Este protocolo descreve a síntese de partículas magnéticas e avaliação de suas propriedades de ligação a DNA através de espalhamento de luz dinâmica e eletroforético. Este método concentra-se em acompanhamento de alterações no tamanho da partícula, sua polidispersividade e potencial zeta de superfície de partícula que desempenham grande papel na ligação de materiais tais como o DNA.
Isolamento de DNA utilizando partículas magnéticas é um campo de grande importância na pesquisa de biotecnologia e biologia molecular. Este protocolo descreve a avaliação de partículas magnéticas-DNA ligação via difusão dinâmica da luz (DLS) e espalhamento de luz eletroforético (ELS). Análise por DLS fornece informações valiosas sobre as propriedades físico-químicas das partículas, incluindo o tamanho de partícula, polidispersividade e potencial zeta. O último descreve a carga superficial da partícula que desempenha papel importante na ligação eletrostática de materiais tais como o DNA. Aqui, uma análise comparativa explora três modificações químicas de nanopartículas e micropartículas e seus efeitos sobre a ligação do DNA e eluição. Modificações químicas por ramificada o polyethylenimine, tetraetila orthosilicate e (3-aminopropil) triethoxysilane são investigados. Desde que o DNA apresenta uma carga negativa, espera-se que potencial zeta de superfície de partícula irá diminuir a ligação do DNA. Formação de clusters deve também afetam o tamanho de partícula. Para investigar a eficiência dessas partículas isoladamente e eluição do DNA, as partículas são misturadas com DNA em pH baixo (~ 6), alta força iônica e ambiente de desidratação. As partículas são lavadas no ímã e então DNA é eluída por tampão Tris-HCl (pH = 8). Número de cópia do DNA é estimado usando quantitativa cadeia da polimerase (PCR). Potencial zeta, tamanho de partícula, polidispersividade e dados quantitativos de PCR são avaliados e comparados. DLS é uma perspicaz e método de análise que adiciona uma nova perspectiva para o processo de triagem de partículas para isolamento de DNA de apoio.
Isolamento do DNA é um dos passos mais importantes em biologia molecular. O desenvolvimento de métodos de extração de ácido nucleico tem grande impacto sobre os campos emergentes da genómica, metagenômica, epigenética e transcriptomics. Há uma ampla gama de aplicações biotecnológicas para isolamento de DNA, incluindo médicos (ferramentas forenses/diagnóstico e prognósticos biomarcadores) e aplicações ambientais (biodiversidade metagenomic, prevalência do patógeno e vigilância). Tem havido crescente demanda para purificar e isolar o DNA de diferentes materiais e em diferentes escalas tais como sangue, urina, solo, madeira e outros tipos de amostras. 1 , 2 , 3 , 4
E micropartículas nanométricas são apropriadas para isolamento de DNA devido à sua elevada área superficial e, em especial quando eles podem ser imobilizados por um campo magnético. Propriedades físico-químicas de partículas, tais como tamanho ou carga, grandemente podem influenciar a sua capacidade de biomoléculas alvo. 5 para aumentar ainda mais a vinculação de biomoléculas e estabilizar as partículas, as modificações químicas diferentes (revestimentos de superfície) podem ser utilizadas. As muitas estratégias diferentes para ligação são classificadas de acordo com interações não covalentes e covalentes. 6 o tamanho das partículas afeta diretamente suas propriedades de magnetização, Considerando que a composição da partícula pode ser costurada por incorporação de metálico, ligas ou outros materiais que podem influenciar a sua densidade, porosidade e superfície. 7 não há nenhuma maneira confiável para medir a carga superficial das partículas pequenas. Em vez disso, o potencial elétrico no plano de escorregamento (alguma distância longe da superfície de nanopartículas) pode ser medido. 8 este valor é chamado de zeta potencial e é uma ferramenta potente que geralmente é utilizada para avaliação da estabilidade de nano – e micropartículas através de DLS. 9 desde que seu valor é altamente dependente não só o pH e força iônica do meio ambiente dispersivo, mas também sobre as características de superfície das partículas, pode também provar as alterações nesta superfície causado pela interação entre o partículas e moléculas de interesse. 10
Por outro lado, a estrutura do DNA em condições desidratado (forma A-DNA) exposições compactado conformações que facilitam sua precipitação (agregação) quando comparado ao comumente ocorrendo formulário B-DNA. Eletrostática (iônica e ligação-H) são as principais forças controlando a ligação do DNA a outros materiais devido à sua estericamente acessível fosfato e bases nitrogenadas (particularmente a guanina). 7 , 10
Neste trabalho, analisam-se três modificações químicas representativas de nanopartículas magnéticas e micropartículas (figura 1A). São descritos o método de síntese e modificação química de nanopartículas e micropartículas. Uma solução de ligação, que acordos de princípios teóricos da precipitação do DNA (pH, força iônica e desidratação), é usada para avaliar a eluição e vinculação de DNA. PCR quantitativo é usado para avaliar a eficiência de eluição do DNA do representante nanopartículas e micropartículas (figura 1B). Granulometria, índice de polidispersividade e potencial zeta são importantes parâmetros que são usados para visualizar as alterações físico-químicas que ocorrem na superfície da partícula (Figura 1). É importante ressaltar sobre a caracterização química de superfície de partícula magnética. Enquanto esta etapa foi para além do âmbito do presente protocolo, várias técnicas modernas podem ser aplicadas para investigar a eficiência de modificações químicas. 11 , 12 , 13 , 14 a espectroscopia no infravermelho (FTIR) transformada de Fourier pode ser usada para avaliar o espectro infravermelho de superfície de partícula e compará-lo com o espectro de modificadores químicos livre. Espectroscopia de fotoelétron de raios x (XPS) é outra técnica que pode ser usada para identificar a composição elementar da superfície do material. Outros métodos eletroquímicos, microscópicos e espectroscópicos podem ser usados para lançar a luz sobre a qualidade da síntese de partículas. Este trabalho destaca uma nova perspectiva de análise de DNA-magnético interações de partículas via DLS.
Neste protocolo, os princípios teóricos que explicam o emperramento do ADN para partículas magnéticas através de potencial zeta foram em questão. O protocolo descreve a síntese e modificação de nanopartículas magnéticas e micropartículas. Método para a preparação da solução de controle e vinculação de DNA também são descritos. Duas estratégias são mostradas aqui para triagem de interações DNA-partícula: PCR quantitativo e DLS se aproxima. DLS fornece três indicadores de alterações físico-qu?…
The authors have nothing to disclose.
O apoio financeiro pela Fundação de ciência Checa (projeto GA CR 17-12816S) e o CEITEC 2020 (LQ1601) é muito reconhecido.
Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |