Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

DNA-magnetiske partikel bindende analyse af dynamiske og elektroforese lysspredning

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56815
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, 2Central European Institute of Technology, Brno University of Technology

Summary

Denne protokol beskriver syntesen af magnetiske partikler og evaluering af deres DNA-bindende egenskaber via dynamiske og elektroforese lysspredning. Denne metode fokuserer på overvågning af ændringer i partikelstørrelse, deres polydispersity og zeta potentiale af partikel overflade, som spille store rolle i bindingen af materialer såsom DNA.

Abstract

Isolering af DNA ved hjælp af magnetiske partikler er et område af stor betydning i bioteknologi og molekylærbiologi forskning. Denne protokol beskriver evalueringen af DNA-magnetiske partikler bindende via dynamisk lysspredning (DLS) og elektroforese lysspredning (ELS). Analyse af DLS giver værdifulde oplysninger om de fysisk-kemiske egenskaber af partikler herunder partikelstørrelse, polydispersity og zeta potentiale. Sidstnævnte beskrives den overflade ladning af partiklen, som spiller stor rolle i elektrostatisk bindende materialer såsom DNA. Her, udnytter en sammenlignende analyse tre kemiske modifikationer af nanopartikler og mikropartikler og deres indvirkning på DNA bindende og eluering. Kemiske modifikationer af forgrenet polyethylenimine, tetraethyl MOSFET og (3-aminopropyl) triethoxysilane er undersøgt. Da DNA udviser en negativ ladning, forventes det, at zeta potentiale af partikel overflade vil falde ved binding af DNA. Dannelse af klynger bør også påvirke partikelstørrelse. For at undersøge effektiviteten af disse partikler i isolation og eluering af DNA, er partiklerne blandet med DNA i lav pH (~ 6), ionisk højstyrke og dehydrering miljø. Partiklerne er vasket på magnet og derefter DNA elueres af Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA eksemplarnummer skønnes ved hjælp af kvantitative Polymerasekædereaktionen (PCR). Zeta potentiale, partikelstørrelse, polydispersity og kvantitativ PCR data evalueres og sammenlignes. DLS er en indsigtsfuld og støtte analysemetode, der tilføjer et nyt perspektiv til processen med screening af partikler for DNA isolation.

Introduction

DNA isolation er et af de mest afgørende skridt i Molekylærbiologi. Udviklingen af nukleinsyre udvindingsmetoder har stor indflydelse på emerging inden for genomforskning, metagenomics, Epigenetik og transcriptomics. Der er en bred vifte af bioteknologiske applikationer for DNA isolation, herunder medicinsk (retsmedicinske/diagnostiske værktøjer og prognostiske markører) og miljømæssige programmer (metagenomic biodiversitet, patogen udbredelse og overvågning). Der har været stigende efterspørgsel til at rense og isolere DNA fra forskellige materialer og i forskellige skalaer som blod, urin, jord, træ og andre former for prøver. 1 , 2 , 3 , 4

Nano - og mikro-størrelse partikler er egnet til DNA isolation på grund af deres høje areal og især, når de kan være immobiliseret af et magnetfelt. Fysisk-kemiske egenskaber af partikler, såsom størrelse eller afgift, kan stærkt påvirke deres evne til at binde target biomolekyler. 5 for yderligere at forbedre bindingen af biomolekyler og til at stabilisere partikler, forskellige kemiske modifikationer (overfladebelægninger) kan udnyttes. De mange forskellige strategier for bindende klassificeres efter kovalente og non-kovalente interaktioner. 6 størrelsen af partikler direkte påvirker deres magnetisering egenskaber, mens partikel sammensætning kan skræddersys ved indarbejdelse af metallic, legeret eller andre materialer, der kan påvirke dens tæthed, porøsitet og overflade. 7 der er ingen pålidelig måde at måle overflade afgift af små partikler. I stedet, elektrisk potentiale på glide flyet (nogle afstand fra nanopartikel overflade) kan måles. 8 denne værdi kaldes zeta potentielle og det er en potent værktøj, der normalt anvendes til evaluering af nano- og microparticle stabilitet via DLS. 9 da dens værdi er stærkt afhængig af ikke kun på pH og ioniske styrke dispersive miljøet, men også på de overflade egenskaber af partikler, kan det også vise ændringer i denne overflade, forårsaget af samspillet mellem de partikler og molekyle af interesse. 10

På den anden side forekommende DNA struktur i dehydreret betingelser (A-DNA form) udstiller komprimerede konformationer, at lette dens nedbør (akkumulering) i forhold til almindeligt B-DNA form. Elektrostatisk (ionisk og H-bond) er de store kræfter kontrollerende bindingen af DNA til andre materialer på grund af deres sterically tilgængelige fosfat og kvælstof baser (især guanin). 7 , 10

I dette arbejde, tre repræsentative kemiske modifikationer af magnetiske nanopartikler og mikropartikler er analyseret (figur 1A). Metode til syntese og kemisk modifikation af nanopartikler og mikropartikler er beskrevet. En bindende løsning, at aftalerne om teoretiske principper for DNA nedbør (pH, ionisk styrke og dehydrering), der bruges til at evaluere DNA bindende og eluering. Kvantitativ PCR bruges til at evaluere overvågningsaktiviteternes effektivitet med eluering af DNA fra repræsentative nanopartikler og mikropartikler (figur 1B). Partikelstørrelse, polydispersity indeks og zeta potentiale er vigtige parametre, der bruges til at visualisere de fysisk-kemiske forandringer, der sker på partikel overflade (figur 1 c). Det er vigtigt at understrege på det kemiske karakterisering af magnetiske partikel overflade. Mens dette skridt var uden for rammerne af denne protokol, kan flere moderne teknikker anvendes for at undersøge effektiviteten af kemiske ændringer. 11 , 12 , 13 , 14 Fourier transform infrarød spektroskopi (FTIR) kan bruges til at evaluere det infrarøde spektrum af partikel overflade og sammenligne det med spektret af gratis kemiske modifikatorer. X-ray photoelectron spektroskopi (XPS) er en anden teknik, der kan bruges til at identificere den elementære sammensætning af materielle overflade. Andre elektrokemiske, mikroskopiske og spektroskopiske metoder kan bruges til at kaste lys over kvaliteten af partikel syntese. Dette arbejde understreger et nyt perspektiv til at analysere DNA-magnetiske partikler interaktioner via DLS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. magnetiske nanopartikler syntese

  1. syntese af magnetiske nanopartikler stabiliseret med citrat (MNPs)
    1. tilføje 20 mmol FeCl 3 ∙ 6 H 2 O (5.406 g) og 10 mmol af FeCl 2 ∙ 4 H 2 O (1,988 g) i 20 mL deoxygenated dobbelt destilleret vand (ddd vand). Rør fremstillet løsning kraftigt i bægerglasset under N 2 atmosfære ved hjælp af en mekanisk omrører, indtil en gennemsigtig løsning opnås.
    2. Under hurtig mekanisk omrøring, tilføje 150 mL 1 M NH 4 OH, dråbe for dråbe med tragt (tage 1 time eller mere hvis nødvendigt). Opløsningen overføres til et screwable fartøj efter alle NH 4 OH er tilføjet. Skrue opløsningen fartøj og varme ved 75 ° C i 30 min.
      Forsigtig: NH 4 OH er klassificeret som ætsende og farligt for miljøet.
      Bemærk: Forberede NH 4 OH løsning fra høj klasse 28% NH 4 OH i vand ved hjælp af deoxygenated vand.
    3. Indsamle sort bundfaldet ved hjælp af magnet og vask det ved hjælp af 100 mL ddd vand. Gentag 3 gange. Tilsættes 50 mL 0,5 M tri-natrium citrat dihydrat at udfælde. Skrue fartøjet.
      Bemærk: Brug deoxygenated løsning af tri-natrium citrat dihydrat.
    4. Re sprede bundfaldet via ultralydbehandling (35 kHz, amplitude på 100%) og varme fartøj ved 80 ° C i 1 h.
      Bemærk: En sonikator af tilstrækkelig magt er nødvendig.
    5. Lad løsning afkøle til stuetemperatur. Indsamle bundfaldet ved hjælp af en magnet og Fjern supernatanten. Re sprede sort mudder i 50 mL af ddd vand ved hjælp af sonikator (35 kHz, amplitude på 100%).
    6. Overføre delprøver (~ 25 mL) i 50 mL centrifugeglas og tilsættes 20 mL acetone. Der centrifugeres ved 2400 x g i 10 min. og fjern supernatanter.
    7. Re sprede bundfald og dialyze løsning mod vand ved hjælp af lavmolekylære cut-off dialyse enhed (500-1.000 Da) af passende volumen for 24 h.
      Bemærk: Forberede dialyse enhed ifølge producenten ' s krav.
  2. Syntese af magnetiske nanopartikler modificeret med forgrenet polyethylenimine (MNPs_PEI)
    1. tilsættes 2 mL opnåede MNPs løsning (~0.1 g/mL) i et glas bægerglas. Der tilsættes 38 mL ddd vand og Læg instrumenterne i ultralydsbad (35 kHz, amplitude på 100%) suspension (10 min).
    2. Under hurtig mekanisk omrøring, tilføje 10 mL 10% forgrenet polyethylenimine (gennemsnit 25 kDa). Rør løsning for efterfølgende 3 h.
    3. Indsamle bundfald ved hjælp af magnet og Fjern supernatanten. Re sprede bundfaldet i 20 mL ddd vand. Gentag 5 gange så den endelige suspension (35 kHz, amplitude på 100%) der sonikeres.
  3. Syntese af magnetiske nanopartikler partikler modificeret med silica (MNPs_TEOS)
    1. tilsættes 10 mL af opnåede MNPs løsning (~0.1 g/mL) i et glas bægerglas. Tilføje 60 mL vand og 130 mL ethanol. Der sonikeres løsning og tilføje 6 mL af 28% NH 4 OH.
    2. Under hurtig mekanisk omrøring, tilsættes 1 mL tetraethyl MOSFET. Rør løsning for efterfølgende 12 h.
    3. Indsamle sort bundfald med magnet og vask det ved hjælp af 50 mL ethanol (3 gange) og 50 mL vand (3 gange). Re sprede partikler i 10 mL af ddd vand og Læg instrumenterne i ultralydsbad suspension (35 kHz, amplitude på 100%).
  4. Syntese af magnetiske nanopartikler modificeret med amino grupper (MNPs_APTES)
    1. tilsættes 5 mL af opnåede MNPs_TEOS løsning (~0.1 g/mL) i et glas bægerglas. Tilføje 45 mL vand og 50 mL ethanol. Der sonikeres løsning (35 kHz, amplitude på 100%).
    2. Under hurtig mekanisk omrøring, tilsættes 0,5 mL (3-aminopropyl) triethoxysilane. Rør løsning for efterfølgende 3 h.
    3. Indsamle sort bundfald med magnet og vask det ved hjælp af 50 mL ethanol (3 gange) og 50 mL vand (3 gange). Re sprede partikler i 5 mL af ddd vand og Læg instrumenterne i ultralydsbad suspension (35 kHz, amplitude på 100%).

2. Magnetiske mikropartikler syntese

  1. syntese af magnetiske mikropartikler stabiliseret med citrat (MMPs)
    1. tilføje 25 mL 2 M KNO 3, 12,5 mL 1 M KOH og 205.875 mL ddd vand ind i et screwable fartøj. Tilføj 6.675 mL 1 M FeSO 4 under magnetiske omrøring. Straks overføre fartøjet til en forvarmet vandbad (90 ° C) for 2 h.
      Bemærk: Forberede KNO 3 og KOH løsninger i ddd vand.
    2. Lad løsning afkøle til stuetemperatur. Indsamle sort bundfald med magnet og vask det med 50 mL af ddd vand (5 gange). Tilsættes 50 mL 0,5 M tri-natrium citrat dihydrat at udfælde. Skrue fartøjet.
    3. Redisperse bundfaldet via ultralydbehandling (35 kHz, amplitude på 100%) og varme fartøj ved 80 ° C i 1 h. indsamle sort bundfald med magnet og vask det med 50 mL af ddd vand (10 gange).
    4. Ændre MMPs med forgrenet polyethylenimine (MMPs_PEI), silica (MMPs_TEOS) og amino grupper (MMPs_APTES) ligner MNPs protokollen. Henvise til afsnit 2.2, 2.3 og 2.4, henholdsvis for flere detaljer.
  2. Syntese af magnetiske mikropartikler modificeret med forgrenet polyethylenimine (MMPs_PEI)
    1. tilsættes 5 mL MMPs (~0.1 g/mL) i et glas bægerglas. Der tilsættes 38 mL ddd vand og Læg instrumenterne i ultralydsbad løsning (35 kHz, amplitude på 100%, 10 min). Under hurtig mekanisk omrøring tilføje 10 mL 10% forgrenet polyethylenimine (gennemsnit 25 kDa). Rør løsning for efterfølgende 3 h.
    2. Indsamle bundfaldet ved hjælp af en magnet og Fjern supernatanten. Redisperse bundfald i 20 mL dobbeltdestilleret vand. Gentag 5 gange så den endelige løsning (35 kHz, amplitude på 100%) der sonikeres.
  3. Syntese af magnetiske mikropartikler modificeret med silica (MMPs_TEOS)
    1. tilsættes 5 mL MMPs (~0.1 g/mL) i et glas bægerglas. Tilføje 60 mL vand og 130 mL ethanol. Der sonikeres suspension (35 kHz, amplitude på 100%) og tilføje 6 mL af 28% NH 4 OH.
    2. Under hurtig mekanisk omrøring, tilsættes 1 mL tetraethyl MOSFET. Rør løsning for efterfølgende 12 h.
    3. Indsamle sort bundfald ved hjælp af en magnet og vask det ved hjælp af 50 mL ethanol (3 gange) og 50 mL vand (3 gange). Redisperse partikler i 5 mL ddd vand og Læg instrumenterne i ultralydsbad suspension (35 kHz, amplitude på 100%).
  4. Syntese af magnetiske mikropartikler modificeret med amino grupper (MMPs_APTES)
    1. tilsættes 3 mL MMPs_TEOS (~0.1 g/mL) i et glas bægerglas. Tilføje 45 mL vand og 50 mL ethanol. Der sonikeres suspension (35 kHz, amplitude på 100%).
    2. Under hurtig mekanisk omrøring, tilsættes 0,5 mL (3-Aminopropyl) triethoxysilane. Rør løsning for efterfølgende 3 h.
    3. Indsamle sort bundfald med magnet og vaske det med 50 mL ethanol (3 gange) og 50 mL vand (3 gang). Redisperse partikler i 3 mL af ddd vand og Læg instrumenterne i ultralydsbad suspension (35 kHz, amplitude på 100%).

3. Magnetiske partikel størrelse analyse ved hjælp af DLS

  1. partikelstørrelse i vand
    1. Brug en DLS instrument, der gælder en tilbage spredning detektor vinkel (173 °) og en stråle boelgelaengden 633 nm.
      Bemærk: Ryg spredning DLS er egnet til koncentrerede prøver hvor flere spredning kan undgås. Side spredning (detektor vinkel 90°) og fremad spredning (detektor vinkel 15°) DLS er velegnet til mindre partikler og blandet partikler, hhv.
    2. Forudgående til måling i vand, der sonikeres partikler i 3 min.
      Bemærk: Brug fortyndet opløsning af partiklerne. Til dette formål, bland 9,6 µL af partikler med 96 µL vand.
    3. Omhyggeligt afpipetteres 50 µL af partikel løsning i polystyren latex kuvetter og undgå dannelsen af boblerne.
      Bemærk: Til hver prøve, bruge engangs kuvette (se tabel af materialer).
    4. Bemærk kuvette klarhed og retning af strålebundtets. Indsæt cellen i prøveholderen og lukke afdeling.
    5. Bruger følgende parametre for måling: temperatur: 25 ° C; brydningsindekset af dispersive fase (jern): 2.344; brydningsindekset af dispersive miljø (vand): 1,333
      Bemærk: Udføre måling af brydningsindekset ved hjælp af et refraktometer for mere præcise resultater, især da udvikler romanen eller hybrid materialer.

4. Forberede DNA Stock, magnetiske partikler og bindende Buffer

  1. DNA stock
    1. Brug 10 mM Tris-HCL buffer (pH = 8) til fortynding og opbevaring af DNA. Brug en standard DNA-prøve, som kan blive forstærket specifikt med en direkte PCR-protokol i laboratoriet (Se afsnit 5.2 for reaktion indstillinger og betingelser). For at forstærke 498 basepar (bp) af kse genet fra bacteriophage λ kontrol, skal du bruge de følgende primere. Videresende primer: 5 ' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Vende primer: 5 ' - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 '
    2. rense PCR produkt ved hjælp af kommerciel DNA rensning kit.
      Bemærk: Kommercielle kits ved hjælp af silica kolonne-baseret procedure give > 100 ng/µL renset DNA.
    3. Foranstaltning koncentration af DNA med Spektrofotometrisk metode (absorbans på 260 nm). Fortynd DNA status over 10 11 kopier/µL som anvist ovenfor arbejder løsninger af 10 10 10 9, 10 8 og 10 7 kopier/µL.
      Bemærk: Antallet af kopier af PCR produkt kan beregnes af følgende ligning, under forudsætning af gennemsnitlig molekylevægt er 650 Da for hver bp:
      DNA kopier/µL = (antal i ng/µL * 6.022x10 23 kopier/mol) / (498 bp * 650 g/mol af bp * 1 x 10 9 ng/g)
  2. magnetiske partikler
    1. tillader partikler at sediment uden magnet og Fjern supernatanten. Bland 1:20 v/v ratio af magnetiske partikler med ddd vand (partikler: vand).
      Bemærk: Volumen-baseret tilgang er bruges til at beskrive mængder af magnetiske partikler da lige masserne af MNPs og MMPs var let vanskelige at sammenligne.
  3. Binding buffer
    1. For hurtig forberedelse af 0,75 M natrium acetat-HCL løsning (pH = 6), 1 mL 3 M natriumacetat blandes med 3 mL af 1 mM HCL.
      Bemærk: Alle løsninger anvendes i bindende kan opbevares ved 4 ° C. Bemærk at lav temperatur øger bindende navnlig for ethanol løsning. Nøje kontrollere temperaturen af løsninger til bedre reproducerbarhed og præcision af screening.

5. Teste effektiviteten af DNA isoleret ved hjælp af kvantitativ PCR

  1. DNA isolation af modificerede MMPs eller MNPs
    1. bruge en 96-brønd plade og en magnet, tilpasset til 96-brønd plade for lille volumen eksperimenter.
    2. Bruger følgende bindende løsning blanding: 8 µL ændret MMPs eller MNPs, 10 µL natrium acetat-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µL af 85% ethanol, 10 µL DNA (10 10 kopier løsning).
    3. Mix godt af pipettering og pladen anbringes på magnet for 3 min. Mens pladen er på magneten, fjerne løsningen og tilsæt 100 µL af 85% ethanol til vask.
    4. Fjern ethanol.
      Bemærk: Tillad ethanol til tørre i få sekunder, men lad ikke partikler over tørre eller Vis revner. Hvis partiklerne over tørre vil de være vanskelige at opløse med eluering løsning.
    5. Fjerne pladen fra magneten og tilføje 40 µL af eluering løsning. Bland godt af pipettering. Pladen anbringes tilbage på magnet og indsamle elueret DNA (~ 37 µL). Gemme elueringsvæsken ved-20 ° C indtil yderligere analyser.
  2. Kvantitativ PCR
    1. bruger primere, der blev brugt til at forberede lager DNA i trin 4.1.1 at kvantificere kopier af genet kse ifølge protokollen af Holst mfl. 10
    2. forberede master mix løsning efter mængden af prøver, der skal testes og derefter distribuere blandingen ind i PCR rør eller en hvid baggrund 96-brønd plade.
    3. Bruger følgende mængder til en komplet volumen af 20 µL PCR blanding: 10 µL polymerase / intercalating farvestof blanding (se tabel over materialer), 2 µL DNA-prøve, 2 µL fremad primer (10 µM), 2 µL omvendt primer (10 µM)
    4. Konfigurere thermocycler efter følgende program: 95 ° C til 120 Sørensen, 40 cyklusser (95 ° C i 15 s, 64 ° C i 15 s, 68 ° C til 45 s), 68 ° C i 5 min.
    5. Ved hjælp af tre for standarder og prøver, beregne cyklus tærskel og konstruere en standardkurve for at estimere antallet af kopier af DNA hentet i hver prøve. Måleapparatet her udfører dette automatisk.
    6. Her, hvor mange kopier af DNA er anslået for samlede eluering volumen (~ 40 µL). Procentdel af DNA hentet svarende til oprindelige føjet til bindende løsning (helt 10 11 eksemplarer) kan variere ud over 0 til 100 interval.

6. DNA-magnetiske partikler bindende analyse ved hjælp af DLS

  1. Binding af DNA
    1. For store mængde eksperimenter (i 1,5 mL tube), bruger følgende bindende løsning blanding: 96 µL ændret MMPs eller MNPs, 120 µL natrium acetat-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 µL af 85% ethanol, 120 µL DNA (10 10 kopier løsning) eller 120 µL Tris-HCL buffer (10 mM, pH = 8) kontrol.
  2. Zeta potentielle analyse
    1. Forbered to bindende løsninger, en med DNA og en anden med Tris-HCL buffer for kontrol som anvist i trin 6.1.1. For at undgå dannelsen af boblerne, omhyggeligt afpipetteres 800 µL af bindende blandingen i en engangs celle.
      Bemærk: Brug engangs kuvette for måling af overflade zeta potentiale (jf. tabel af materialer).
  3. Bruge følgende parametre til måling på DLS instrument: Smoluchowski model med en F(ka) på 1,5, temperatur: 25 ° C, brydningsindeks dispersive fase (jern): 2.344, brydningsindeks dispersive miljø (vand): 1,333.
    Bemærk: Antallet af DNA-magnetiske partikel interaktion direkte påvirker måling af replikater. En enkelt måling af instrumentet tager 60-70 s. Her, blev instrumentet pålagt at tage 10 målinger med 1 min. forsinkelse intervaller. For enkelhed, resultaterne vil blive vist på tid = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 og 18 min. fra førstebehandlingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af protokollen beskrevet her til kemisk syntese og ændring af magnetiske partikler, blev seks magnetiske partikler syntetiseret og analyseret for DNA bindende. Et resumé af analysen er vist i tabel 1. Ved at sammenligne partikelstørrelse i vand og i bindende løsning, er det klart, at alle partikler samlet i bindende løsning af 2-22 folder. Nogle partikler yderligere aggregeres til flere folder i overværelse af DNA; Dette var dog ikke direkte korreleret med DNA hentning opdaget af kvantitativ PCR (tabel 1). Sammenligning af zeta potentiale (10 målinger i ~ 2 min mellemrum) af partikler i kontrol versus med DNA viste skarpe fald i tre partikler; nemlig: MNPs_APTES, MMPs_TEOS og MMPs_APTES (figur 2). Tendenser i zeta potentiale over tid blev også observeret, viser variationer i de første tre behandlinger, før de er stabiliseret i de fleste tilfælde (figur 3). Variation efter udsættelse for DNA blev hovedsagelig observeret i MMPs (figur 2). Lavere standardafvigelse blev observeret ved at udelade de første tre behandlinger der repræsenterer første 5 min efter eksponering af partikler til DNA (tabel 1).

Samlet viser visning af analysen i tabel 1 de forskellige karakteristika af DNA-partikel bindende som tilskrives magnetiske partikelstørrelse og kemiske ændringer. Kort, MNPs_PEI nanopartikler steg i størrelse efter bindende DNA af fire folder uden betydelige ændringer i polydispersity indeks eller zeta potentiale. DNA var imidlertid ikke hentes i denne procedure. MNPs_TEOS nanopartikler steg i størrelse og faldt i polydispersity indeks med unnoticeable ændringen på zeta potentielle efter DNA eksponering, men de var de bedste partikler i deres hentning satser på 20,3%. MNPs_APTES nanopartikler faldt svagt i størrelse og mærkbart i zeta potentiale ved DNA eksponering. MMPs_PEI mikropartikler ikke viser ændringen i størrelse ved DNA eksponering, men de steg i polydispersity indeks og faldt svagt i zeta potentiale. MMPs_TEOS mikropartikler viste alternative størrelse egenskaber til deres nanopartikel modparter dvs MNPs_TEOS. Overraskende, faldt de mærkbart i zeta potentiale, men ikke ud over den række vises af MNPs_TEOS. MMPs_APTES steg i partikelstørrelse på DNA eksponering og også faldt i zeta potentiale. Det er vigtigt at bemærke, at både MNPs_APTES og MMPs_APTES beholdt lignende størrelser efter kemiske modifikation trods det faktum, at de var lavet af forskellige størrelse prækursorer. De har også udvist lignende bindende egenskaber. MNPs_TEOS viste ingen væsentlig ændring i zeta potentiale af deres værdier blev i den laveste ekstreme fundet i denne undersøgelse.

Følg op med tiden for zeta potentiale viste stabiliserende værdier efter 5-10 min, navnlig hvad angår MNPs (figur 3A, 3 C og 3E). En vedvarende tendens i zeta potentiale blev fundet i nogle MMPs målinger (figur 3B, 3D og 3F). I nogle tilfælde svarede variationer i zeta potentiale til variationer i polydispersity indeks og partikel størrelse, men ikke med DNA hentning ved eluering.

Figure 1
Figur 1: protokolskemaet. (A) kemiske modifikationer af magnetiske partikler herunder forgrenet polyethyleneimine, silica og amino grupper. (B) DNA isoleret trin ved hjælp af bindende buffer og magnetiske partikler immobiliseret på magnet, efterfulgt af kvantitativ PCR. (C) DNA-partikel bindende analyse ved hjælp af DLS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Zeta potentiale af repræsentative magnetiske partikler i tilstedeværelse og fravær af DNA. Eksponering for DNA forårsaget synligt fald i zeta potentiale i MNPs_APTES, MMPs_TEOS og MMPs_APTES. Fejllinjer udgør standardafvigelse (N = 10). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Zeta potentiale af repræsentative magnetiske partikler over tid i tilstedeværelse og fravær af DNA. Zeta potentiale af partikler i bindende løsning blev målt til tid = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 og 18 min. kløften mellem zeta potentielle kurver kontrol vs. med DNA er selvfølgelig i tilfælde af MMPs_TEOS, MNPs_APTES og MMPs_APTES. (A) Zeta potentiale af MNPs_PEI er yderst positive, der angiver ingen interaktioner. (B) Zeta potentiale af MMPs_PEI faldt over tid tyder på en meget langsom vekselvirkning mellem partikler og DNA. (C) Zeta potentiale af MNPs_TEOS var meget negativ i fravær og tilstedeværelsen af DNA. (D) Zeta potentiale af MMPs_TEOS viser lavere værdier i tilstedeværelsen af DNA i forhold til kontrol. (E) Zeta potentiale af MNPs_APTES viser lavere værdier i tilstedeværelsen af DNA i forhold til kontrol. (F) Zeta potentiale af MMPs_APTES viser lavere værdier i tilstedeværelsen af DNA i forhold til kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Karakteristika MNPs_PEI MNPs_TEOS MNPs_APTES MMPs_PEI MMPs_TEOS MMPs_APTES
Partikelstørrelse (nm)
i vand 141.8 91.3 1106.4 825.0 1281.3 1281.3
i bindende løsning 531.2 1990.1 3091.0 2669.0 2669.0 1990.1
i binde
g løsningen med DNA 1990.1 3091.0 2669.0 2669.0 1990.1 4145.4 observerede ændringer øget øget øget Polydispersity indeks i vand 0.237 0.240 0.219 0,410 0,281 0.206 i bindende løsning 0,225 0.773 0.090 0.107 0.374 0.397 i bindende løsning med DNA 0.240 0.298 0,282 0.301 0.387 0.319 observerede ændringer faldt øget øget Zeta potentiale (mV) * i bindende løsning 42.29 -27.83 33.23 30.80 -6.86 -0.66 (±SD) 1.15 1.17 2.89 8.99 7,99 5.42 i bindende løsning med DNA 41.81 -25.97 12.28 27.81 -23.67 -15.22 (±SD) 2.02 0,80 2.21 4.33 0,95 4.28 observerede ændringer faldt faldt faldt Kvantitativ PCR hentning ** DNA eksemplarnummer hentet 1.22E + 03 1.01E + 09 3.18E + 06 1.44E + 06 3.76E + 08 6.88E + 06 (±SD) 8.05E + 02 7.55E + 07 2.83E + 06 1.98E + 06 1.08E + 08 3.33E + 06 DNA hentning procentdel 0,0 20.3 0,1 0,0 7.5 0,1 (±SD) 0,0 1.5 0,1 0,0 2.2 0,1 * Kun stabile målinger efter 5 minutter af bindende vises (N = 7). ** R² = 0.940 for tre af standarder.

Tabel 1: karakterisering af repræsentative magnetiske partikler og deres evner til at binde og hente DNA. Ved udsættelse for bindende løsning viste alle partikler sammenlægning (stigning i partikelstørrelse). Når DNA var til stede i bindende løsning, var partikel størrelse stigning synlig i MNPs_PEI, MNPs_TEOS og MMPs_APTES. Partikler blev polydisperse systemer i bindende løsning, især MNPs_TEOS, som blev mindre polydispersed ved binding af DNA. MNPs_APTES viste stigning i polydispersity indeks og fald i zeta potentiale ved udsættelse for DNA. MMPs_TEOS og MMPs_APTES viste store fald i zeta potentiale ved udsættelse for DNA. MNPs_TEOS og MMPs_TEOS viste de højeste DNA hentning satser på 20,3% og 7,5%, henholdsvis, som det fremgår af kvantitativ PCR. MNPs_APTES og MMPs_APTES viste 0,1% DNA hentning satser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol var de teoretiske principper, der forklarer DNA binding til magnetiske partikler via zeta potentiale under spørgsmål. Protokollen beskriver syntese og ændring af magnetiske nanopartikler og mikropartikler. Metode til forberedelse af DNA kontrol og bindende løsning er også beskrevet. To strategier er vist her til screening af DNA-partikel interaktioner: kvantitativ PCR og DLS tilgange. DLS giver tre indikatorer for fysisk-kemiske ændringer i partikler: partikelstørrelse, polydispersity indeks og zeta potentiale. Partikel størrelse ændringer angive direkte sammenlægning eller opløsning. Polydispersity index værdi beskriver fordelingen af partikel arter i systemet lige fra monodispersed (indeks < 0,05) til meget polydispersed (indeks > 0,7). Zeta potentiale kan klassificere partikler ifølge overflade afgift hvor meget positive partiklerne viser værdier større end 30 mV og stærkt negative partikler viser værdier lavere end -30 mV. Som forudsagt faldt polycharged magnetiske partikler i bindende løsning forholdsvis zeta potentiale når partiklerne blev udsat for DNA. En undtagelse til denne regel er MNPs_TEOS. Disse partikler kun adskiller sig ved at de besidder en unik stærkt negative overflade afgift (figur 2). Dette tyder på, at ionisk styrke spillede en vigtig rolle i at holde partikler, DNA og positive ioner sammen. På den anden side, kan ændringer i partikelstørrelse indikere rollen som nedbør/sammenlægning af DNA-partikler under den bindende proces, navnlig i forekomsten af længere DNA-strenge.

Under syntesen af magnetiske partikler og kemiske ændringer, der er flere vigtige skridt, som kræver opmærksomhed: for det første, reproducerbarhed af metoden for syntese afhænger i høj grad på præcise mængder af kemiske prækursorer anvendes i syntese og god omrøring og rettidig kontrolleret tilsætning af NH4OH. For at erhverve en homogeniseret befolkning af partikler (af lignende størrelse, form, tæthed og sammensætning), er det vigtigt at følge ultralydbehandling og omrøring trin grundigt når du får besked. For det andet, i mange tilfælde, realistisk de kemiske modifikationer ikke forudsige virkeligheden af, hvad der er på overfladen af magnetiske partikler. Et omfattende karakterisering skridt er forpligtet til at bekræfte den kemiske sammensætning af partikel overflade, som beskrevet i afsnittet Introduktion. Blandt de almindeligt anvendte teknikker afhængige forskere FTIR, XPS, elektrokemi, spektroskopi samt DLS.

Derudover flere kritiske trin er påkrævet under DLS målinger og analyse: for det første valg af bindende løsning påvirker forskellige trin herunder kemiske forenelighed med partikler og DNA og også spektrale egenskaber. Valg af refraktive indeks af bindende løsning og partikel materiale kan være baseret på tidligere undersøgelser eller evalueret af refraktometriske metode. For det andet, interaktioner mellem partiklerne og elektroder i kuvetter bør overvåges nøje som oxidation/reduktion proces kan påvirke målingen. For det tredje, som vist i figur 3, sats af bindende kan være en funktion af tiden. Det er afgørende at observere stabilitet af interaktion, og dette er en stor fordel for anvendelsen af DLS i sådanne undersøgelser. Her, overvåger observatøren partikel sammenlægning og lægemiddels ændringer i realtid. For det fjerde, polydispersity af systemet kan definere begrænsninger for analyse. Polydispersity index værdi under 0,05 beskriver et monodispersed system, mens værdier over 0,7 beskrive et polydispersed system af forskellige størrelser af partikler. Størrelsen af partikler og distribution af forskellige partikel arter kan studeres ved hjælp af forskellige typer af DLS, herunder back-spredt, side-spredt og spredt frem, som nævnt i protokollens afsnit 3.1. Endelig sonikering partikler inden prøvningen kan naturligvis påvirke deres fysiske egenskaber (f.eks. størrelse og areal) og hvis gjort alt det kan forårsage frigivelse af nogle kemiske ændringer.

I denne protokol, er oplysninger opnået via DLS i forhold til data erhvervet af kvantitativ PCR, også kendt som real-time PCR. Sidstnævnte er guld standard for påvisning og kvantificering af DNA. 15 PCR teknik er meget udbredt i laboratorier, hospitaler og universiteter. Når test DNA eksponering for roman og syntetiserede materialer er det imidlertid vigtigt at tage kemi af PCR i betragtning. Polymerase enzym, det centrale element i polymerase kæde reaktion, er følsomme over for visse kemiske hæmmere og smagsforstærkere. Tilsætning af intern kontrol, test af syntetiske materialer, og god laboratoriepraksis kan medvirke til at reducere skævheder i PCR resultater. Virkningsmekanismer for hæmmere og smagsforstærkere varierer mellem kemikalier, direkte binde til polymerase og andre, der Chelat ioner fra Mg2 +-afhængige polymerase i løsning. Nogle indsigter på DNA isolation er vanskeligt at få ved hjælp af PCR screening. DLS kan vise tilfælde når DNA bindes til partikler, men er snarere vaskes eller ikke elueres (DNA ikke påvist ved PCR). For eksempel, både MNPs_APTES og MMPs_APTES viste betydelige fald i zeta potentiale ved DNA eksponering (tabel 1) men DNA fundet i eluering korrelerer ikke med disse resultater. Det er muligt at ændre bindingen, vask, eluering løsninger til at kontrollere frigivelsen af DNA fra partikler. DLS er en relativt hurtigere metode til evaluering af DNA-partikel interaktioner. Stabilitet og hastighed af interaktion kan også observeres ved denne metode (figur 3), som kan påvirke tidsforbrug i magnetiske partikler - baseret DNA isoleret protokoller.

Udfordringer for at bruge DLS i analyse er ligetil. Denne teknik kræver en forholdsvis stor stikprøve volumen til analyse (~ 1 mL) i forhold til PCR. Nogle parametre som refraktivt indeks kræver omhyggelig vurdering ved brug af nye løsninger i prøverne. Derudover er det meget almindeligt at observere oxidation/reduktion-reaktioner på elektroderne af kuvetter ved test af nye materiale. Omhyggelig vurdering og viden om den kemiske sammensætning af prøven kan hjælpe med at vurdere muligheden for at genbruge den samme kuvette. Det er værd at nævne, at DLS analyse er begrænset til specificiteten og følsomheden af PCR, men det giver forskellige slags indsigt til DNA-partikel bindende proces.

Ligesom alle spektroskopiske teknikker, ændringer og fejlfinding af DLS mål for udvikling af mere nøjagtige og følsomme målinger. Dette kan opnås ved at give bedre forståelse af karakteren af det materiale, der er testet fysisk og kemisk. Med andre ord, er optiske egenskaber og detaljer af kemiske sammensætning nøglen til at opnå nøjagtige og følsomme data fra DLS. Optiske egenskaber kan erhverves af refraktometriske metode, mens kemisk sammensætning af partikler / partikler overflade kan studeres ved hjælp af forskellige teknikker såsom FTIR, XPS, elektrokemi og andre spektroskopiske metoder. I denne protokol, kan bindende løsning forbedres ved hjælp af forskellige ionisk styrker, andre tørring agenter (fx isopropanol), forskellige pH og lave temperaturer. På den anden side er de kemiske modifikationer af partikel overflade overladt til kemikere fantasi.

Udviklingen af materialer til isolering af DNA vil fortsætte med at stige i de næste årtier med mere fokus på specificitet, renhed og detektionsgrænse. Kvaliteten af udvindingsmetoder spiller vigtig rolle i undersøgelser af enkelt celle skala, metagenomic skalaer og prøver af usædvanlige oprindelse. På nuværende tidspunkt er det vigtigt at udføre DLS analyse af nanopartikler og mikropartikler modificeret med forskellige former for materialer. Dette trin er nødvendige inden der etableres en stærk teoretisk model, der beskriver opførslen af DNA-partikel interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Den finansielle støtte af Czech Science Foundation (projekt GA CR 17-12816S) og CEITEC 2020 (LQ1601) er meget anerkendt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iron(III) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 207926 Magnetic particle synthesis
Iron(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich 380024 Magnetic particle synthesis
Iron(II) sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich F8263 Magnetic particle synthesis
Acetone Penta 10060-11000 Magnetic particle synthesis
Sodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich W302600 Magnetic particle synthesis
Tetraethyl orthosilicate Sigma-Aldrich 131903 Magnetic particle synthesis
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140 Magnetic particle synthesis
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 Sigma-Aldrich 408727 Magnetic particle synthesis
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 221228-M  Magnetic particle synthesis
Ethanol Penta 71250-11000 Magnetic particle synthesis
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P6083 Magnetic particle synthesis
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 1.05012 Magnetic particle synthesis
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) Spectrum labs G235063 Magnetic particle synthesis
Overhead Stirrer witeg Labortechnik GmbH DH.WOS01035 Magnetic particle synthesis
Waterbath Memmert GmbH + Co. 84198998 Magnetic particle synthesis
Sonicator Bandelin 795 Magnetic particle synthesis
BRAND UV cuvette micro Sigma-Aldrich BR759200-100EA Cuvette for size measurement
BRAND cap for UV-cuvette micro Sigma-Aldrich BR759240-100EA Cuvette caps for size measurement
Folded Capillary Zeta Cell Malvern DTS1070 Cuvette for zeta potential measurement
Zetasizer Nano ZS Malvern ZEN3600 Device for measurement of size and zeta potential
Infinite 200 PRO
NanoQuant instrument		 Tecan 396 227 V1.0, 04-2010 device for measurement of DNA concentration
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit Sigma-Aldrich QR0100 PCR kit
Mastercycler pro S instrument Eppendorf 6325 000.013 Thermocycler
MinElute kit Qiagen 28004 DNA purification kit
Sodium acetate Sigma-Aldrich S7670 DNA binding

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
  2. Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
  3. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
  4. Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
  5. Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
  6. Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
  7. Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).
  8. Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
  9. Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
  10. Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
  11. Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
  12. Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
  13. Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
  14. Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
  15. Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).

Tags

Kemi sag 129 DNA isolation magnetiske partikel kemisk modifikation dynamiske lys spredning kvantitativ PCR
DNA-magnetiske partikel bindende analyse af dynamiske og elektroforese lysspredning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haddad, Y., Dostalova, S., Kudr, J., … More

Haddad, Y., Dostalova, S., Kudr, J., Zitka, O., Heger, Z., Adam, V. DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering. J. Vis. Exp. (129), e56815, doi:10.3791/56815 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter