Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

DNA-magnetiske partikler bindende analyse av dynamisk og Electrophoretic lysspredning

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56815
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, 2Central European Institute of Technology, Brno University of Technology

Summary

Denne protokollen beskriver syntesen av magnetiske partikler og evaluering av deres DNA-bindingsegenskapene via dynamisk og electrophoretic lysspredning. Denne metoden fokuserer på å overvåke endringer i partikkelstørrelse, deres polydispersity og zeta potensialet av partikkel overflate som spiller stor rolle i binding av materialer som DNA.

Abstract

Isolering av DNA ved å bruke magnetiske partikler er et felt av høy betydning i bioteknologi og molekylærbiologi. Denne protokollen beskriver evalueringen av DNA-magnetiske partikler bindende via dynamisk lysspredning (DLS) og electrophoretic lysspredning (ELS). Analyse av DLS gir verdifull informasjon i partikler inkludert partikkelstørrelse, polydispersity og zeta potensielle mekanisk-egenskaper. Sistnevnte beskriver overflaten tillegget av partikkel som spiller stor rolle i elektrostatisk binding av materialer som DNA. Her, utnytter en komparativ analyse tre kjemiske modifikasjoner av nanopartikler og microparticles og deres effekter på DNA bindende og elueringsrør. Kjemiske modifikasjoner av forgrenede polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate og (3-aminopropyl) triethoxysilane er undersøkt. Siden DNA utstillinger en negativ ladning, forventes det at zeta potensialet i partikkel overflaten vil avta ved binding av DNA. Forming av klynger bør også påvirke partikkelstørrelse. For å undersøke effektiviteten av disse partiklene i isolasjon og elueringsrør DNA, er partiklene blandet med DNA i lav pH (~ 6), høy ioniske styrke og dehydrering miljø. Partiklene er vasket på magnet og deretter DNA er elut av Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA kopi nummer er beregnet ved hjelp av kvantitative polymerasekjedereaksjons (PCR). Zeta potensial, partikkelstørrelse, polydispersity og kvantitative PCR data evalueres og forhold. Distribusjonslister er en innsiktsfull og støtte metoden analyse som gir et nytt perspektiv til prosessen med screening av partikler DNA isolering.

Introduction

DNA isolasjon er en av de viktigste trinnene i molekylærbiologi. Utviklingen av nukleinsyre utvinning metoder har stor innvirkning på nye felt av genomics, metagenomics, epigenetics og transcriptomics. Det er en rekke bioteknologisk programmer DNA isolering inkludert medisinsk (rettsmedisinske/diagnoseverktøy og prognostiske biomarkers) og miljømessige programmer (metagenomic biologisk mangfold, patogen utbredelse og overvåking). Det har vært økende etterspørselen å rense og isolere DNA av forskjellige materialer og i ulike skalaer som blod, urin, jord, tre og andre typer prøver. 1 , 2 , 3 , 4

Nano - og mikrostørrelse partikler er egnet for DNA isolasjon på grunn av deres høye areal og spesielt når de kan bli immobilisert av et magnetfelt. Mekanisk-egenskaper av partikler, for eksempel størrelse eller kostnad, kan sterkt påvirke deres evne til å binde målet biomolecules. 5 forbedre binding av biomolecules og stabilisere partikler, ulike kjemiske modifikasjoner (overflatebelegg) utnyttes. De mange forskjellige strategiene for bindingen klassifiseres etter kovalente og ikke-kovalente interaksjoner. 6 størrelsen på partikler direkte påvirker magnetization egenskaper, mens partikkel komposisjon kan skreddersys etter innlemmelse av metallisk, legering eller annet materiale som kan påvirke sin tetthet, porøsitet og overflaten. 7 det er ingen pålitelig måte å måle overflate ansvaret for små partikler. I stedet kan elektrisk potensial på forsinkede flyet (stykke fra hydrogenion overflaten) måles. 8 denne verdien kalles zeta potensielle og det er et potent verktøy som vanligvis brukes for evalueringen nano- og microparticle stabilitet via DLS. 9 siden verdien er svært avhengig ikke bare av pH og ioniske styrke dispersiv miljøet, men også på overflaten karakteristikkene av partikler, kan det også være endringer i denne overflaten forårsaket av samspillet mellom de partikler og molekyl av interesse. 10

På den annen side, forekommende DNA struktur i dehydrert forhold (A-DNA skjema) utstillinger komprimerte konformasjonen som letter sin nedbør (samling) i forhold til vanlig B-DNA-skjemaet. Elektrostatisk (joniske og H-bånd) er de store styrkene kontrollere bindingen DNA til andre materialer på grunn av deres sterically tilgjengelig fosfat og nitrogen baser (spesielt guanine). 7 , 10

I dette arbeidet, analyseres tre representant kjemiske endringer av magnetiske nanopartikler og microparticles (figur 1A). Metoden for syntese og kjemisk endring av nanopartikler og microparticles er beskrevet. En forpliktende løsning, at avtalen teoretisk prinsipper for DNA nedbør (pH, ionisk styrke og dehydrering), brukes til å evaluere DNA bindende og elueringsrør. Kvantitativ PCR brukes til å evaluere elueringsrør effektiviteten av DNA fra representant nanopartikler og microparticles (figur 1B). Partikkelstørrelse, polydispersity indeks og zeta potensielle er viktige parametere som brukes til å visualisere mekanisk-endringene som skjer på partikkel overflate (figur 1 c). Det er viktig å understreke på kjemisk karakterisering av magnetiske partikler overflaten. Mens dette er utenfor omfanget av denne protokollen, brukes flere moderne teknikker for å undersøke effektiviteten av kjemiske modifikasjoner. 11 , 12 , 13 , 14 Fourier transformere infrarød spektroskopi (FTIR) kan brukes til å vurdere infrarød spekteret av partikkel overflaten og sammenlign det med spekteret av gratis kjemiske modifikatorer. X-ray photoelectron spektroskopi (XPS) er en annen teknikk som kan brukes til å identifisere elementær sammensetningen av materialoverflaten. Andre elektrokjemiske, mikroskopiske og spektroskopiske metoder kan brukes til å belyse kvaliteten på partikkel syntese. Dette arbeidet fremhever et nytt perspektiv til å analysere DNA-magnetiske partikler interaksjoner via DLS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. magnetiske nanopartikler syntese

  1. syntese av magnetiske nanopartikler stabilisert med citrate (MNPs)
    1. legge til 20 mmol FeCl 3 ∙ 6 H 2 O (5.406 g) og 10 mmol av FeCl 2 ∙ 4 H 2 O (1.988 g) i 20 mL deoxygenated dobbel destillert vann (ddd vann). Rør innhentet løsning kraftig i beaker under N 2 atmosfære med en mekanisk rørestang til en gjennomsiktig løsning oppnås.
    2. Under rask mekanisk omrøring, Legg 150 mL 1 M NH 4 OH, dråpe for dråpe med slippe trakt (ta 1 time eller mer hvis nødvendig). Overføre løsningen til et skru fartøy etter at alle NH 4 OH legges. Skru fartøyet og varme løsningen ved 75 ° C i 30 min.
      FORSIKTIG: NH 4 OH er klassifisert som skadelig og farlig for miljøet.
      Merk: Forberede NH 4 OH løsning fra høy klasse 28% NH 4 OH i vann med deoxygenated vann.
    3. Samle den svarte bunnfall bruker magnet og vask det med 100 mL ddd vann. Gjenta 3 ganger. Legge til 50 mL av 0,5 M tri-natrium citrat dihydrate å utløse. Skru fartøyet.
      Merk: Bruk deoxygenated løsning av tri-natrium citrat dihydrate.
    4. å spre utløse via sonication (35 kHz, amplituden til 100%) og varme fartøy ved 80 ° C i 1 h.
      Merk: En sonicator av nok strøm kreves.
    5. La løsning avkjøles til romtemperatur. Samle føre til med en magnet, og fjerne nedbryting. Nytt spre svart gjørme i 50 mL av ddd vann med sonicator (35 kHz, amplituden til 100%).
    6. Overføre dele (~ 25 mL) i 50 mL sentrifuge rør og legge 20 mL aceton. Sentrifuge 2400 x g i 10 min og fjerne supernatants.
    7. Re spre utløse og dialyze løsning mot vann med lav molekylvekt cut-off dialyse enhet (500-1000 Da) av egnet for 24 h.
      Merk: Klargjør dialyse enheten ifølge produsenten ' s krav.
  2. Syntese av magnetiske nanopartikler endret med forgrenet polyethylenimine (MNPs_PEI)
    1. sammenlegge 2 mL innhentet MNPs løsning (~0.1 g/mL) i et glass beger. Legge til 38 mL ddd vann og sonicate (35 kHz, amplituden til 100%) suspensjon (10 min).
    2. Under rask mekanisk omrøring, Legg 10 mL av 10% forgrenet polyethylenimine (gjennomsnittlig 25 kDa). Rør løsning for påfølgende 3 h.
    3. Samle bunnfall bruker magnet og fjerne nedbryting. Nytt spre bunnfall i 20 mL ddd vann. Gjenta 5 ganger så sonicate siste suspensjon (35 kHz, amplituden til 100%).
  3. Syntese av magnetiske nanopartikler partikler endret med silica (MNPs_TEOS)
    1. legge 10 mL innhentet MNPs løsning (~0.1 g/mL) i et glass beger. Legg til 60 mL vann og 130 mL av etanol. Sonicate løsning og legge 6 mL av 28% NH 4 OH.
    2. Under rask mekanisk omrøring, Legg 1 mL av tetraethyl orthosilicate. Rør løsning for påfølgende 12 h.
    3. Samle svart bunnfall bruker magnet og vaske det bruker 50 mL av etanol (3 ganger) og 50 mL vann (3 ganger). Nytt spre partikler i 10 mL av ddd vann og sonicate suspensjon (35 kHz, amplituden til 100%).
  4. Syntese av magnetiske nanopartikler endret med amino grupper (MNPs_APTES)
    1. legge til 5 mL innhentet MNPs_TEOS løsning (~0.1 g/mL) i et glass beger. Legge til 45 mL vann og 50 mL av etanol. Sonicate løsning (35 kHz, amplituden til 100%).
    2. Under rask mekanisk omrøring, Legg til 0,5 mL (3-aminopropyl) triethoxysilane. Rør løsning for påfølgende 3 h.
    3. Samle svart bunnfall bruker magnet og vaske det bruker 50 mL av etanol (3 ganger) og 50 mL vann (3 ganger). Nytt spre partikler i 5 mL av ddd vann og sonicate suspensjon (35 kHz, amplituden til 100%).

2. Magnetiske Microparticles syntese

  1. syntese av magnetiske microparticles stabilisert med citrate (MMPs)
    1. legge til 25 mL 2 M KNO 3, 12.5 mL 1 M KOH og 205.875 mL ddd vann i et skru fartøy. Legge til 6.675 mL 1 M FeSO 4 under magnetiske omrøring. Umiddelbart overføre fartøyet til en forvarmet vannbad (90 ° C) for 2 h.
      Merk: Forberede KNO 3 og KOH løsninger i ddd vann.
    2. La løsning avkjøles til romtemperatur. Samle svart bunnfall bruker magnet og vask det med 50 mL av ddd vann (5 ganger). Legge til 50 mL av 0,5 M tri-natrium citrat dihydrate å utløse. Skru fartøyet.
    3. Redisperse utløse via sonication (35 kHz, amplituden til 100%) og varme fartøy ved 80 ° C i 1 h. samle svart bunnfall bruker magnet og vask det med 50 mL av ddd vann (10 ganger).
    4. Endre MMPs med forgrenet polyethylenimine (MMPs_PEI), silika (MMPs_TEOS) og amino grupper (MMPs_APTES) som ligner MNPs protokollen. Se delene 2.2, 2,3 og 2.4, henholdsvis for mer informasjon.
  2. Syntese av magnetiske microparticles endret med forgrenet polyethylenimine (MMPs_PEI)
    1. legge til 5 mL MMPs løsning (~0.1 g/mL) i et glass beger. Legg 38 mL ddd vann og sonicate løsning (35 kHz, amplituden til 100%, 10 min). Under rask mekanisk omrøring legge 10 mL av 10% forgrenet polyethylenimine (gjennomsnittlig 25 kDa). Rør løsning for påfølgende 3 h.
    2. Samle føre til med en magnet, og fjerne nedbryting. Redisperse føre i 20 mL dobbel destillert vann. Gjenta 5 ganger så sonicate den endelige løsningen (35 kHz, amplituden til 100%).
  3. Syntese av magnetiske microparticles endret med silica (MMPs_TEOS)
    1. legge til 5 mL MMPs løsning (~0.1 g/mL) i et glass beger. Legg til 60 mL vann og 130 mL av etanol. Sonicate suspensjon (35 kHz, amplituden til 100%) og legge til 6 mL av 28% NH 4 OH.
    2. Under rask mekanisk omrøring, Legg 1 mL av tetraethyl orthosilicate. Rør løsning for påfølgende 12 h.
    3. Samle svart føre til med en magnet, og vaske det bruker 50 mL av etanol (3 ganger) og 50 mL vann (3 ganger). Redisperse partikler i 5 mL ddd vann og sonicate suspensjon (35 kHz, amplituden til 100%).
  4. Syntese av magnetiske microparticles endret med amino grupper (MMPs_APTES)
    1. sammenlegge 3 mL MMPs_TEOS løsning (~0.1 g/mL) i et glass beger. Legge til 45 mL vann og 50 mL av etanol. Sonicate suspensjon (35 kHz, amplituden til 100%).
    2. Under rask mekanisk omrøring, Legg til 0,5 mL (3-Aminopropyl) triethoxysilane. Rør løsning for påfølgende 3 h.
    3. Samle svart bunnfall bruker magnet og vaske det bruker 50 mL av etanol (3 ganger) og 50 mL vann (3 tid). Redisperse partikler i 3 mL ddd vann og sonicate suspensjon (35 kHz, amplituden til 100%).

3. Magnetiske partikler størrelse analyse bruker DLS

  1. partikkelstørrelse i vannet
    1. Bruk et DLS instrument som gjelder en tilbake spredning detektor vinkel (173 °) og en bjelke bølgelengde på 633 nm.
      Merk: Tilbake spredning DLS er egnet for konsentrert eksempler der flere spredning kan unngås. Siden spredning (detektor vinkel 90°) og videre spredning (detektor vinkel 15°) DLS er egnet for mindre partikler og blandet partikler, henholdsvis.
    2. Tidligere for måling i vann, sonicate partikler for 3 min.
      Merk: Bruk utvannet løsning av partikler. For dette formålet, bland 9,6 µL av partikler med 96 µL vann.
    3. Nøye Pipetter 50 µL av partikkel løsning i polystyren latex cuvettes og unngå bobler.
      Merk: For hver prøve, bruke engangs cuvette (se tabell av materialer).
    4. Merk klarhet i cuvette og lysstrålens retning. Sett cellen i prøven holderen og Lukk kammeret.
    5. Bruker følgende parametere for måling: temperatur: 25 ° C; brytningsindeks dispersiv fase (jern): 2.344; brytningsindeks dispersiv miljø (vann): 1,333
      Merk: Foreta en måling av brytningsindeks bruker en refractometer for mer nøyaktige resultater, spesielt når du utvikler roman eller hybrid materialer.

4. Forberede DNA lager, magnetiske partikler og bindende Buffer

  1. DNA lager
    1. Bruk 10 mM Tris-HCL buffer (pH = 8) for fortynning og lagring av DNA. Bruk en standard DNA-prøve som kan bli forsterket med en direkte PCR-protokoll i laboratoriet (se delen 5.2 for reaksjon innstillinger og betingelser). For å forsterke 498 base par (bp) av xis genet fra bacteriophage λ kontroll, kan du bruke følgende primerne. Videresende primer: 5 ' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Omvendt primer: 5 ' - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 '
    2. rense PCR produktet bruker kommersielle DNA rensing kit.
      Merk: Kommersielle kits silica kolonne-baserte fremgangsmåten gir > 100 ng/µL renset DNA.
    3. Mål konsentrasjon av DNA bruker Spektrofotometri metoden (absorbans ved 260 nm). Fortynne DNA beholdningen av 10 11 Kopier/µL idet instruert over arbeider løsninger av 10 10, 10 9, 10 8 og 10 7 Kopier/µL.
      Merk: Antall eksemplarer av PCR produktet kan beregnes etter følgende ligning, antar gjennomsnittlig molekylvekt er 650 Da for hver bp:
      DNA Kopier/µL = (antall i ng/µL * 6.022x10 23 Kopier/mol) / (498 bp * 650 g/mol av bp * 1 x 10 9 ng/g)
  2. magnetiske partikler
    1. tillate partikler til sediment uten magneten og fjerne nedbryting. Bland 1:20 v/v forholdet mellom magnetiske partikler med ddd vann (partikler: vann).
      Merk: Volum tilnærming brukes til å beskrive antall magnetiske partikler siden lik masser av MNPs og MMPs var lett vanskelig å sammenligne.
  3. Binding buffer
    1. For rask utarbeidelse av 0,75 M natrium acetate-HCL løsning (pH = 6), bland 1 mL av 3 M natrium acetate med 3 mL 1 mM HCL.
      Merk: Alle løsninger brukes i bindingen kan lagres på 4 ° C. Legg merke at lav temperatur øker bindende spesielt når det gjelder etanol løsning. Kontrollerer temperaturen på løsninger for bedre reproduserbarhet og nøyaktigheten av screening.

5. Testing effektiviteten av DNA isolasjon ved hjelp av kvantitative PCR

  1. DNA isolasjon av endret MMPs eller MNPs
    1. en 96-brønns plate og en magnet tilpasset 96-brønns plate for små eksperimenter.
    2. Bruker følgende bindende løsning blandingen: endret 8 µL MMPs eller MNPs, 10 µL natrium acetate-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µL av 85% etanol, 10 µL DNA (10 10 Kopier løsning).
    3. Blandingen godt av pipettering og sted plate magneten i 3 minutter. Mens platen er på magnet, fjerne løsningen og legge til 100 µL av 85% etanol for vasking.
    4. Fjern etanol.
      Merk: Tillater etanol tørke i noen sekunder, men ikke la partikler over tørr eller Vis sprekker. Hvis partikler over tørr vil de være oppløse elueringsrør løsning.
    5. Fjerne platen fra magneten og legger 40 µL elueringsrør løsning. Bland godt av pipettering. Plasser platen tilbake på magneten og samle elut DNA (~ 37 µL). Lagre eluent på 20 ° C til videre analyse.
  2. Kvantitative PCR
    1. bruke primerne som ble brukt til å forberede lager DNA i trinn 4.1.1 å kvantifisere kopier av xis genet, i henhold til protokollen av Haddad et al. 10
    2. forberede master mix løsning til så mye å bli testet, og deretter distribuere blandingen i PCR rør eller en hvit bakgrunn 96-brønns plate.
    3. Bruker følgende antall for en komplett volum av 20 µL PCR blanding: 10 µL polymerase / intercalating fargestoff blanding (se tabell av materialer), 2 µL DNA-prøve, 2 µL frem primer (10 µM), 2 µL omvendt primer (10 µM)
    4. Definerer thermocycler etter følgende program: 95 ° C for 120 s, 40 sykluser (95 ° C i 15 s, 64 ° C i 15 s, 68 ° C i 45 s), 68 ° C i 5 min.
    5. Bruke triplicates for standarder og prøver, beregne syklus terskelen og konstruere en standard kurve for å anslå hvor mange eksemplarer av DNA hentet i hver prøve. Instrumentet brukes her utfører dette automatisk.
    6. Her, antall eksemplarer av DNA anslås for totalt elueringsrør volum (~ 40 µL). Prosentandel av DNA Hentet tilsvarer opprinnelige beløpet legges til bindende løsning (helt 10 11 eksemplarer) kan variere utenfor intervallet 0-100.

6. DNA-magnetiske partikler Binding analyse bruker DLS

  1. DNA-bindende
    1. For store volum eksperimenter (i 1,5 mL tube), bruk følgende bindende løsning blandingen: endret 96 µL MMPs eller MNPs, 120 µL natrium acetate-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 µL av 85% etanol, 120 µL DNA (10 10 Kopier løsning) eller 120 µL Tris-HCL buffer (10 mM, pH = 8) for kontroll.
  2. Zeta potensielle analyse
    1. forberede to bindende løsninger, med DNA og en annen med Tris-HCL buffer for kontrollen som instruert i trinn 6.1.1. For å unngå dannelse av bobler, nøye Pipetter 800 µL av bindende blandingen i en engangs celle.
      Merk: Bruk disponibel cuvette for måling av overflaten zeta potensielle (se tabell av materialer).
  3. Bruk følgende parametere for måling på DLS instrument: Smoluchowski modell med en F(ka) på 1,5, temperatur: 25 ° C, brytningsindeks dispersiv fase (jern): 2.344, brytningsindeks dispersiv miljø (vann): 1,333.
    Merk: Frekvensen av DNA-magnetisk partikkel samhandling direkte påvirker måling av replikat. En enkelt måling av instrumentet tar 60-70 s. Her ble instrumentet instruert til å ta 10 mål med 1 min forsinkelse intervaller. For enkelhet, resultatene vises på tid = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 og 18 minutter fra første lesning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruker protokollen beskrevet her for syntese og modifikasjon av magnetiske partikler, ble seks magnetiske partikler syntetisert og analysert for DNA bindingen. Et sammendrag av analysen er vist i tabell 1. Ved å sammenligne partikkelstørrelse i vann og i forpliktende løsning, er det klart at alle partikler samlet i bindende løsning av 2-22 folder. Noen partikler videre samlet til flere kaster i nærvær av DNA; men dette var ikke direkte korrelert med DNA henting oppdaget av kvantitative PCR (tabell 1). Sammenligning av zeta potensielle (10 mål i ~ 2 min intervaller) partikler i Kontroller versus med DNA viste skarp nedgang i tre partikler; nemlig: MNPs_APTES, MMPs_TEOS og MMPs_APTES (figur 2). Trender i zeta potensielle over tid ble også observert, viser variasjoner i de tre første målingene før de er stabilisert i de fleste tilfeller (Figur 3). Variant etter eksponering for DNA ble hovedsakelig observert i MMPs (figur 2). Lavere standardavvik ble observert ved å utelate de tre første målingene som representerer første 5 min etter eksponering av partikler til DNA (tabell 1).

Samlet viser analyse i tabell 1 de forskjellige egenskapene til DNA-partikkel bindende som tilskrives magnetiske partikler størrelse og kjemiske modifikasjoner. Kort, MNPs_PEI nanopartikler økt i størrelse etter bindende DNA av fire folder med ingen betydelig endring i polydispersity indeks eller zeta potensielle. DNA var imidlertid ikke gjenopprettes i denne fremgangsmåten. MNPs_TEOS nanopartikler økt i størrelse og redusert i polydispersity indeksen med umerkelig endring i zeta potensielle etter DNA eksponering, men de var de beste partiklene i sine henting priser på 20,3%. MNPs_APTES nanopartikler DNET i størrelse og merkbart zeta potensielle ved DNA eksponering. MMPs_PEI microparticles viste ikke endre størrelse på DNA eksponering, men de økte i polydispersity indeks og redusert litt i zeta potensielle. MMPs_TEOS microparticles viste alternativ størrelse egenskaper til deres hydrogenion kolleger vil si MNPs_TEOS. Overraskende, reduseres de merkbart i zeta potensielle men ikke utenfor rekkevidden vises som MNPs_TEOS. MMPs_APTES økte i partikkelstørrelse på DNA eksponering og også redusert i zeta potensielle. Det er viktig å merke seg at både MNPs_APTES og MMPs_APTES beholdt lignende størrelser etter kjemisk endring tross for at de var laget av ulike størrelse prekursorer. De har også vist lignende bindingsegenskapene. MNPs_TEOS viste ingen betydelig endring i zeta potensielle etter verdiene i det laveste ekstreme oppdaget i denne studien.

Følge opp over tid for zeta potensielle viste stabiliserende verdiene etter 5-10 min, spesielt når det gjelder MNPs (figur 3A, 3 C og 3E). En kontinuerlig trend i zeta potensielle ble funnet i noen MMPs målinger (figur 3B, 3D og 3F). I noen tilfeller tilsvarte variasjoner i zeta potensielle variasjoner i polydispersity indeks og partikkel størrelse, men ikke med DNA henting av elueringsrør.

Figure 1
Figur 1: Protokollskjemaet. (A) kjemiske modifikasjoner av magnetiske partikler inkludert forgrenet polyethyleneimine, silica og amino grupper. (B) DNA isolasjon skritt benytter bindende buffer og magnetiske partikler immobilisert på magnet, etterfulgt av kvantitative PCR. (C) DNA-partikkel bindende analyse ved hjelp av DLS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Zeta potensialet i representant magnetiske partikler i tilstedeværelse og fravær av DNA. Eksponering for DNA forårsaket synlig reduksjon av zeta potensielle i MNPs_APTES, MMPs_TEOS og MMPs_APTES. Feilfelt representerer standardavvik (N = 10). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Zeta potensialet i representant magnetiske partikler over tid i tilstedeværelse og fravær av DNA. Zeta potensialet av partikler i bindingen løsning ble målt i tid = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 og 18 min. gapet mellom zeta potensielle kurvene kontroll vs med DNA er åpenbare i tilfeller av MMPs_TEOS, MNPs_APTES og MMPs_APTES. (A) Zeta potensialet i MNPs_PEI er svært positive som angir ingen interaksjoner. (B) Zeta potensialet i MMPs_PEI ned over tid antyder en svært langsom interaksjon mellom partikler og DNA. (C) Zeta potensialet i MNPs_TEOS var svært negativt i fravær og tilstedeværelsen av DNA. (D) Zeta potensialet i MMPs_TEOS viser lavere verdier i nærvær av DNA sammenlignet med kontrollene. (E) Zeta potensialet i MNPs_APTES viser lavere verdier i nærvær av DNA sammenlignet med kontrollene. (F) Zeta potensialet i MMPs_APTES viser lavere verdier i nærvær av DNA sammenlignet med kontrollene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Egenskaper MNPs_PEI MNPs_TEOS MNPs_APTES MMPs_PEI MMPs_TEOS MMPs_APTES
Partikkelstørrelse (nm)
i vann 141.8 91,3 1106.4 825.0 1281.3 1281.3
i forpliktende løsning 531.2 1990.1 3091.0 2669.0 2669.0 1990.1
i bindin
g løsning med DNA 1990.1 3091.0 2669.0 2669.0 1990.1 4145.4 observerte endring økt økt økt Polydispersity indeks i vann 0.237 0.240 0.219 0.410 0.281 0.206 i forpliktende løsning 0.225 0.773 0.090 0.107 0.374 0.397 i forpliktende løsning med DNA 0.240 0.298 0.282 0.301 0.387 0.319 observerte endring redusert økt økt Zeta potensielle (mV) * i forpliktende løsning 42,29 -27.83 33.23 30.80 -6.86 -0.66 (±SD) 1.15 1.17 2.89 8.99 7,99 5,42 i forpliktende løsning med DNA 41.81 -25.97 12.28 27.81 -23.67 -15.22 (±SD) 2,02 0,80 2,21 4.33 0,95 4.28 observerte endring redusert redusert redusert Kvantitativ PCR-henting ** DNA kopi tall Hentet 1.22E + 03 1.01E + 09 3.18E + 06 1.44E + 06 3.76E + 08 6.88E + 06 (±SD) 8.05E + 02 7.55E + 07 2.83E + 06 1.98E + 06 1.08E + 08 3.33E + 06 DNA henting prosent 0,0 20,3 0,1 0,0 7.5 0,1 (±SD) 0,0 1.5 0,1 0,0 2.2 0,1 * Bare stabil mål etter 5 minutter av binding er vist (N = 7). ** R² = 0.940 for triplicates standarder.

Tabell 1: karakterisering av representant magnetiske partikler og deres evner til å binde DNA. Ved eksponering til forpliktende løsning viste alle partikler aggregasjon (økning i partikkelstørrelse). Da DNA var i bindende løsning, var partikkel størrelse økningen synlig i MNPs_PEI, MNPs_TEOS og MMPs_APTES. Partiklene var polydisperse systemer i bindingen løsning, spesielt MNPs_TEOS som ble mindre polydispersed ved binding av DNA. MNPs_APTES viste økning i polydispersity indeks og nedgang i zeta potensielle ved eksponering til DNA. MMPs_TEOS og MMPs_APTES viste stor nedgang i zeta potensielle ved eksponering til DNA. MNPs_TEOS og MMPs_TEOS viste høyest DNA henting priser 20,3% og 7,5%, henholdsvis, som vist av kvantitative PCR. MNPs_APTES og MMPs_APTES viste 0,1% DNA henting priser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen var teoretisk prinsippene som forklarer DNA binding til magnetiske partikler via zeta potensielle under spørsmål. Protokollen beskriver syntese og modifikasjon av magnetiske nanopartikler og microparticles. Metode for utarbeidelse av DNA kontroll og forpliktende løsning er også beskrevet. To strategier vises her for screening av DNA-partikkel interaksjoner: kvantitative PCR og DLS tilnærminger. DLS gir tre indikatorer mekanisk-endringer i partikler: partikkelstørrelse, polydispersity indeks og zeta potensielle. Partikkel endres angi direkte aggregasjon eller oppløsning. Polydispersity indeksverdien beskriver fordelingen av partikkel arter i systemet fra monodispersed (indeks < 0,05) til svært polydispersed (indeks > 0,7). Zeta potensielle kan klassifisere partikler etter overflate kostnad hvor svært positive partikler viser verdier større enn 30 mV og svært negative partikler viser verdier lavere enn -30 mV. Som spådd, zeta potensialet i polycharged magnetiske partikler i bindingen løsning relativt redusert når partiklene ble utsatt for DNA. Unntaket fra denne regelen er MNPs_TEOS. Disse partiklene avviker bare i at de har en unik svært negative overflaten kostnad (figur 2). Dette tyder på at ioniske styrke spilte en viktig rolle i å holde partikler, DNA og positive ioner sammen. På den annen side, kan endringene i partikkelstørrelse angi rollen nedbør/samling av DNA-partikler under bindende prosessen, spesielt i nærvær av lengre DNA tilnærmingene.

Under syntese av magnetiske partikler og kjemiske modifikasjoner, er det flere kritiske trinn som krever oppmerksomhet: først reproduserbarhet av metoden for syntese avhenger sterkt på nøyaktig mengder av kjemiske prekursorer som brukes i syntese og god røring og rettidig kontrollert tillegg av NH4OH. For å erverve homogenisert innbyggere partikler (av lignende størrelse, form, tetthet og sammensetning), er det viktig å følge sonication og gripende fremgangsmåten grundig når instruert. Dernest realistisk adopsjonen kjemiske endringer ikke forutsi virkeligheten av hva er på overflaten av magnetiske partikler. En omfattende karakterisering trinn er nødvendig for å bekrefte den kjemiske sammensetningen av partikkel overflaten, som beskrevet i delen introduksjon. Blant de brukte teknikkene avhengige forskere FTIR, XPS, elektrokjemi, spektroskopi samt DLS.

I tillegg flere kritiske trinn er nødvendig under DLS mål og analyse: for det første valget av bindende løsningen påvirker ulike trinn inkludert kjemiske kompatibilitet med partikler og DNA og spektrale egenskapene. Valg av refractive indekser av bindende løsning og partikkel materiale kan være basert på tidligere studier eller evaluert av refractometry. Dernest bør interaksjoner mellom partikler og elektrodene i cuvettes være overvåket nøye som oksidasjon/reduksjon prosessen kan påvirke måling. For det tredje, som vist i Figur 3, frekvensen av binding kan være en funksjon av tid. Det er avgjørende å observere stabiliteten av samhandling, og dette er en stor fordel for anvendelse av DLS i slike studier. Her overvåker observatøren partikkel aggregering og physiochemical endringer i sanntid. Fjerde kan polydispersity av systemet angi begrensninger til omfanget av analyse. Polydispersity indeksverdien under 0,05 beskriver en monodispersed mens verdier over 0,7 beskriver et polydispersed system av ulike størrelser av partikler. Størrelsen på partikler og distribusjon av ulike partikkel arter kan studeres bruke ulike typer DLS, inkludert tilbake-spredt, side-spredt og spredt frem, som nevnt i avsnitt 3.1-protokollen. Endelig sonication partikler før testing kan selvsagt påvirke deres fysiske egenskaper (f.eks størrelse og areal) og hvis gjort overdrevent kan det føre til utgivelsen av noen kjemiske modifikasjoner.

I denne protokollen sammenlignet informasjon ervervet via DLS data ervervet av kvantitative PCR, også kjent som sanntid PCR. Sistnevnte er gullstandarden for deteksjon og kvantifisering av DNA. 15 PCR teknikken er mye brukt i laboratorier, sykehus og universiteter. Men når testing DNA eksponering for romanen og syntetisk materiale er det viktig å ta kjemi av PCR hensyn. Polymerase enzym, nøkkelelement i polymerasekjedereaksjons, er følsom for visse kjemiske hemmere og enhancers. Tillegg av interne kontroller, testing av syntetiske materialer, og god laboratoriepraksis kan redusere skjevheter i PCR resultater. Virkningsmekanismer hemmere og enhancers varierer mellom kjemikalier som direkte binde til utvalg og andre som chelate ioner fra Mg2 +-avhengige utvalg i løsningen. Noen innsikt i DNA isolasjon er vanskelig å få bruker PCR screening. Distribusjonslister kan vise tilfeller når DNA binder til partikler, men heller vasket eller ikke elute (DNA ikke oppdaget av PCR). For eksempel både MNPs_APTES og MMPs_APTES viste signifikant nedgang i zeta potensielle ved DNA eksponering (tabell 1), men DNA funnet i elueringsrørets samsvarer ikke med disse resultatene. Det er mulig å endre bindingen, vaskemaskin, elueringsrør løsninger å kontrollere utgivelsen av DNA fra partikler. Distribusjonslister er en relativt raskere metode for evaluering av DNA-partikkel interaksjoner. Stabilitet og hastighet på samhandling kan også observeres av denne metoden (Figur 3), som kan påvirke tiden som brukes i magnetiske partikler - basert DNA isolasjon protokoller.

Utfordringene for bruk av DLS analyse er rett frem. Denne teknikken krever et relativt stort utvalg volum for analyse (~ 1 mL) sammenlignet med PCR. Noen parametere som refractive indekser krever nøye vurdering når nye løsninger i prøvene. Videre er det svært vanlig å observere oksidasjon/reduksjon reaksjoner på elektrodene på cuvettes når testing romanen materiale. Nøye vurdering og kunnskap om den kjemiske sammensetningen av prøven kan hjelpe vurdere muligheten for å bruke den samme cuvette. Det er verdt å nevne at DLS analyse er begrenset til spesifisitet og følsomhet av PCR, men det gir ulike typer innsikt til tilknytningsprosessen DNA-partikkel.

Som alle spektroskopiske teknikker, modifikasjoner og feilsøking av DLS mål for utvikling av mer nøyaktig og følsom målinger. Dette kan oppnås ved å gi bedre forståelse av natur materialet testet fysisk og kjemisk. Med andre ord, er optiske egenskaper og opplysninger om kjemisk sammensetning nøkkelen til å få nøyaktig og følsom data fra DLS. Optiske egenskaper kan bli kjøpt opp av refractometry, mens kjemiske sammensetning av partikler / partikler overflaten kan studeres ved ulike teknikker som FTIR, XPS, elektrokjemi og andre spektroskopiske metoder. I denne protokollen, kan forpliktende løsning forbedres ved å bruke ulike ioniske styrker, andre dehydrating agenter (f.eks isopropanol), ulike pH og lave temperaturer. Derimot, igjen kjemiske endringer i partikkel overflaten til den apoteker fantasi.

Utviklingen av materialer til isolering av DNA vil fortsette å stige i neste tiår med mer fokus på spesifisitet, renhet og grensen for påvisning. Kvaliteten på innhenting spiller en viktig rolle i studier av enkeltcelle skala, metagenomic skalaer og prøver av uvanlig opprinnelse. På det nåværende tidspunktet er det viktig å utføre DLS analyse av nanopartikler og microparticles endret med ulike typer materialer. Dette trinnet er nødvendig før etablere en sterk teoretisk modell som beskriver virkemåten for DNA-partikkel interaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Økonomisk støtte av tsjekkiske Science Foundation (prosjekt GA CR 17-12816S) og CEITEC 2020 (LQ1601) er sterkt anerkjent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iron(III) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 207926 Magnetic particle synthesis
Iron(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich 380024 Magnetic particle synthesis
Iron(II) sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich F8263 Magnetic particle synthesis
Acetone Penta 10060-11000 Magnetic particle synthesis
Sodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich W302600 Magnetic particle synthesis
Tetraethyl orthosilicate Sigma-Aldrich 131903 Magnetic particle synthesis
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140 Magnetic particle synthesis
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 Sigma-Aldrich 408727 Magnetic particle synthesis
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 221228-M  Magnetic particle synthesis
Ethanol Penta 71250-11000 Magnetic particle synthesis
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P6083 Magnetic particle synthesis
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 1.05012 Magnetic particle synthesis
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) Spectrum labs G235063 Magnetic particle synthesis
Overhead Stirrer witeg Labortechnik GmbH DH.WOS01035 Magnetic particle synthesis
Waterbath Memmert GmbH + Co. 84198998 Magnetic particle synthesis
Sonicator Bandelin 795 Magnetic particle synthesis
BRAND UV cuvette micro Sigma-Aldrich BR759200-100EA Cuvette for size measurement
BRAND cap for UV-cuvette micro Sigma-Aldrich BR759240-100EA Cuvette caps for size measurement
Folded Capillary Zeta Cell Malvern DTS1070 Cuvette for zeta potential measurement
Zetasizer Nano ZS Malvern ZEN3600 Device for measurement of size and zeta potential
Infinite 200 PRO
NanoQuant instrument		 Tecan 396 227 V1.0, 04-2010 device for measurement of DNA concentration
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit Sigma-Aldrich QR0100 PCR kit
Mastercycler pro S instrument Eppendorf 6325 000.013 Thermocycler
MinElute kit Qiagen 28004 DNA purification kit
Sodium acetate Sigma-Aldrich S7670 DNA binding

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
  2. Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
  3. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
  4. Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
  5. Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
  6. Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
  7. Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).
  8. Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
  9. Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
  10. Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
  11. Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
  12. Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
  13. Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
  14. Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
  15. Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).

Tags

Kjemi problemet 129 DNA isolasjon magnetiske partikler kjemisk endring dynamisk lys spredning kvantitativ PCR
DNA-magnetiske partikler bindende analyse av dynamisk og Electrophoretic lysspredning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haddad, Y., Dostalova, S., Kudr, J., … More

Haddad, Y., Dostalova, S., Kudr, J., Zitka, O., Heger, Z., Adam, V. DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering. J. Vis. Exp. (129), e56815, doi:10.3791/56815 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter