nm.
      Nota: Back scattering DLS è adatto per campioni concentrati dove può essere evitato quantistico. Scattering avanti (angolo di rilevatore 15°) e dispersione laterale (angolo 90° del rivelatore) DLS sono adatti per le particelle più piccole e misto particelle, rispettivamente.
   Sonicare
   2. priore a misura in acqua, particelle per 3 min.
      Nota: Utilizzare soluzione diluita delle particelle. Per questo scopo, è necessario mescolare 9,6 µ l di particelle con 96 µ l di acqua.
   3. Attentamente Pipettare 50 µ l di soluzione di particelle in lattice in polistirolo le provette ed evitare la formazione di bolle.
      Nota: Per ogni campione, utilizzare cuvette monouso (Vedi tabella dei materiali).
   4. Nota la chiarezza della provetta e la direzione del fascio di luce. Inserire la cella in supporto del campione e chiudere la camera.
   5. Utilizzare i seguenti parametri per la misurazione: temperatura: 25 ° C, indice di rifrazione della fase dispersiva (ferro): 2.344; indice di rifrazione dell'ambiente dispersivo (acqua): 1.333
      Nota: Eseguire la misurazione dell'indice di rifrazione usando un rifrattometro per risultati più precisi, particolarmente quando lo sviluppo di materiali nuovi o ibrido.

4. Preparazione del DNA Stock, particelle magnetiche e Binding Buffer

1. stock di DNA
   1. uso tampone di 10 mM Tris-HCL (pH = 8) per la diluizione e la conservazione del DNA. Utilizzare un campione di DNA standard che può essere amplificato in modo specifico con un protocollo PCR diretto in laboratorio (fare riferimento alla sezione 5.2 per reazione impostazioni e condizioni). Per amplificare 498 coppia di basi (bp) del gene xis dal controllo del batteriofago λ, utilizzare i seguenti primer. Forward primer: 5 ' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Reverse primer: 5 ' - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 '
   2. prodotto di PCR di purificare utilizzando kit di purificazione di DNA commerciale.
      Nota: Kit commerciali utilizzando procedure basata su colonna di silice yield > purificata 100 ng / µ l DNA.
   3. Misura di concentrazione di DNA usando metodo spettrofotometrico (assorbanza a 260 nm). Diluire lo stock di DNA di 10 ¹¹ copie / µ l come indicato sopra per soluzioni di lavoro di 10 ¹⁰, 10 ⁹, 10 ⁸ e 10 ⁷ copie / µ l.
      Nota: Il numero di copie del prodotto PCR può essere calcolato secondo la seguente equazione, supponendo che il peso molecolare medio è Da 650 per ogni bp:
      DNA copie / µ l = (quantità in ng / µ l * 6.022x10 ²³ copie/mol) / (498 bp * 650 g/mol di bp * 1 x 10 ⁹ ng/g)
2. particelle magnetiche
   1. le particelle di sedimento senza il magnete e rimuovere il surnatante. Mescolare 01:20 rapporto v/v di particelle magnetiche con acqua ddd (particelle: acqua).
      Nota: Approccio basato su Volume viene utilizzato per descrivere la quantità di particelle magnetiche poiché masse uguali di allontaneranno e MMP sono state prontamente difficile confrontare.
3. Binding buffer
   1. per la rapida preparazione di soluzione di 0,75 M sodio acetato-HCL (pH = 6), mescolare 1 mL di acetato di sodio 3 M con 3 mL di HCL 1 mM.
      Nota: Tutte le soluzioni utilizzate in associazione possono essere conservate a 4 ° C. notare che bassa temperatura aumenta significativamente associazione particolarmente nel caso di soluzione in etanolo. Controllare attentamente la temperatura delle soluzioni per migliore riproducibilità e l'accuratezza dello screening.

5. Test efficienza di DNA isolamento mediante PCR quantitativa

1. isolamento del DNA di MMPs o MNPs modificato
   1. utilizzare una piastra a 96 pozzetti e un magnete personalizzato per piastra a 96 pozzetti per esperimenti di piccolo volume.
   2. Utilizzare la seguente miscela di soluzione di associazione: 8 µ l per volta MMPs o allontaneranno, 10 µ l sodio acetato-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µ l di 85% di etanolo, 10 µ l DNA (10 ¹⁰ copie soluzione).
   3. Mix bene pipettando e posizionare la piastra sul magnete per 3 min. Mentre la piastra è sul magnete, rimuovere la soluzione e aggiungere 100 µ l di etanolo di 85% per il lavaggio.
   4. Rimuovi etanolo.
      Nota: Consentire l'etanolo ad asciugare per qualche secondo ma non lasciate che le particelle asciugare troppo o mostrare crepe. Se le particelle asciugare troppo saranno difficili da sciogliere con soluzione per eluizione.
   5. Togliere la piastra dal magnete e aggiungere 40 µ l di soluzione per eluizione. Mescolare bene il pipettaggio. Posizionare la piastra posteriore sul magnete e raccogliere DNA eluito (~ 37 µ l). Memorizzare l'eluente a-20 ° C fino a ulteriore analisi.
2. PCR quantitativa
   1. utilizzare il primer che servivano a preparare brodo del DNA nel passaggio 4.1.1 per quantificare le copie del gene xis, secondo il protocollo di Haddad et al. ¹⁰
   2. preparare soluzione mix master secondo la quantità di campioni da testare, quindi distribuire la miscela in provette PCR o una piastra a 96 pozzetti fondo bianco.
   3. Utilizzare le seguenti quantità per un intero volume di miscela PCR 20 µ l: 10 della polimerasi µ l / intercalanti di miscela colorante (Vedi tabella dei materiali), 2 µ l di campione di DNA, 2 µ l forward primer per (10 µM), 2 µ l reverse primer (10 µM)
   4. Impostare il termociclatore secondo il seguente programma: 95 ° C per 120 s, 40 cicli (95 ° C per 15 s, 64 ° C per 15 s, 68 ° C per 45 s), 68 ° C per 5 min.
   5. Using triplici copie per standard e campioni, calcolare la soglia del ciclo e costruire una curva standard per stimare il numero di copie di DNA estratto in ciascun campione. Lo strumento utilizzato qui questo esegue automaticamente.
   6. Qui, il numero di copie di DNA è stimato per volume di eluizione totale (~ 40 µ l). Percentuale di DNA Estratto corrispondente importo originale aggiunto all'associazione di soluzione (totalmente 10 ¹¹ copie) può variare oltre l'intervallo da 0 a 100.

6. DNA-magnetici particelle associazione analisi utilizzando DLS

1. Associazione di DNA
   1. per grande volume esperimenti (in provetta da 1,5 mL), utilizzare la seguente miscela di soluzione di associazione: 96 µ l per volta MMPs o allontaneranno, 120 µ l sodio acetato-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 µ l di etanolo di 85%, 120 µ l DNA (10 ¹⁰ copie soluzione) o 120 µ l di tampone Tris-HCL (10 mM, pH = 8) per il controllo.
2. Analisi del potenziale zeta
   1. preparare due soluzioni vincolanti, uno con il DNA e l'altro con tampone Tris-HCL per controllo come indicato al punto 6.1.1. Per evitare la formazione di bolle, Pipettare attentamente 800 µ l della miscela associazione in un cellulare usa e getta.
      Nota: Utilizzare cuvette monouso per la misura del potenziale zeta superficie (vedere la tabella dei materiali).
3. Utilizzare i seguenti parametri per la misurazione su strumento DLS: Smoluchowski modello con un F(ka) di 1,5, temperatura: 25 ° C, indice di rifrazione della fase dispersiva (ferro): 2.344, indice di rifrazione dell'ambiente dispersivo (acqua): 1.333.
   Nota: Il tasso di interazione particella di DNA-magnetica colpisce direttamente la misurazione delle ripetizioni. Una singola misurazione dallo strumento prende 60-70 s. Qui, lo strumento è stato incaricato di prendere 10 misurazioni con 1 min intervalli di ritardo. Per semplicità, i risultati verranno mostrati a tempo = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 18 min dalla prima lettura.

Representative Results

Mediante il protocollo descritto qui per sintesi chimica e la modifica delle particelle magnetiche, sei particelle magnetiche sono state sintetizzate e analizzate per il grippaggio del DNA. Una sintesi dell'analisi è mostrata nella tabella 1. Confrontando le dimensioni delle particelle in acqua e in soluzione di rilegatura, è chiaro che tutte le particelle aggregate in associazione soluzione da pieghe 2-22. Alcune particelle aggregate ulteriormente a più pieghe in presenza di DNA; Tuttavia questo non è stata direttamente correlato con il recupero di DNA rilevato mediante PCR quantitativa (tabella 1). Confronto di potenziale zeta (10 misurazioni a intervalli di ~ 2 min) delle particelle nei controlli contro con DNA ha mostrato forte calo in tre particelle; vale a dire: MNPs_APTES, MMPs_TEOS e MMPs_APTES (Figura 2). Tendenze in zeta potenziale nel corso del tempo inoltre sono state osservate, mostrando variazioni nelle prime tre letture, prima si sono stabilizzati nella maggior parte dei casi (Figura 3). Variazione dopo l'esposizione al DNA è stata osservata principalmente in MMPs (Figura 2). Deviazione standard inferiore è stata osservata omettendo le prime tre letture che rappresenta il primo 5 min dopo l'esposizione delle particelle al DNA (tabella 1).

Nel complesso vista dell'analisi nella tabella 1 illustra le diverse caratteristiche del grippaggio del DNA-particelle come attribuita alla dimensione delle particelle magnetiche e modificazioni chimiche. Brevemente, le nanoparticelle MNPs_PEI aumentato di dimensioni dopo l'associazione del DNA da quattro pieghe con nessun cambiamento significativo nell'indice di polidispersione o potenziale zeta. Tuttavia, il DNA non era recuperabile in questa procedura. MNPs_TEOS nanoparticelle è aumentato di formato e diminuito in indice di polidispersione con impercettibile cambiamento nel potenziale zeta dopo l'esposizione del DNA, ma erano le migliori particelle nei loro tassi di recupero al 20,3%. MNPs_APTES nanoparticelle è leggermente diminuito nel formato e notevolmente nella potenziale sopra l'esposizione del DNA zeta. MMPs_PEI microparticelle non hanno mostrato cambiamento nel formato sopra l'esposizione del DNA, tuttavia hanno aumentato in indice di polidispersione e sono lievemente diminuiti nel potenziale zeta. Microparticelle di MMPs_TEOS ha mostrato le caratteristiche di dimensione alternativa per loro nanoparticella omologhi cioè MNPs_TEOS. Sorprendentemente, sono notevolmente diminuiti in potenziale zeta, ma non oltre l'intervallo visualizzato dal MNPs_TEOS. MMPs_APTES aumentato di dimensione delle particelle sopra l'esposizione del DNA ed anche diminuito in potenziale zeta. È importante notare che sia MNPs_APTES e MMPs_APTES mantenuto dimensioni simili dopo modificazione chimica nonostante il fatto che sono state fatte da diverse dimensioni dei precursori. Che inoltre hanno mostrato le simili proprietà di associazione. MNPs_TEOS ha mostrato nessun cambiamento significativo nel potenziale dai valori zeta erano all'estremo più basso rilevato in questo studio.

I valori di stabilizzante di follow-up nel tempo per potenziale zeta ha mostrato dopo 5-10 min, particolarmente nel caso di allontaneranno (Figura 3A, 3C e 3E). Una tendenza continua nel potenziale zeta è stata trovata in alcune letture di MMPs (Figura 3B, 3D e 3F). In alcuni casi, variazioni di potenziale zeta ha corrisposto alle variazioni polidispersità indice e particella dimensioni ma non con recupero del DNA di eluizione.

Figura 1: schema del protocollo. (A) modificazioni chimiche delle particelle magnetiche polyethyleneimine ramificati, silice, gruppi amminici. (B) passaggi di isolamento del DNA utilizzando buffer obbligatorio e particelle magnetiche immobilizzate sul magnete, seguita da PCR quantitativa. (C) analisi di associazione DNA-particelle utilizzando le liste di distribuzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: potenziale Zeta di particelle magnetiche rappresentante in presenza ed assenza di DNA. L'esposizione al DNA causato visibile diminuzione del potenziale zeta in MNPs_APTES, MMPs_TEOS e MMPs_APTES. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (N = 10). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: potenziale Zeta di particelle magnetiche rappresentante nel corso del tempo in presenza ed assenza di DNA. Potenziale di Zeta di particelle in soluzione di associazione è stata misurata a tempo = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 18 min. Gap tra le curve di potenziale zeta di controllo vs con DNA sono evidenti nei casi di MMPs_TEOS, MNPs_APTES e MMPs_APTES. (A) il potenziale Zeta di MNPs_PEI è altamente positivo che indica nessuna interazione. (B) potenziale Zeta di MMPs_PEI è diminuito nel corso del tempo, suggerendo un'interazione molto lenta tra particelle e DNA. (C) il potenziale Zeta di MNPs_TEOS è stata molto negativa in assenza e presenza di DNA. (D) potenziale Zeta di MMPs_TEOS Mostra i valori più bassi in presenza di DNA rispetto ai controlli. (E) potenziale Zeta di MNPs_APTES Mostra i valori più bassi in presenza di DNA rispetto ai controlli. (F) potenziale Zeta di MMPs_APTES Mostra i valori più bassi in presenza di DNA rispetto ai controlli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Caratteristiche	MNPs_PEI	MNPs_TEOS	MNPs_APTES	MMPs_PEI	MMPs_TEOS	MMPs_APTES
Dimensione delle particelle (nm)
in acqua	141.8	91,3	1106.4	825.0	1281.3	1281.3
in soluzione di rilegatura	531.2	1990.1	3091.0	2669.0	2669.0	1990.1
in impegnativi

g di soluzione con DNA 1990.1 3091.0 2669.0 2669.0 1990.1 4145.4 cambiamento osservato aumentato aumentato aumentato Indice di polidispersione in acqua 0.237 0,240 0,219 0,410 0,281 0,206 in soluzione di rilegatura 0,225 0.773 0.090 0,107 0,374 0.397 in soluzione di rilegatura con DNA 0,240 0,298 0,282 0.301 0,387 0,319 cambiamento osservato è diminuito aumentato aumentato Potenziale Zeta (mV) * in soluzione di rilegatura 42.29 -27.83 33.23 30.80 -6.86 -0.66 (± SD) 1.15 1.17 2.89 8.99 7.99 5,42 in soluzione di rilegatura con DNA 41,81 -25.97 12,28 27,81 -23.67 -15.22 (± SD) 2.02 0.80 2.21 4,33 0.95 4,28 cambiamento osservato è diminuito è diminuito è diminuito Recupero quantitativa di PCR * * Numero di copie di DNA Estratto 1, 22E + 03 1.01E + 09 3.18E + 06 1.44E + 06 3.76E + 08 6.88E + 06 (± SD) 8.05E + 02 7.55E + 07 2.83E + 06 1.98E + 06 1.08 E + 08 3,33 + 06 Percentuale di recupero di DNA 0.0 20,3 0.1 0.0 7.5 0.1 (± SD) 0.0 1.5 0.1 0.0 2.2 0.1 * Solo stabile misurazioni dopo 5 minuti di associazione vengono visualizzati (N = 7). * * R ² = 0.940 per triplici copie delle norme.

Tabella 1: caratterizzazione delle particelle magnetiche rappresentative e le loro capacità per associare e recuperare DNA. All'esposizione al soluzione di associazione, tutte le particelle hanno mostrato l'aggregazione (aumento della dimensione delle particelle). Quando il DNA era presente in soluzione di associazione, aumentare la dimensione delle particelle era visibile in MNPs_PEI, MNPs_TEOS e MMPs_APTES. Le particelle erano polidispersi sistemi in soluzione, in particolare MNPs_TEOS che divenne meno polydispersed legandosi di DNA di associazione. MNPs_APTES ha mostrato aumento di indice di polidispersione e diminuzione della potenziale esposizione al DNA zeta. MMPs_TEOS e MMPs_APTES ha mostrato grande diminuzione potenziale esposizione al DNA zeta. MNPs_TEOS e MMPs_TEOS hanno mostrato i più alti tassi di recupero DNA del 20,3% e 7,5%, rispettivamente, come mostrato dalla PCR quantitativa. MNPs_APTES e MMPs_APTES hanno mostrato tassi di recupero di 0,1% del DNA.

Discussion

In questo protocollo, i principi teorici che spiegano il legame al DNA di particelle magnetiche via potenziale zeta erano sotto la domanda. Il protocollo descrive la sintesi e la modifica di nanoparticelle magnetiche e microparticelle. Metodo per la preparazione della soluzione di controllo e l'associazione del DNA inoltre sono descritti. Due strategie sono mostrate qui per lo screening delle interazioni DNA-particella: PCR quantitativa e liste di distribuzione si avvicina. DLS fornisce tre indicatori di cambiamenti fisico-chimici nelle particelle: dimensione delle particelle, indice di polidispersione e potenziale zeta. Le modifiche di dimensione di particella indicano direttamente l'aggregazione o disgregazione. Valore di indice di polidispersione descrive la distribuzione delle specie di particella nel sistema che vanno da monodispersed (indice < 0.05) a altamente polydispersed (indice > 0,7). Potenziale Zeta può classificare particelle secondo carica superficiale dove particelle altamente positive mostrano valori superiori a 30 mV e particelle altamente negative mostrano valori inferiori a -30 mV. Come previsto, il potenziale zeta di polycharged particelle magnetiche in associazione soluzione relativamente diminuita quando le particelle sono state esposte al DNA. L'eccezione a questa regola è MNPs_TEOS. Queste particelle differiscono solo in quanto possiedono una carica superficiale altamente negativa unica (Figura 2). Ciò suggerisce che la forza ionica ha giocato un ruolo importante nel tenere insieme le particelle, DNA e ioni positivi. D'altra parte, le modifiche della dimensione delle particelle possono indicare il ruolo di aggregazione di precipitazione di particelle di DNA durante il processo di associazione, soprattutto in presenza di più lunghi filamenti di DNA.

Durante la sintesi delle particelle magnetiche e modificazioni chimiche, ci sono diversi passaggi critici che richiedono attenzione: in primo luogo, la riproducibilità del metodo di sintesi dipende in gran parte precisa quantità di precursori chimici utilizzati in sintesi così come buona agitazione e tempestiva controllata aggiunta di NH₄OH. Per acquisire una popolazione omogeneizzata di particelle (di simili dimensioni, forma, densità e composizione), è importante seguire sonicazione e passaggi mescolando accuratamente quando richiesto. In secondo luogo, in molti casi realistici le modificazioni chimiche non predicono la realtà di ciò che è sulla superficie delle particelle magnetiche. Un passaggio di caratterizzazione completa è necessario per confermare la composizione chimica della superficie della particella, come descritto nella sezione Introduzione. Tra le tecniche comunemente usate, i ricercatori si basano su FTIR, XPS, elettrochimica, spettroscopia, nonché liste di distribuzione.

Inoltre, sono necessari diversi passaggi critici durante il DLS misurazioni e analisi: in primo luogo, la scelta della soluzione di associazione influisce su vari passaggi tra cui compatibilità chimica con particelle e DNA e anche le proprietà spettrali. Scelta di indici di rifrazione del materiale della particella e soluzione di associazione può essere basata su studi precedenti o valutata mediante rifrattometria. In secondo luogo, le interazioni tra le particelle e gli elettrodi nelle provette devono essere monitorate attentamente come processo di ossidazione/riduzione può influire sulla misurazione. In terzo luogo, come illustrato nella Figura 3, il tasso di legame può essere una funzione del tempo. È fondamentale osservare la stabilità dell'interazione, e questo è un grande vantaggio per l'applicazione delle liste di distribuzione in tali studi. Qui, l'osservatore sta monitorando l'aggregazione delle particelle e cambiamenti chimico-fisici in tempo reale. In quarto luogo, polidispersione del sistema può impostare limitazioni all'ambito di analisi. Valore di indice di polidispersione sotto 0.05 descrive un sistema di monodispersed, mentre valori superiori a 0,7 descrivono un sistema di polydispersed di varie dimensioni delle particelle. La dimensione delle particelle e la distribuzione di particelle varie specie possono essere studiati utilizzando vari tipi di liste di distribuzione, tra cui back-sparsi, lato-sparsi e dispersi in avanti, come indicato nel protocollo sezione 3.1. Infine, sonicazione di particelle prima del test ovviamente può influenzare la loro proprietà fisiche (ad es. dimensioni e superficie) e se fatto troppo può causare il rilascio di alcune modificazioni chimiche.

In questo protocollo, le informazioni acquisite tramite le liste di distribuzione viene confrontate con i dati acquisiti mediante PCR quantitativa, noto anche come Real-Time PCR. Quest'ultimo è il gold standard per il rilevamento e la quantificazione di DNA. ¹⁵ tecnica PCR è ampiamente usato in laboratori, ospedali e Università. Tuttavia, quando si verifica l'esposizione del DNA al romanzo e materiali sintetizzati è importante prendere la chimica della PCR in considerazione. Enzima polimerasi, l'elemento chiave della reazione a catena della polimerasi, è sensibile a determinati inibitori chimici e rinforzatori. Aggiunta di controlli interni, test dei materiali sintetici e buoni pratica di laboratorio può aiutare a ridurre i pregiudizi nei risultati di PCR. Meccanismo di azione di inibitori e rinforzatori varia tra sostanze chimiche che si legano direttamente a polimerasi e altri che chelare ioni dalla Mg^{2 +}-dipendente polimerasi nella soluzione. Alcuni approfondimenti su isolamento del DNA sono difficili da ottenere mediante screening di PCR. DLS può mostrare casi quando il DNA si lega alle particelle, ma piuttosto viene lavato o non eluire (non rilevato mediante PCR del DNA). Ad esempio, sia MNPs_APTES e MMPs_APTES hanno mostrato significativa diminuzione potenziale sopra l'esposizione del DNA (tabella 1) zeta ma il DNA rilevato in eluizione non ha correlato con questi risultati. È possibile modificare l'associazione, la lavatrice, soluzioni di eluizione per controllare il rilascio di DNA da particelle. DLS è un metodo relativamente più veloce per la valutazione delle interazioni DNA-particella. La stabilità e la velocità di interazione possono anche essere osservati con questo metodo (Figura 3), che può influire il tempo utilizzato in particelle magnetiche - basato su protocolli di isolamento del DNA.

Le sfide per l'utilizzo di liste di distribuzione in analisi sono dritti in avanti. Questa tecnica richiede un volume relativamente grande campione per l'analisi (~ 1 mL) rispetto alla PCR. Alcuni parametri come indici di rifrazione richiedono un'attenta valutazione quando si utilizza nuove soluzioni nei campioni. Inoltre, è molto comune per osservare le reazioni di ossidazione/riduzione sugli elettrodi di cuvette durante il test di nuovo materiale. Attenta valutazione e conoscenza della composizione chimica del campione può aiutare a valutare la fattibilità di riutilizzare la cuvetta stessa. Vale la pena ricordare che analisi DLS è limitata per la specificità e la sensibilità fornito dalla PCR, eppure fornisce diverso tipo di comprensione per il processo di associazione DNA-particella.

Come tutte le tecniche spettroscopiche, modifiche e la risoluzione dei problemi delle liste di distribuzione obiettivo per lo sviluppo di misure più precise e sensibili. Questo può essere realizzato fornendo la migliore comprensione della natura del materiale testato fisicamente e chimicamente. In altre parole, dettagli della composizione chimica e proprietà ottiche sono la chiave per ottenere dati precisi e sensibili da liste di distribuzione. Proprietà ottiche possono essere acquisite da rifrattometria, mentre la composizione chimica delle particelle / superficie delle particelle possa essere studiati mediante varie tecniche quali FTIR, XPS, elettrochimica e altri metodi spettroscopici. In questo protocollo, soluzione di rilegatura può essere migliorata utilizzando vari punti di forza ioniche, altri agenti disidratanti (es. isopropanolo), vari pH e basse temperature. D'altra parte, le modifiche chimiche della superficie della particella sono lasciate all'immaginazione dei chimici.

Lo sviluppo di materiali per isolamento di DNA continuerà ad aumentare nei prossimi decenni con maggiore attenzione sulla specificità, purezza e limite di rilevazione. La qualità dei metodi di estrazione svolge ruolo importante negli studi di scala singola cella, metagenomic scale e campioni di origini insolite. Al momento, è importante eseguire analisi DLS di nanoparticelle e microparticelle modificate con vari tipi di materiali. Questo passaggio è necessario prima di stabilire un forte modello teorico che descrive il comportamento delle interazioni DNA-particella.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	207926	Magnetic particle synthesis
Iron(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	380024	Magnetic particle synthesis
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8263	Magnetic particle synthesis
Acetone	Penta	10060-11000	Magnetic particle synthesis
Sodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	W302600	Magnetic particle synthesis
Tetraethyl orthosilicate	Sigma-Aldrich	131903	Magnetic particle synthesis
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140	Magnetic particle synthesis
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000	Sigma-Aldrich	408727	Magnetic particle synthesis
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228-M	Magnetic particle synthesis
Ethanol	Penta	71250-11000	Magnetic particle synthesis
Potassium nitrate	Sigma-Aldrich	P6083	Magnetic particle synthesis
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1.05012	Magnetic particle synthesis
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)	Spectrum labs	G235063	Magnetic particle synthesis
Overhead Stirrer	witeg Labortechnik GmbH	DH.WOS01035	Magnetic particle synthesis
Waterbath	Memmert GmbH + Co.	84198998	Magnetic particle synthesis
Sonicator	Bandelin	795	Magnetic particle synthesis
BRAND UV cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759200-100EA	Cuvette for size measurement
BRAND cap for UV-cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759240-100EA	Cuvette caps for size measurement
Folded Capillary Zeta Cell	Malvern	DTS1070	Cuvette for zeta potential measurement
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	Device for measurement of size and zeta potential
Infinite 200 PRO NanoQuant instrument	Tecan	396 227 V1.0, 04-2010	device for measurement of DNA concentration
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit	Sigma-Aldrich	QR0100	PCR kit
Mastercycler pro S instrument	Eppendorf	6325 000.013	Thermocycler
MinElute kit	Qiagen	28004	DNA purification kit
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S7670	DNA binding