Summary
このプロトコルでは、磁性粒子の合成と DNA 結合の動的・電気泳動光散乱法による評価について説明します。粒子サイズ、彼らの多分散性の変化の監視に焦点を当てこのメソッドとを担う粒子表面のゼータ電位の主要な DNA など材料の結合の役割。
Abstract
磁性粒子を用いた DNA の隔離は、バイオ テクノロジーや分子生物学の研究で重要度の高いフィールドです。このプロトコルでは、動的光散乱 (DL) と電気泳動光散乱 (ELS) を介して結合 DNA 磁性粒子の評価について説明します。DLS による解析は、多分散性、粒径、ゼータ電位を含む粒子の物理化学的性質に関する貴重な情報を提供します。後者は、DNA などの材料の静電結合で主要な役割を果たしている粒子の表面電荷をについて説明します。ここでは、比較分析は、ナノ粒子・微粒子 DNA 結合と溶出への影響の 3 つの化学修飾を悪用します。化学修飾による分岐ポリエチレンイミン、エチル オルトけい酸、(3-アミノプロピル) プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシランを調査しました。以来、DNA は負の電荷を展示、DNA の結合に伴う粒子表面のゼータ電位が下がる予定です。クラスターの形成と粒子サイズする必要がありますもに影響します。単独でこれらの粒子の効率性と DNA の溶出を調査するために粒子は低 pH (~ 6)、高イオン強度および脱水環境で DNA と混合されます。磁石の粒子を洗浄し、それから DNA はトリス塩酸バッファーによって溶離される (pH = 8)。DNA コピー数は、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を使用して推定されます。ゼータ電位と粒径、多分散性および定量的 PCR のデータ評価、比較します。DLS は、洞察力と粒子の DNA の隔離のためのスクリーニングのプロセスに新たな視点を追加する解析法をサポートします。
Introduction
DNA の隔離は、分子生物学の最も重要な手順の 1 つです。核酸の抽出方法の開発ゲノミクス、メタゲノム、エピジェネティクス、トランスクリプトームの新興分野にインパクトもあり。DNA の隔離を含む医療 (法医学/診断ツールと予後バイオ マーカー) のバイオ テクノロジーのアプリケーションおよび環境アプリケーション (メタゲノム生物多様性、病原体の有病率、および監視) の広い範囲があります。浄化し、血液、尿、土、木および他の種類のサンプルなどスケールが異なる、さまざまな材料からの DNA を隔離する需要の増加がずっとあります。1,2,3,4
ナノ ・ マイクロ粒子は、ときに彼らは、磁場によって固定化することができます DNA の隔離と特にその高い表面積のために適しています。粒子サイズや電荷などの物理化学的性質が大きくターゲット生体分子を結合する機能を影響します。5生体分子の結合を強化して粒子を安定させるためには、異なる化学修飾 (表面コーティング) を利用できます。バインドするためのさまざまな方法は、共有と非共有結合性相互作用によると分類されます。6粒子のサイズは、粒子組成は金属、合金の密度、間隙率、および表面に影響を与えることができる他の材料の混入によって合わせることができるに対し、その磁化特性を直接影響します。7小さな粒子の表面電荷を測定する信頼性の高い方法はありません。代わりに、すべり面 (ナノ粒子表面から離れていくつかの距離) で電位が測定できます。8この値ゼータ電位と呼びます通常 DL 経由ナノ ・微粒子の安定性評価に使用される強力なツールです。9その値は pH およびイオン強度の分散環境の粒子の表面特性にだけではなく依存、のでそれも証明できるとの相互作用によって引き起こされるこの表面の変化、粒子および興味の分子。10
その一方で、容易の沈殿物 (集約) 比較した場合によく脱水条件 (A DNA フォーム) 展示圧縮構造の DNA 構造は B DNA フォームを発生しています。静電気 (イオンと水素結合) がその立体アクセス リン酸により他の材料と結合した DNA を制御する主要な力と窒素塩基 (特にグアニン)。7,10
この作品は、磁性ナノ粒子・微粒子の 3 つの代表的な化学修飾の解析 (図 1 a)。合成法とナノ粒子と微粒子の化学修飾、説明します。バインドのソリューションは、DNA の沈殿物 (pH、イオン強度、脱水) の理論的な原理に則したは DNA 結合・溶出評価するた量的な PCR を使用して、代表的なナノ粒子と微粒子 (図 1 b) から dna 溶出効率を評価します。粒径と分散インデックス、ゼータ電位は、粒子表面 (図 1) で発生した物理化学的変化を視覚化するために使用する重要なパラメーターです。磁性粒子表面の化学的性質を強調することが重要です。この手順は、このプロトコルの範囲を超えていた、一方、化学修正の効率を調べるいくつかの近代的な技術を適用できます。11,12,13,14フーリエ変換赤外分光法 (FTIR) は、粒子表面の赤外スペクトルを評価し、無料の化学修飾剤のスペクトルを比較する使用ことができます。X 線光電子分光法 (XPS) は、材料表面の元素組成を識別するために使用することができます別の手法です。微粒子の合成の品質に光を当てる他の電気化学顕微鏡、分光学的方法を使用できます。この作品は、DLS による DNA 磁性粒子の相互作用を分析する新たな視点を強調表示します。
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Protocol
1 磁気ナノ粒子合成
- クエン酸 (MNPs) で安定した磁性ナノ粒子の合成
- した FeCl 3 の追加 20 モル
- ∙ 6 H 2 O (5.406 g) とした FeCl の 10 m モル。2 ∙ 4 H 2 O (1.988 g) 20 mL の脱酸素化二重蒸留水 (ddd 水) で。透過的なソリューションが得られるまで機械的撹拌機を使用して N 2 雰囲気下でビーカーに積極的に解決策を得た攪拌します 。
- 急速な機械的攪拌下 1 M NH 4 ああ、一滴ずつ滴下漏斗 (取る 1 時間またはそれ以上必要な場合) を使用して 150 mL を加えます。すべて NH 4 OH が追加された後は、雄ねじの容器にソリューションを転送します。75 ° C、30 分で容器および熱ソリューションをねじ
注意: NH 4 OH は分類される腐食性と環境のために危ない
。 注: 高級 28% NH 4 脱酸素水を用いた水中の OH から NH 4 ああソリューションの準備します 。
- は、磁石と洗浄を使用して ddd 水 100 mL を使用して黒い沈殿物を収集します。3 回繰り返します。0.5 M 三ナトリウム クエン酸二水和物を沈殿させるの 50 mL を追加します。容器をネジします
。 注: 三ナトリウム クエン酸水和物の脱酸素化のソリューションを使用します 。
- は再 (35 kHz、100% の振幅) は超音波処理と 1 h. 80 ° C で熱槽で沈殿物を分散
注: 十分な力の超音波発生装置が必要です 。
- では、部屋の温度のソリューションを冷ます。磁石を用いた沈殿物を収集し、上清を除去します。超音波発生装置 (35 kHz、100% の振幅) を使用して ddd 水 50 mL の黒泥を再分散します 。
- は、50 mL の遠心管に因数 (〜 25 mL) を転送し、アセトン 20 mL を加えます。10 分間 2400 x g で遠心し、上清を削除します 。
- 再沈殿物を分散し、適切な音量の低分子量カットオフ透析装置 (500-1,000 Da) を用いた 24 時間水に対するソリューションを dialyze
注: は、メーカーによると透析デバイスを準備 ' s 要件 。
- 分岐ポリエチレンイミン (MNPs_PEI) に変更された磁性ナノ粒子の合成
- ガラス ビーカーに得られた MNPs ソリューション (~0.1 g/mL) 2 mL を加えます。38 mL の ddd 水を追加し、超音波 (35 kHz、100% の振幅) 懸濁液 (10 分) です 。
- 急速な機械的攪拌下 10 %10 mL 分岐ポリエチレンイミン (平均 25 kDa) に追加します。その後 3 h のためのソリューションをかき混ぜる
- 収集は、磁石を使用して沈殿し、上清を除去します。Ddd 水 20 mL で沈殿物を再分散します。最終的な懸濁液 (35 kHz、100% の振幅) を超音波照射を 5 回繰り返します 。
- 磁性ナノ粒子の合成修飾シリカ (MNPs_TEOS)
- ガラス ビーカーに得られた MNPs 溶液 (~0.1 g/mL) 10 mL を追加。水とエタノールの 130 mL 60 mL を追加します。超音波ソリューションおよび 28% NH 4 オハイオ州の 6 mL を追加します 。
- 急速な機械的攪拌下オルトケイ酸テトラエチルの 1 mL を追加します。その後 12 h. のためのソリューションをかき混ぜる
- 磁石を用いた黒い沈殿物を収集し、それを洗ってエタノール 50 mL (3 回) を使用して、水 50 mL (3 回)。Ddd の 10 mL に再分散粒子が水し、懸濁液 (35 kHz、100% の振幅) を超音波 。
- (MNPs_APTES) のアミノ基修飾磁性ナノ粒子の合成
- ガラス ビーカーに得られた MNPs_TEOS 溶液 (~0.1 g/mL) 5 mL を追加。45 mL の水、エタノール 50 mL を追加します。超音波ソリューション (35 kHz、100% の振幅).
- 急速な機械的攪拌下で 0.5 mL (3-アミノプロピル) プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシランを追加。その後 3 h のためのソリューションをかき混ぜる
- 磁石を用いた黒い沈殿物を収集し、それを洗ってエタノール 50 mL (3 回) を使用して、水 50 mL (3 回)。Ddd の 5 mL 中の粒子の再分散水し、懸濁液 (35 kHz、100% の振幅) を超音波照射します 。
2。磁気微粒子合成
- 2 M 自演 3、1 M 島の 12.5 mL 205.875 mL の雄ねじの容器に ddd 水の追加 25 mL を クエン酸 (Mmp) と安定化磁気微粒子の合成 します。磁気攪拌中 1 M FeSO 4 6.675 mL を追加します。予熱した水浴 (90 ° C) 2 のためにすぐに転送容器
注: が自演 3 と ddd では水酸化カリウム水溶液が水を準備します 。
- では、部屋の温度のソリューションを冷ます。磁石と洗浄を使用して ddd 水 50 mL (5 回) を使用して黒い沈殿物を収集します。0.5 M 三ナトリウム クエン酸二水和物を沈殿させるの 50 mL を追加します。容器をネジします 。
- (35 kHz、100% の振幅) は超音波処理と磁石と洗浄 (10 回) ddd 水 50 mL を使用して使用して 1 h. 収集黒い沈殿物の 80 ° C で熱槽で沈殿物を redisperse.
- 変更 Mmp 分岐ポリエチレンイミン (MMPs_PEI) とシリカ (MMPs_TEOS)、アミノ基 (MMPs_APTES) MNPs プロトコルに似ています。詳細については、それぞれのセクション 2.2、2.3、2.4 を参照してください 。
- 2 M 自演 3、1 M 島の 12.5 mL 205.875 mL の雄ねじの容器に ddd 水の追加 25 mL を クエン酸 (Mmp) と安定化磁気微粒子の合成 します。磁気攪拌中 1 M FeSO 4 6.675 mL を追加します。予熱した水浴 (90 ° C) 2 のためにすぐに転送容器
- 分岐ポリエチレンイミン (MMPs_PEI) を使用して変更磁気微粒子の合成
- ガラス ビーカーに Mmp 溶液 (~0.1 g/mL) 5 mL を追加。38 mL の ddd 水を追加し、ソリューション (35 kHz、100%、10 の最小の振幅) を超音波照射します。急速な機械攪拌下で 10% の 10 mL 分岐ポリエチレンイミン (平均 25 kDa) を追加します。その後 3 h のためのソリューションをかき混ぜる
- は、磁石を使用して沈殿物を収集し、上清を除去します。二重蒸留水 20 mL に沈殿物を redisperse します。最終的な解決 (35 kHz、100% の振幅) を超音波照射を 5 回繰り返します 。
- 磁気微粒子シリカ (MMPs_TEOS) を使用して変更の合成
- ガラス ビーカーに Mmp 溶液 (~0.1 g/mL) 5 mL を追加。水とエタノールの 130 mL 60 mL を追加します。懸濁液 (35 kHz、100% の振幅) を超音波し、28% NH 4 オハイオ州の 6 mL を追加します 。
- 急速な機械的攪拌下オルトケイ酸テトラエチルの 1 mL を追加します。その後 12 h. のためのソリューションをかき混ぜる
- 磁石を用いた黒い沈殿物を収集し、それを洗ってエタノール 50 mL (3 回) を使用して、水 50 mL (3 回)。Redisperse 5 mL の ddd 水の粒子と懸濁液 (35 kHz、100% の振幅) を超音波照射します 。
- (MMPs_APTES) のアミノ基修飾磁性微粒子の合成
- ガラス ビーカーに 3 mL の MMPs_TEOS 溶液 (~0.1 g/mL) を追加。45 mL の水、エタノール 50 mL を追加します。懸濁液 (35 kHz、100% の振幅) を超音波照射します 。
- 急速な機械的攪拌下で 0.5 mL (3-アミノプロピル) プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシランを追加。その後 3 h のためのソリューションをかき混ぜる
- 磁石を用いた黒い沈殿物を収集し、それを洗ってエタノール 50 mL (3 回) を使用して、50 mL の水 (3 時間)。Redisperse 3 mL の ddd 水の粒子と懸濁液 (35 kHz、100% の振幅) を超音波照射します 。
3。磁気粒子サイズ解析を使用して DL
後方散乱検出器角度 (173 °) と 633 のビームの波長に適用されます- 水粒子径
- 使用、DLS 楽器 nm
。 注: 後方散乱 DLS 多重散乱を避けることができる集中されたサンプルに適しています。DLS は小さい粒子に適しており粒子をそれぞれ混合側散乱 (検出器角度 90 °) と前方散乱 (検出器角度 15 °) です 。
- 前に、水の測定に超音波粒子 3 分
注: は、粒子の希釈液を使用します。この目的のための水 96 μ L で 9.6 μ 粒子をミックスします 。
- 慎重にポリスチレン ・ ラテックス粒子溶液 50 μ L をピペットします。キュベットの泡の形成を避けるためと
。 注: 各サンプルでは、使い捨てのキュベット (材料の表を参照) を使用します 。
- は、キュヴェットの明快さと光ビームの方向に注意してください。サンプル ホルダーにセルを挿入し、商工会議所を閉じます 。
- 測定の次のパラメーターを使用して、: 気温: 25 ° C; 分散相 (鉄) の屈折率: 2.344; 屈折率分散環境 (水): 1.333
注: 小説やハイブリッド材料を開発するときに特により正確な結果を得るのため、糖度計を用いた屈折測定を実行します 。
- 使用、DLS 楽器 nm
4。DNA、磁性粒子と結合バッファーを準備する
- DNA 株式
- 使用 10 mM トリス塩酸バッファー (pH = 8) の希釈と DNA の。研究室 (反応設定と条件のセクション 5.2 を参照) で直接 PCR のプロトコルと特異的増幅することができる標準的な DNA のサンプルを使用します。バクテリオファージ λ コントロールから x 遺伝子の 498 の塩基対 (bp) を増幅する、次のプライマーを使用します。プライマーを転送: 5 ' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ逆プライマー: 5 ' - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 '
- 商業 DNA 精製キットを使用して PCR の浄化製品
。 注: シリカ列ベースのプロシージャを使用して商業キット収量 > 100 ng/μ L は、DNA を精製した 。
吸光光度法を用いた DNA の - 測定濃度 (吸光度 260 nm)。10 の作業ソリューションを上記の手順で 10 11 コピー/μ L の DNA 株式を希釈 10 10 9 10 8、および 10 の 7 のコピー/μ L
。 注: PCR の製品のコピーの数は、平均分子量はそれぞれ bp の 650 Da と仮定すると、次の式に従って計算できます:
DNA コピー/μ L = (ng/μ L の量 * 6.022x10 23 コピー/mol)/(498 bp * bp の 650 g/mol* 1 x 10 9 ng/g)
- 磁性粒子
- 磁石なし堆積物粒子を許可し、上清を除去。ミックス 1:20 v/v 比磁性粒子の ddd 水 (粒子: 水).
メモ: ボリューム ベースのアプローチは MNPs および Mmp の等しい固まりが容易に比較することは困難だったので、磁性粒子の量を記述するため使用します 。
- 磁石なし堆積物粒子を許可し、上清を除去。ミックス 1:20 v/v 比磁性粒子の ddd 水 (粒子: 水).
- バッファーをバインド
- 0.75 M ナトリウム酢酸塩酸溶液の急速な準備のため (pH = 6)、ミックスの 3 M 酢酸ナトリウム 1 mL の 1 mM 塩酸 3 mL と
。 注意: バインディングで使用されるすべてのソリューションが 4 で保存することができます ° C. 注意低温が特にエタノール溶液の場合バインディングを大幅に増加します。慎重に良い再現性のためのソリューションの温度およびスクリーニングの精度を制御します 。
- 0.75 M ナトリウム酢酸塩酸溶液の急速な準備のため (pH = 6)、ミックスの 3 M 酢酸ナトリウム 1 mL の 1 mM 塩酸 3 mL と
5。効率の DNA 分離を使用して量的な PCR のテスト
- Mmp または MNPs の変更によって DNA の隔離
- 96 ウェル プレートと少量の実験のための 96 ウェル プレート用にカスタマイズされた磁石を使用します 。
- 次のバインディング解決の混合物を使用: 8 μ L 変更 Mmp または MNPs、10 μ L ナトリウム酢酸塩酸 (0.75 M、pH = 6)、60 μ L の 85% のエタノール、10 μ L の DNA (10 10 コピー ソリューション).
- ミックスはピペッティングでよくし、3 分のための磁石のプレートを配置します。プレートは、磁石では、ソリューションを削除および洗浄のための 85% のエタノールを 100 μ l 添加します 。
- エタノール削除します
。 注: 許可して数秒間乾燥するエタノールが粒子を過剰に乾燥や亀裂をさせてください。溶出溶液で溶解できない粒子を過剰に乾燥する場合 。
- は、磁石からプレートを削除し、溶出溶液 40 μ L を追加します。ピペッティングでよく混ぜます。背面磁石プレートを置き、溶離された DNA を収集 (~ 37 μ L)。さらに分析まで-20 ° C で溶離液を格納します 。
- 定量 PCR
- Haddad ら によってプロトコルに従ってステップ x 遺伝子のコピーを定量化する 4.1.1 入荷 DNA を準備するために使用されたプライマーを使用します 。10
- テストされるべきサンプルの量に応じてマスター ミックス溶液を調製し、PCR チューブや白い背景の 96 ウェル プレートに混合物を配布します 。
- 20 μ L の pcr の完全なボリュームの次の数量を使用: 10 μ L ポリメラーゼ間染料混合物をインターカ レート/(材料の表を参照)、2 μ L の DNA のサンプル、2 μ L 前方プライマー (10 μ M)、2 μ L 逆プライマー (10 μ M)
- たちによると、次のプログラムを設定: 95 ° C、120 s、40 サイクル (95 ° C、15 s、64 ° C、15 s、45 68 ° C s)、68 ° C で 5 分間 使用を標準とサンプル、トリプリケート
- サイクルしきい値を計算し、各サンプルの取得 DNA のコピーの数を推定するための標準曲線を構築します。ここで使用される楽器はこれを自動的に行います 。
- 総溶出容量 (~ 40 μ L) の DNA のコピーの数を推定するここでは。0 に 100 時間外 DNA ソリューション (完全 10 11 コピー) をバインディングに追加する元の金額に対応する取得の割合が変わることができる 。
6。DNA 磁気粒子結合解析を使用して DL
(1.5 mL チューブ) で- 大量の DNA 結合
- 実験使用次のバインディング溶液混合: 96 μ L 変更 Mmp または MNPs、120 μ L ナトリウム酢酸・塩酸(0.75 M、pH = 6)、720 85% エタノール, 120 μ L の DNA の μ L (10 10 コピー ソリューション) または 120 μ L トリス塩酸バッファー (10 mM、pH = 8) コントロール 。
- ゼータ電位解析
- 準備 2 バインド ソリューション、DNA との 1 つおよび 6.1.1 のステップの手順に従って、コントロールのトリス塩酸バッファーと別。気泡の形成を避けるためには、慎重に使い捨てのセルにバインド混合物の 800 μ L をピペットします
。 注意: 使用して使い捨てのキュベット測定の表面ゼータ電位 (材料の表を参照).
- 準備 2 バインド ソリューション、DNA との 1 つおよび 6.1.1 のステップの手順に従って、コントロールのトリス塩酸バッファーと別。気泡の形成を避けるためには、慎重に使い捨てのセルにバインド混合物の 800 μ L をピペットします
- DLS 音色の測定で次のパラメーターを使用して: 1.5、温度の F(ka) と Smoluchowski モデル: 25 ° C、分散相 (鉄) の屈折: 2.344、屈折率分散環境 (水): 1.333
。 注: DNA 磁性粒子間相互作用の直接複製の測定に影響します。計測器による単一測定は、60-70 s を取ります。ここでは、楽器は、遅延間隔 1 分と 10 の測定を取るように指示されました。わかりやすくするため、結果は、時に表示される、= 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 分最初の読書から 。
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Representative Results
化学合成と磁性粒子の改質のためにここで説明したプロトコルを使用して、六つの磁性粒子を合成し、DNA 結合の分析します。解析の概要は、表 1の通りです。バインドのソリューション、水の粒径を比較すると、2-22 折目によってソリューションをバインドですべての粒子を集約することは明らかです。いくつかの粒子はさらに DNA の存在下でより多くのひだに集約しかしこの直接相関が無かった (表 1) の量的な PCR によって検出された DNA 検索。ゼータ電位 (~ 2 分間隔で 10 測定) 3 粒子の急激な低下を示した DNA のコントロールと粒子の比較すなわち: MNPs_APTES、MMPs_TEOS、MMPs_APTES (図 2)。また、彼らはほとんどの場合 (図 3) が安定する前に最初の 3 つの測定値の変化を示す、ゼータ電位時間をかけての動向観察されました。DNA への暴露後の変化は、Mmp (図 2) で観察された主。下の標準偏差は、DNA (表 1) に粒子の露出の後の最初の 5 分を表す最初の 3 つの測定値を省略することで観察されました。
全体的な表1 分析のビューは、DNA 粒子結合磁性粒子サイズと化学修飾に起因する、さまざまな特性を示しています。簡単に言えば、MNPs_PEI ナノ粒子の分散インデックスまたはゼータ電位の重要な変更なしで 4 つの折目によって DNA を結合後サイズが増加。しかし、DNA は、この手順で取得できませんでした。MNPs_TEOS ナノ粒子のサイズが増加し、ゼータ電位の目立たない変更で 20.3% で検索速度の最高の粒子であったが、まだ DNA の暴露の後分散インデックスに減少しました。MNPs_APTES ナノ粒子は、サイズと著しくゼータ電位 DNA の露出にわずかに減少しました。MMPs_PEI 微粒子は変更を示さなかった DNA の露出にサイズ、しかし彼ら分散インデックスの増加、ゼータ電位、幾分低下しました。MMPs_TEOS 微粒子の粒子への代替のサイズ特性を示した対応すなわちMNPs_TEOS。驚いたことに、彼らは MNPs_TEOS によって表示される範囲を超えられないが、ゼータ電位を著しく減少しました。MMPs_APTES は、DNA の露出に粒子サイズが増加し、ゼータ電位も低下します。MNPs_APTES と MMPs_APTES は同じようなサイズを保持している別に作られたという事実にもかかわらず化学修飾サイズ前駆物質後であることに注意してくださいすることが重要です。彼らはまた同様のバインディング プロパティを表示されます。MNPs_TEOS は、ゼータ電位の値が大幅に変化最低の極端な検出されなかった本研究で示した。
MNPs (図 3 a、3 C 、 3 e) の場合は特に、5-10 分後フォロー アップのゼータ電位の時間の経過を示した安定値。ゼータ電位の連続的な傾向は、いくつかの Mmp の測定 (図 3 b, 3 Dと3 f) で発見されました。いくつかのケースでゼータ電位の変化は溶出による分散インデックスと粒子サイズの DNA の検索ではなく、変化に対応しました。
図 1: プロトコル スキーム。(A)分岐ポリエチレンイミン、シリカ、アミノ基を含む磁性粒子の化学修飾。(B) DNA 分離手順結合バッファーおよび量的な PCR に続いて、磁石に固定化した磁性粒子を使用しています。(C) DNA 粒子結合解析の DLS を使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: DNA の存在そして不在の代表的な磁性粒子のゼータ電位。DNA への曝露は、MNPs_APTES、MMPs_TEOS、MMPs_APTES でゼータ電位の目に見える減少を引き起こした。エラーバーは標準偏差を表す (N = 10)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: DNA の存在そして不在の時間の経過とともに代表的な磁性粒子のゼータ電位。ソリューションのバインドに粒子のゼータ電位を測定した時 = 0、2、4、6、8、10、12、14、DNA と対コントロールのゼータ電位曲線間の 16 と 18 分ギャップが MMPs_TEOS、MNPs_APTES、MMPs_APTES の場合で明白であります。(A) MNPs_PEI のゼータ電位は非常に良好な相互作用がないことを示します。(B) MMPs_PEI のゼータ電位は、粒子と DNA の非常に遅い相互作用を示唆して時間の経過とともに減少しました。(C) MNPs_TEOS のゼータ電位は、DNA の不在そして存在の非常に否定的だった。(D) MMPs_TEOS のゼータ電位制御と比較されたとき DNA の存在下で低い値を示しています。(E) MNPs_APTES のゼータ電位制御と比較されたとき DNA の存在下で低い値を示しています。(F) MMPs_APTES のゼータ電位制御と比較されたとき DNA の存在下で低い値を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 特性 | MNPs_PEI | MNPs_TEOS | MNPs_APTES | MMPs_PEI | MMPs_TEOS | MMPs_APTES |
| 粒子サイズ (nm) | ||||||
| 水で | 141.8 | 91.3 | 1106.4 | 825.0 | 1281.3 | 1281.3 |
| バインドのソリューションで | 531.2 | 1990.1 | 3091.0 | 2669.0 | 2669.0 | 1990.1 |
| bindin で |
表 1: バインド DNA を取得する代表的な磁性粒子とその能力の特性。バインドのソリューションへの暴露, 時に、すべての粒子は集計 (粒子径の増加) を示した。DNA ソリューション バインドに存在していた、粒子サイズの増加が MNPs_PEI、MNPs_TEOS、MMPs_APTES で見えなかった。粒子は、多システム ソリューション、DNA の結合に伴う以下の多分散になった MNPs_TEOS 特にバインドであった。MNPs_APTES を示した分散インデックスの増加し、減少ゼータ電位 DNA への露出に。MMPs_TEOS と MMPs_APTES を示した大規模なゼータ電位 DNA への露出に減少します。MNPs_TEOS と MMPs_TEOS は、量的な PCR に示すように、それぞれ 20.3%、7.5% の取得率が最も高い DNA を示した。MNPs_APTES と MMPs_APTES は、0.1 %dna 検索率を示した。
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Discussion
このプロトコルでは磁性粒子のゼータ電位を経由する DNA 結合を説明する理論的な原理は質問の下にあった。プロトコルでは、合成と磁性ナノ粒子・微粒子の変更について説明します。DNA コントロールとバインド溶液の調製法についても述べる。DNA 粒子間相互作用のスクリーニングのため 2 つの戦略がここで表示されます: 量的な PCR と DLS に近づきます。DLS は、粒子の物理化学的変化の 3 つの指標を提供します: 粒子サイズ、分散インデックスとゼータ電位。粒子サイズの変更は、集約や崩壊を直接示します。分散インデックス値が単分散に至るシステムの粒子種の分布を説明します (インデックス < 0.05) 高度多分散する (インデックス > 0.7)。ゼータ電位は非常に肯定的な粒子表示値を 30 mV と高い負の粒子を示す値-30 未満より大きい表面電荷によると粒子を分類できる mV。予想通り、比較的ソリューションをバインドで polycharged 磁性粒子のゼータ電位は、粒子が DNA にさらされたとき減少しました。この規則の例外は、MNPs_TEOS です。これらの粒子は、ユニークな高い負電荷 (図 2) を所有しているという点で異なるだけです。これは、イオン強度が粒子、DNA および肯定的なイオンを一緒に保持する上で重要な役割を果たしている示唆しています。一方で粒子サイズの変更は、バインディング プロセス中に長い DNA 鎖の存在で、特に DNA 粒子の沈殿物・集合の役割を指定できます。
磁性粒子と化学修飾の合成、時に注意を必要とするいくつかの重要なステップがあります: まず、合成法の再現性は、化学的前兆現象の正確な量に大きく依存しています。良い攪拌しながら、かつタイムリーな合成は、NH4オハイオの追加を制御します。(似たようなサイズ、形状、密度、組成) の粒子の均質化された人口を取得するには、超音波処理と指示があった場合に徹底的に攪拌の手順に従うことが重要です。第二に、多くの現実的な場合、化学修飾は、磁性粒子の表面上にあるものの現実を予測しません。包括的な評価手順は、概要のセクションで説明されているように粒子表面の化学組成を確認する必要です。一般的に使用される技術の中で、研究者は DL と同様、FTIR、XPS、電気化学、分光法に依存します。
DLS 測定と解析中にさらに、いくつかの重要な手順が必要: まず、ソリューションをバインドの選択に影響粒子と DNA ともスペクトル特性と化学の互換性を含む様々 なステップ。バインドのソリューションおよび粒子材料の屈折率の選択は、以前の研究に基づくまたは屈折率測定法で評価できます。第二に、キュヴェットの電極と粒子間相互作用は、慎重に酸化/還元プロセスは測定に影響を与えるように監視する必要があります。第三に、図 3のように、結合の割合は時間の関数をすることができます。相互作用、安定性を観察することが重要、そのような研究で DLS のアプリケーションの主な利点。ここでは、オブザーバーは、粒子の凝集や理化学的変更をリアルタイムで監視されています。第四に、システムの分散分析の範囲に制限を設定できます。分散インデックス値 0.05 以下では、0.7 以上の値を記述する様々 なサイズの粒子の多分散系中の単分散システムについて説明します。粒子の大きさと種は、DLS、後方散乱などの様々 なタイプを使用して学ぶことができる様々 な粒度分布の側散乱し、プロトコル セクション 3.1 で述べたように、前方散乱します。最後に、テスト前に粒子の超音波処理明らかに (例えばサイズと表面積) の物理的性質に影響を与えるし、いくつかの化学修正のリリースを引き起こす可能性が過度に行われる場合。
このプロトコルでは DL 経由で取得した情報はまたとして知られているリアルタイム PCR 定量 PCR によって取得されたデータと比較されます。後者は、検出と DNA の定量のためのゴールド スタンダードです。15 PCR 法は研究所、病院および大学で広きます。ただし、DNA 暴露小説と合成材料をテストするとき、PCR の化学を考慮することが重要です。ポリメラーゼの酵素、ポリメラーゼの連鎖反応の重要な要素は、特定の化学的阻害剤とエンハンサーに敏感です。内部統制、合成材料のテスト、良い添加実験室の練習の PCR 結果にバイアスを減らすことができます。阻害剤と促進剤の作用メカニズムは異なりますから、Mg2 +イオンをキレート直接ポリメラーゼに結合する化学物質などのソリューションに依存してポリメラーゼ。DNA の隔離に関するいくつかの洞察力は PCR のスクリーニングを使用して取得する困難です。DLS が示すことができる場合、DNA 粒子に結合しますが、洗浄ではなくまたは (DNA を PCR で検出されない) を溶出しません。たとえば、MNPs_APTES と有意 MMPs_APTES ゼータ電位 DNA 暴露 (表 1) の減少が、溶出で検出された DNA は、これらの結果とは相関しなかった。洗濯、溶出粒子から DNA のリリースを制御するソリューションのバインドを変更することが可能です。DLS は、DNA 粒子間相互作用の評価のため比較的高速な方法です。安定性との相互作用の速度もで観測できるこのメソッド (図 3)、影響を与えることができます磁性粒子の使用時間による DNA の隔離のプロトコル。
分析の DLS を使用するための課題は、まっすぐ進む。この手法は、PCR と比較されたとき分析 (〜 1 mL) のため比較的大きなサンプル ボリュームを必要とします。屈折率のようないくつかのパラメーターには、サンプルで新しいソリューションを使用する場合慎重な評価が必要があります。さらに、新規材料をテストするときにキュベット電極の酸化/還元反応を観察する非常に一般的です。慎重な評価とサンプルの化学成分の知識が同じキュベットの再利用の可能性を評価できます。DLS 分析は特異性と感度は、PCR によって提供される限られたまだ DNA 粒子結合プロセスへの洞察力の異なる種類を提供して ことを言及する価値があります。
すべての分光学的手法のような変更と DLS のトラブルシューティングより正確で高感度測定の開発を目指しています。これは、物理的、化学的試料の性質のよりよい理解を提供することによって実現できます。つまり、光学的性質と化学組成の詳細は、DLS から正確かつ機密性の高いデータを得るために重要。粒子の化学組成、屈折率測定法による光学特性を得ることができる/粒子の表面は、FTIR、XPS、電気化学、他の分光法など様々 な手法で学ぶことができます。このプロトコルのバインドのソリューションは様々 なイオン強度、他の脱水剤 (例えばイソプロパノール)、様々 な pH や低温を使用して改善できます。その一方で、粒子表面の化学修飾は、化学者の想像力に残されています。
DNA の隔離のための材料の開発は、特異性、純度および検出限界の詳細にフォーカスを次の十年で上昇していきます。抽出方法の品質は単一セル規模の研究で重要な役割を担う metagenomic スケールと異常な起源のサンプルです。現時点で DLS 分析ナノ粒子と微粒子材料の様々 な種類を使用して変更を行うことが重要です。この手順は、DNA 粒子間相互作用の動作を説明する強力な理論的なモデルを確立する前に必要です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
チェコ科学財団 (プロジェクト GA CR 17 12816S) と CEITEC 2020 (LQ1601) による金融支援は大きく認められています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
| Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
| Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
| ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
| Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
| Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
| Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
| BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
| BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
| Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
| Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
| SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
| Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |
References
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