Summary
Det här protokollet beskriver syntesen av magnetiska partiklar och utvärdering av deras DNA-bindande egenskaper via dynamiska och elektroforetiska ljusspridning. Denna metod fokuserar på bevaka förändringar i partikelstorlek, deras polydispertion och zeta potential av partikeln ytbehandlar som spelar större roll i bindningen av material såsom DNA.
Abstract
Isolering av DNA använder magnetiska partiklar är ett område av stor betydelse inom bioteknik och molekylärbiologi. Det här protokollet beskriver utvärderingen av DNA-magnetiska partiklar bindande via dynamiska ljusspridning (DLS) och elektroforetiska ljusspridning (ELS). Analys av DLS ger värdefull information om fysikalisk-kemiska egenskaperna för partiklar inklusive partikelstorlek, polydispertion och zeta potential. Den senare beskriver ytladdning av partikeln som spelar stor roll i elektrostatiska bindning av material såsom DNA. Här, utnyttjar en jämförande analys tre kemiska modifieringar av nanopartiklar och mikropartiklar och deras effekter på DNA-bindning och eluering. Kemiska modifieringar av förgrena sig polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate och (3-aminopropyl) triethoxysilane undersöks. Eftersom DNA uppvisar en negativ laddning, förväntas det att zeta potential partikel ytan kommer att minska vid bindning av DNA. Bildandet av kluster bör också påverka partikelstorlek. För att undersöka effektiviteten hos dessa partiklar i isolering och eluering av DNA, blandas partiklarna med DNA i lågt pH (~ 6), hög jonstyrka och uttorkning miljö. Partiklar tvättas på magnet och sedan DNA elueras av Tris / HCl buffert (pH = 8). DNA kopia antalet uppskattas med hjälp av kvantitativa polymeraskedjereaktion (PCR). Zeta potential, partikelstorlek, polydispertion och kvantitativa PCR data utvärderas och jämförs. DLS är en insiktsfull och stödja analysmetod som lägger till ett nytt perspektiv i processen för screening av partiklar för DNA isolering.
Introduction
DNA isolering är ett av de viktigaste stegen i molekylärbiologi. Utvecklingen av nukleinsyra extraktionsmetoder har stor inverkan på framväxande inom genomik, metagenomik, epigenetik och transkriptomik. Det finns ett brett utbud av biotekniska tillämpningar för DNA isolering inklusive medicinsk (kriminaltekniska/diagnosverktyg och prognostiska biomarkörer) och miljötillämpningar (gjorts biologisk mångfald, patogen prevalens och övervakning). Det har varit ökande efterfrågan att rena och isolera DNA från olika material och i olika skalor såsom blod, urin, jord, trä och andra typer av prover. 1 , 2 , 3 , 4
Nano - och micro-storlek partiklar är lämpliga för DNA isolering på grund av deras höga yta och särskilt när de kan vara orörlig av ett magnetfält. Fysikalisk-kemiska egenskaper av partiklar, t ex storlek eller avgift, kan kraftigt påverka deras förmåga att binda mål biomolekyler. 5 för att ytterligare förbättra bindningen av biomolekyler och stabilisera partiklar, kommer olika kemiska modifieringar (ytbeläggningar) kan utnyttjas. De många olika strategierna för bindande klassificeras enligt kovalenta och icke-kovalenta interaktioner. 6 storlek partiklar direkt påverkar deras magnetisering egenskaper, medan partikel sammansättning kan anpassas vid inkorporering av metall, legering eller annat material som kan påverka dess densitet och porositet yta. 7 det finns inga tillförlitliga sättet att mäta ytladdning av små partiklar. I stället kan elektrisk potential vid försenade planet (vissa avstånd från nanopartiklar yta) mätas. 8 detta värde kallas zeta potential och det är ett potent verktyg som vanligtvis används för utvärdering av nano- och microparticle stabilitet via DLS. 9 eftersom dess värde är beroende inte bara pH och jonstyrka spridande miljön, men också på ytan egenskaper av partiklar, det kan också visa ändringarna i denna yta som orsakas av samspelet mellan de partiklar och molekyl av intresse. 10
Däremot, förekommande DNA-strukturen i uttorkad villkor (A-DNA formulär) utställningar kompakterade konformationer som underlättar dess nederbörd (sammanläggning) jämfört till ofta B-DNA form. Elektrostatiska (Joniska och H-bond) är de stora krafter som styr bindningen av DNA till andra material på grund av deras produkter tillgängliga fosfat och kväve baser (särskilt guanin). 7 , 10
I detta arbete, tre representativa kemiska modifieringar av magnetiska nanopartiklar och mikropartiklar analyseras (figur 1A). Metoden för syntes och kemisk modifiering av nanopartiklar och mikropartiklar beskrivs. En bindande lösning, att avtalen till teoretiska principer av DNA nederbörd (pH, jonstyrka och uttorkning), används för att utvärdera DNA-bindning och eluering. Kvantitativ PCR används för att bedöma eluering effektiviteten av DNA från representativa nanopartiklar och mikropartiklar (figur 1B). Partikelstorlek, polydispertion index och zeta potential är viktiga parametrar som används för att visualisera de fysikalisk-kemiska förändringar som sker på partikeln ytbehandlar (figur 1 c). Det är viktigt att betona på kemisk karakterisering av magnetiska partikel ytan. Medan detta steg var utanför ramen för detta protokoll, kan flera moderna tekniker användas för att undersöka effektiviteten av kemiska modifieringar. 11 , 12 , 13 , 14 Fourier transform infraröd spektroskopi (FTIR) kan användas för att utvärdera det infraröda spektrumet av partikeln ytbehandlar och jämför det med spektrumet av gratis kemiska modifierare. X-ray fotoelektronen spektroskopi (XPS) är en annan teknik som kan användas för att identifiera elementärt sammansättningen av materialets yta. Andra elektrokemiska, mikroskopiska och spektroskopiska metoder kan användas för att belysa kvaliteten på partikel syntes. Detta arbete belyser ett nytt perspektiv att analysera DNA-magnetiska partiklar interaktioner via DLS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. magnetiska nanopartiklar syntes
- syntes av magnetiska nanopartiklar stabiliserad med citrat (MNPs)
- lägga till 20 mmol FeCl 3 ∙ 6 H 2 O (5.406 g) och 10 mmol FeCl 2 ∙ 4 H 2 O (1.988 g) i 20 mL syrefattigt dubbel destillerat vatten (ddd). Uppståndelse erhållna lösningen kraftigt i bägare under N 2 atmosfär med en mekanisk omrörare tills en genomskinlig lösning.
- Under snabb mekanisk omrörning, tillsätt 150 mL 1 M NH 4 OH, droppe för droppe med dropptratt (ta 1 h eller mer om det behövs). Över lösningen till en Skruvbar fartyget efter alla NH 4 OH läggs. Skruva den fartyg och värme lösningen vid 75 ° C i 30 min.
FÖRSIKTIGHET: NH 4 OH klassificeras som frätande och farliga för miljön.
Obs: Förbereda NH 4 OH lösning från hög grad 28% NH 4 OH i vatten med syrefattigt vatten. - Samla svarta fällningen med magnet och tvätta den med 100 mL ddd vatten. Upprepa 3 gånger. Tillsätt 50 mL 0,5 M tri-natrium citrat dihydrat utfällning. Skruva fast fartyget.
Obs: Använd syrefattigt lösning av tri-natrium citrat dihydrat. - Åter skingra fällningen via ultraljudsbehandling (35 kHz, amplitud på 100%) och värme fartyget vid 80 ° C i 1 h.
Obs: En någon sonikator av tillräcklig effekt behövs. - Låt lösningen svalna till rumstemperatur. Samla fällningen med hjälp av en magnet och ta bort supernatanten. Re skingra svart lera i 50 mL ddd vatten med någon sonikator (35 kHz, amplitud på 100%).
- Överför alikvoter (~ 25 mL) till 50 mL centrifugrör och tillsätt 20 mL aceton. Centrifugera vid 2400 x g i 10 minuter och ta bort supernatanterna.
- Åter skingra fällningen och dialyze lösning mot vatten med låg molekylvikt cut-off dialys enheten (500-1 000 Da) av lämplig volym för 24 h.
Obs: Förbered dialys enheten enligt tillverkaren ' s krav.
- Syntes av magnetiska nanopartiklar modifierad med förgrenade polyethylenimine (MNPs_PEI)
- Tillsätt 2 mL erhållna MNPs lösning (~0.1 g/mL) i en glasbägare. Tillsätt 38 mL ddd vatten och Sonikera (35 kHz, amplitud på 100%) suspensionen (10 min).
- Under snabb mekanisk omrörning, tillsätt 10 mL 10% Grenade polyethylenimine (genomsnittliga 25 kDa). Rör om lösningen för efterföljande 3 h.
- Samla fällningen med magneten och ta bort supernatanten. Re skingra fällningen i 20 mL ddd vatten. Upprepa 5 gånger sedan Sonikera slutgiltiga suspensionen (35 kHz, amplitud på 100%).
- Syntes av magnetiska nanopartiklar partiklar modifierad med kiseldioxid (MNPs_TEOS)
- tillsätt 10 mL av erhållna MNPs lösning (~0.1 g/mL) i en glasbägare. Tillsätt 60 mL vatten och 130 mL etanol. Sonikera lösning och tillsätt 6 mL 28% NH 4 OH.
- Under snabb mekanisk omrörning, tillsätt 1 mL tetraethyl orthosilicate. Rör om lösningen för efterföljande 12 h.
- Samla svart fällning med magneten och tvätta det med 50 mL etanol (3 gånger) och 50 mL vatten (3 gånger). Re skingra partiklarna i 10 mL ddd vatten och Sonikera upphängningen (35 kHz, amplitud på 100%).
- Syntes av magnetiska nanopartiklar modifierad med amino grupper (MNPs_APTES)
- Tillsätt 5 mL erhållna MNPs_TEOS lösning (~0.1 g/mL) i en glasbägare. Lägga till 45 mL vatten och 50 mL etanol. Sonikera lösning (35 kHz, amplitud på 100%).
- Under snabb mekanisk omrörning, tillsätt 0,5 mL (3-aminopropyl) triethoxysilane. Rör om lösningen för efterföljande 3 h.
- Samla svart fällning med magneten och tvätta det med 50 mL etanol (3 gånger) och 50 mL vatten (3 gånger). Re skingra partiklarna i 5 mL ddd vatten och Sonikera upphängningen (35 kHz, amplitud på 100%).
2. Magnetiska mikropartiklar syntes
- syntes av magnetiska mikropartiklar stabiliserad med citrat (MMP)
- tillsätt 25 mL 2 M KNO 3, 12,5 mL 1 m KOH och 205.875 mL ddd vatten en Skruvbar fartyget. Tillsätt 6.675 mL 1 M FeSO 4 under magnetisk omrörning. Omedelbart överföra fartyg till ett förvärmt vattenbad (90 ° C) för 2 h.
Obs: Förbereda KNO 3 och KOH lösningar i ddd vatten. - Låt lösningen svalna till rumstemperatur. Samla svarta fällningen med magnet och tvätta den med 50 mL ddd vatten (5 gånger). Tillsätt 50 mL 0,5 M tri-natrium citrat dihydrat utfällning. Skruva fast fartyget.
- Redisperse fällningen via ultraljudsbehandling (35 kHz, amplitud på 100%) och värme fartyget vid 80 ° C i 1 h. samla svart fällning med magnet och tvätta den med 50 mL ddd vatten (10 gånger).
- Ändra MMP med förgrenade polyethylenimine (MMPs_PEI), kiseldioxid (MMPs_TEOS) och amino grupper (MMPs_APTES) liknar MNPs protokollet. Se avsnitt 2.2, 2.3 och 2.4 respektive för mer detaljer.
- tillsätt 25 mL 2 M KNO 3, 12,5 mL 1 m KOH och 205.875 mL ddd vatten en Skruvbar fartyget. Tillsätt 6.675 mL 1 M FeSO 4 under magnetisk omrörning. Omedelbart överföra fartyg till ett förvärmt vattenbad (90 ° C) för 2 h.
- Syntes av magnetiska mikropartiklar modifierad med förgrenade polyethylenimine (MMPs_PEI)
- Tillsätt 5 mL MMP lösning (~0.1 g/mL) i en glasbägare. Tillsätt 38 mL ddd vatten och Sonikera lösningen (35 kHz, amplitud på 100%, 10 min). Lägg till 10 mL 10% Grenade polyethylenimine (genomsnittliga 25 kDa) under snabb omrörningen. Rör om lösningen för efterföljande 3 h.
- Samla fällningen med hjälp av en magnet och ta bort supernatanten. Redisperse fällningen i 20 mL dubbel destillerat vatten. Upprepa 5 gånger sedan Sonikera den slutliga lösningen (35 kHz, amplitud på 100%).
- Syntes av magnetiska mikropartiklar modifierad med kiseldioxid (MMPs_TEOS)
- Tillsätt 5 mL MMP lösning (~0.1 g/mL) i en glasbägare. Tillsätt 60 mL vatten och 130 mL etanol. Sonikera suspension (35 kHz, amplitud på 100%) och tillsätt 6 mL 28% NH 4 OH.
- Under snabb mekanisk omrörning, tillsätt 1 mL tetraethyl orthosilicate. Rör om lösningen för efterföljande 12 h.
- Samla svart fällning med hjälp av en magnet och tvätta det med 50 mL etanol (3 gånger) och 50 mL vatten (3 gånger). Redisperse partiklar i 5 mL ddd vatten och Sonikera upphängningen (35 kHz, amplitud på 100%).
- Syntes av magnetiska mikropartiklar modifierad med amino grupper (MMPs_APTES)
- tillsätt 3 mL MMPs_TEOS lösning (~0.1 g/mL) i en glasbägare. Lägga till 45 mL vatten och 50 mL etanol. Sonikera upphängningen (35 kHz, amplitud på 100%).
- Under snabb mekanisk omrörning, tillsätt 0,5 mL (3-Aminopropyl) triethoxysilane. Rör om lösningen för efterföljande 3 h.
- Samla svart fällning med magneten och tvätta det med 50 mL etanol (3 gånger) och 50 mL vatten (3 tid). Redisperse partiklar i 3 mL ddd vatten och Sonikera upphängningen (35 kHz, amplitud på 100%).
3. Magnetiska partikel storlek analys använder DLS
- partikelstorlek i vatten
- Använd en DLS instrument som gäller en tillbaka scattering detektor vinkel (173 °) och en balk våglängd av 633 nm.
Obs: Back scattering DLS är lämplig för koncentrerade prover där flera scattering kan undvikas. Sida-spridning (detektor vinkel 90°) och framåt spridning (detektor vinkel 15°) DLS lämpar sig för mindre partiklar och blandas partiklar, respektive. - Föregående mätning i vatten, Sonikera partiklar för 3 min.
Obs: Använd utspädd lösning av partiklarna. För detta ändamål, blanda 9,6 µL av partiklar med 96 µL vatten. - Noggrant pipett 50 μl av partikel lösning i polystyren latex kyvetter och undvika att bubblor bildas.
Obs: För varje prov, använda disponibla kyvetten (se tabell material). - Observera tydligheten i kyvetten och riktningen av ljusstrålen. Infoga cellen i provhållaren och Stäng kammaren.
- Använda följande parametrar för mätning: temperatur: 25 ° C; brytningsindex för spridande fas (järn): 2.344; brytningsindex för spridande miljö (vatten): 1.333
Obs: Utföra mätning av brytningsindex med en refraktometer för exaktare resultat, särskilt när de utvecklar roman eller hybrid material.
- Använd en DLS instrument som gäller en tillbaka scattering detektor vinkel (173 °) och en balk våglängd av 633 nm.
4. Förbereda DNA lager, magnetiska partiklar och bindande buffert
- DNA lager
- Använd 10 mM Tris-HCL buffert (pH = 8) för utspädning och lagring av DNA. Använd en vanlig DNA-prov som kan amplifieras specifikt med ett direkt PCR-protokoll i laboratorium (se avsnitt 5.2 för reaktion inställningar och villkor). För att förstärka 498 baspar (bp) av xis genen från bacteriophage λ kontroll, Använd följande grundfärger. Vidarebefordra primer: 5 ' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Reverse primer: 5 ' - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 '
- rena PCR-produkt med kommersiella DNA rening kit.
Obs: Kommersiella kit med kiseldioxid kolumnbaserade procedur avkastning > 100 ng/µL renade DNA. - Mäter koncentrationen av DNA med spektrofotometrisk metod (absorbans vid 260 nm). Späd DNA beståndet av 10 11 kopior/μl enligt instruktionerna ovan till fungerande lösningar av 10 10 10 9 10 8 och 10 7 kopior/μl.
Anmärkning: Antalet kopior av PCR-produkten kan beräknas enligt följande ekvation, förutsatt att medelmolekylvikt är 650 Da för varje bp:
DNA kopior/μl = (kvantitet i ng/µL * 6.022x10 23 kopior/mol) / (498 bp * 650 g/mol av bp * 1 x 10 9 ng/g)
- magnetiska partiklar
- partiklar till sediment utan magneten och ta bort supernatanten. Blanda 1:20 av magnetiska partiklar med ddd vatten baserat på v/v (partiklar: vatten).
Obs: Volym-baserat tillvägagångssätt används för att beskriva mängder magnetiska partiklar sedan lika massorna MNPs och MMP var lätt svårt att jämföra.
- partiklar till sediment utan magneten och ta bort supernatanten. Blanda 1:20 av magnetiska partiklar med ddd vatten baserat på v/v (partiklar: vatten).
- Bindande buffert
- för snabb beredning av 0,75 M natrium acetat-HCL-lösning (pH = 6), blanda 1 mL 3 M natriumacetat med 3 mL av 1 mM HCL.
Obs: Alla lösningar används i bindande kan lagras vid 4 ° C. Observera att låg temperatur avsevärt ökar bindande särskilt när det gäller etanol lösningen. Noggrant kontrollera temperaturen på lösningar för bättre reproducerbarhet och noggrannhet av screening.
- för snabb beredning av 0,75 M natrium acetat-HCL-lösning (pH = 6), blanda 1 mL 3 M natriumacetat med 3 mL av 1 mM HCL.
5. Testa effektiviteten av DNA isolering använder kvantitativa PCR
- DNA isolering av modifierade MMP eller MNPs
- använda en plattan med 96 brunnar och en magnet som anpassade för plattan med 96 brunnar för liten volym experiment.
- Använda följande bindande lösning blandningen: 8 µL modifierad MMP eller MNPs, 10 µL natrium acetat-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µL av 85% etanol, 10 µL DNA (10 10 kopior lösning).
- Blanda väl genom pipettering och placera plattan på magneten i 3 min. Medan plattan är på magneten, ta bort lösningen och tillsätt 100 µL av 85% etanol för tvätt.
- Ta bort etanol.
Obs: Tillåta etanolen torka i några sekunder men låt inte partiklarna alltför torr eller Visa sprickor. Om partiklarna alltför torr de kommer att bli svårt att lösa upp med eluering lösning. - Avlägsna plattan från magneten och tillsätt 40 µL eluering lösning. Blanda väl genom pipettering. Placera plattan tillbaka på magneten och samla eluerade DNA (~ 37 µL). Lagra eluenten vid-20 ° C tills vidare analys.
- Kvantitativa PCR
- använda primers som användes för att förbereda lager DNA i steg 4.1.1 att kvantifiera kopior av genen xis, enligt protokollet av Haddad et al. 10
- Bered master mix lösning enligt antalet prover som skall testas och sedan fördela blandningen i PCR-rör eller plattan med 96 brunnar en vit bakgrund.
- Använda följande kvantiteter för en komplett volym av 20 µL PCR blandning: 10 µL polymeras / infoga dye blandning (se tabell material), 2 µL DNA-prov, 2 µL framåt primer (10 µM), 2 µL reverse primer (10 µM)
- Ställa in termocyklern enligt följande program: 95 ° C i 120 s, 40 cykler (95 ° C under 15 s, 64 ° C för 15 s, 68 ° C för 45 s), 68 ° C för 5 min.
- Använda exemplar för standarder och prover, beräkna tröskeln för cykel och konstruera en standardkurva för att uppskatta antalet kopior av DNA Hämtad i varje prov. Instrumentet används här utför detta automatiskt.
- Här, antal kopior av DNA är beräknad för totala elutionsvolymen (~ 40 µL). Procentandel av DNA Hämtad motsvarande ursprungliga beloppet till bindande lösning (totalt 10 11 kopior) kan variera utanför intervallet 0 till 100.
6. DNA-magnetiska partiklar bindande analys använder DLS
- Bindande av DNA
- för stor volym experiment (i 1,5 mL tub), använda följande bindande lösning blandningen: 96 µL modifierad MMP eller MNPs, 120 µL natrium acetat-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 µL av 85% etanol, 120 µL DNA (10 10 kopior lösning) eller 120 µL Tris / HCL buffert (10 mM, pH = 8) för kontroll.
- Zeta potential analys
- Förbered två bindande lösningar, en med DNA och en annan med Tris-HCL buffert för kontroll enligt instruktionerna i steg 6.1.1. För att undvika bildandet av bubblor, noggrant Pipettera 800 µL av bindande blandningen till en disponibel cell.
Obs: Använd disponibel kyvetten för mätning av surface zeta potential (se tabell material).
- Förbered två bindande lösningar, en med DNA och en annan med Tris-HCL buffert för kontroll enligt instruktionerna i steg 6.1.1. För att undvika bildandet av bubblor, noggrant Pipettera 800 µL av bindande blandningen till en disponibel cell.
- Använda följande parametrar för mätning på DLS instrument: Smoluchowski modell med en F(ka) 1,5, temperatur: 25 ° C, brytningsindex för spridande fas (järn): 2.344, brytningsindex för spridande miljö (vatten): 1.333.
Obs: Graden av DNA-magnetiska partikel interaktion påverkar direkt mätning av replikat. En enda mätning av instrumentet tar 60-70 s. Här, instruerades instrumentet att ta 10 mätningar med 1 min fördröjningsintervall. För enkelhetens skull resultaten visas på gång = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 och 18 min från förstabehandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av protokollet som beskrivs här för kemisk syntes och modifiering av magnetiska partiklar, var sex magnetiska partiklar syntetiseras och analyseras för DNA-bindning. En sammanfattning av analysen visas i tabell 1. Genom att jämföra partikelstorlek i vatten och bindande lösning, är det tydligt att alla partiklar samman i bindande lösning av 2-22 veck. Vissa partiklar samlas vidare till fler veck i närvaro av DNA; Detta var emellertid inte direkt korrelerade med DNA hämtning upptäcks av kvantitativ PCR (tabell 1). Jämförelse av zeta potential (10 mätningar i ~ 2 min intervaller) av partiklar i kontroller kontra med DNA visade kraftigt i tre partiklar; nämligen: MNPs_APTES, MMPs_TEOS och MMPs_APTES (figur 2). Trender i zeta potential med tiden observerades också, visar variationer i de tre första behandlingarna innan de har stabiliserats i de flesta fall (figur 3). Variationen efter exponering för DNA observerades främst i MMP (figur 2). Lägre standardavvikelse observerades genom att utelämna de tre första behandlingarna som representerar första 5 min efter exponering av partiklar till DNA (tabell 1).
Övergripande visar analys i tabell 1 de olika egenskaperna hos DNA-partikel bindande som tillskrivs magnetiska partikelstorlek och kemiska modifieringar. Kort, MNPs_PEI nanopartiklar ökat i storlek efter bindande DNA av fyra veck med ingen signifikant förändring i polydispertion index eller zeta potential. DNA var dock inte inhämtas i detta förfarande. MNPs_TEOS nanopartiklar ökat i storlek och minskade i polydispertion index med omärklig förändring i zeta potential efter DNA exponering, men de var de bästa partiklarna i deras hämtning priser på 20,3%. MNPs_APTES nanopartiklar minskade något i storlek och märkbart zeta potential vid DNA exponering. MMPs_PEI mikropartiklar visade inte förändring i storlek vid DNA exponering, men de ökade i polydispertion index och minskade något i zeta potential. MMPs_TEOS mikropartiklar visade alternativ storlek egenskaper till deras nanopartiklar motsvarigheter dvs MNPs_TEOS. Överraskande, minskade de märkbart i zeta potential men inte utanför det intervall som visas av MNPs_TEOS. MMPs_APTES ökat i partikelstorlek vid DNA exponering och minskade också i zeta potential. Det är viktigt att notera att både MNPs_APTES och MMPs_APTES kvar liknande storlekar efter kemisk modifiering trots att de var gjorda av olika storlek prekursorer. De har också visat liknande bindande egenskaper. MNPs_TEOS visade ingen signifikant förändring i zeta potential av deras värden i den lägsta extremt upptäcktes i denna studie.
Följa upp över tiden för zeta potential visade stabiliserande värdena efter 5-10 min, särskilt när det gäller MNPs (figur 3A, 3 C och 3E). En kontinuerlig utveckling av zeta potential hittades i vissa MMP avläsningar (figur 3B, 3D och 3F). I vissa fall motsvarade variationer i zeta potentiella variationer i polydispertion index och partikel storlek men inte med DNA hämtning genom eluering.
Figur 1: protokoll systemet. (A) kemiska modifieringar av magnetiska partiklar inklusive förgrenade polyethyleneimine, kiseldioxid och amino grupper. (B) DNA isolering steg med hjälp av bindande buffert och magnetiska partiklar orörlig på magnet, följt av kvantitativ PCR. (C) DNA-bindande Partikelanalys använder DLS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Zeta potential av representativa magnetiska partiklar i närvaro och frånvaro av DNA. Exponering för DNA orsakade synlig minskning av zeta potential i MNPs_APTES, MMPs_TEOS och MMPs_APTES. Felstaplar representera standardavvikelse (N = 10). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Zeta potential av representativa magnetiska partiklar över tid i närvaro och frånvaro av DNA. Zeta potential av partiklar i bindande lösning mättes på gång = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 och 18 min. Gap mellan zeta potential kurvorna kontroll jämfört med DNA är uppenbara i fall av MMPs_TEOS, MNPs_APTES och MMPs_APTES. (A) Zeta potential MNPs_PEI är mycket positivt som anger inga interaktioner. (B) Zeta potential av MMPs_PEI minskade med tiden vilket tyder på en mycket långsam växelverkan mellan partiklar och DNA. (C) Zeta potential av MNPs_TEOS var mycket negativ i frånvaro och närvaro av DNA. (D) Zeta potential av MMPs_TEOS visar lägre värden i närvaro av DNA jämfört med kontroller. (E) Zeta potential av MNPs_APTES visar lägre värden i närvaro av DNA jämfört med kontroller. (F) Zeta potential av MMPs_APTES visar lägre värden i närvaro av DNA jämfört med kontroller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Egenskaper | MNPs_PEI | MNPs_TEOS | MNPs_APTES | MMPs_PEI | MMPs_TEOS | MMPs_APTES |
| Partikelstorlek (nm) | ||||||
| i vatten | 141,8 | 91,3 | 1106.4 | 825.0 | 1281.3 | 1281.3 |
| i bindande lösning | 531,2 | 1990.1 | 3091.0 | 2669.0 | 2669.0 | 1990.1 |
| i fr |
Tabell 1: karakterisering av representativa magnetiska partiklar och deras förmåga att binda och hämta DNA. Vid exponering för bindande lösning visade alla partiklar aggregation (ökning partikelstorlek). När DNA var närvarande i bindande lösning, var partikel storlek ökar synlig i MNPs_PEI, MNPs_TEOS och MMPs_APTES. Partiklar var polydisperse system i bindande lösning, särskilt MNPs_TEOS som blev mindre polydispersed vid bindning av DNA. MNPs_APTES visade ökning i polydispertion index och minskning i zeta potential vid exponering för DNA. MMPs_TEOS och MMPs_APTES visade stor minskning zeta potential vid exponering för DNA. MNPs_TEOS och MMPs_TEOS visade högsta DNA hämtning andelen 20,3% och 7,5%, respektive, som visas med kvantitativ PCR. MNPs_APTES och MMPs_APTES visade 0,1% DNA hämtning priser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll var de teoretiska principer som förklarar DNA bindning till magnetiska partiklar via zeta potential under frågan. Protokollet beskrivs syntesen och ändring av magnetiska nanopartiklar och mikropartiklar. Metod för beredning av DNA kontroll och bindande lösning beskrivs också. Här visas två strategier för screening av DNA-partikel interaktioner: kvantitativ PCR och DLS närmar sig. DLS ger tre indikatorer av fysikalisk-kemiska förändringar i partiklar: partikelstorlek, polydispertion index och zeta potential. Partikel storlek förändringar tyder direkt aggregering eller sönderfall. Polydispertion indexvärdet beskriver fördelningen av partikel arter i systemet sträcker sig från monodispersed (index < 0,05) till mycket polydispersed (index > 0,7). Zeta potential kan klassificera partiklar enligt ytladdning där mycket positiva partiklar Visa värden större än 30 mV och mycket negativa partiklar Visa värden lägre än -30 mV. Som förutspått, zeta potential polycharged magnetiska partiklar i bindande lösning relativt minskade när partiklarna utsattes för DNA. Undantaget från denna regel är MNPs_TEOS. Dessa partiklar avviker endast att de besitter en unik mycket negativa ytladdning (figur 2). Detta tyder på att jonstyrka spelade en viktig roll i att hålla partiklar, DNA och positiva joner tillsammans. Däremot, kan förändringar i partikelstorlek ange rollen av nederbörd/sammanläggning av DNA-partiklar under bindande processen, särskilt i närvaro av längre DNA-strängar.
Under syntes av magnetiska partiklar och kemiska modifieringar, finns det flera kritiska steg som kräver uppmärksamhet: för det första reproducerbarheten av metoden för syntes beror mycket på exakta mängder kemiska prekursorer som används i syntes samt bra omrörning och aktuell kontrollerad tillsats av NH4OH. För att förvärva en homogeniserad befolkningen av partiklar (av liknande storlek, form, densitet och sammansättning), är det viktigt att följa ultraljudsbehandling och omrörning steg noggrant när instruerade. För det andra, i många realistiska fall de kemiska modifieringarna inte förutsäga verkligheten av vad som finns på ytan av magnetiska partiklar. Ett omfattande karakterisering steg krävs för att bekräfta den kemiska sammansättningen av partikeln ytbehandlar, som beskrivs i avsnittet inledning. Bland de vanligaste teknikerna, forskare förlitar sig på FTIR, XPS, elektrokemi, spektroskopi samt DLS.
Dessutom flera kritiska steg krävs under DLS mätningar och analys: för det första valet av bindande lösning påverkar olika steg inklusive kemisk kompatibilitet med partiklar och DNA och också spektrala egenskaper. Val av refractive index av bindande lösning och partikel material kan vara baserat på tidigare studier eller utvärderas av refraktometer. För det andra bör interaktioner mellan partiklarna och elektroderna i kyvetter övervakas noggrant eftersom oxidation/reduktion processen kan påverka mätningen. För det tredje, som visas i figur 3, bindande kan vara en funktion av tiden. Det är viktigt att observera stabiliteten i interaktion, och detta är en stor fördel för tillämpning av DLS i sådana studier. Observatören här, övervakning partikel aggregering och fysiokemiska ändringar i realtid. För det fjärde kan polydispertion av systemet ställa begränsningar av tillämpningsområdet för analys. Polydispertion index-värde under 0,05 beskriver ett monodispersed system medan värden över 0,7 beskriva ett polydispersed system av olika storlekar av partiklar. Storleken på partiklarna och distribution av olika partikel arter kan studeras med hjälp av olika typer av DLS, inklusive bakåtspritt, sida-spridda och utspridda framåt, som nämns i protokollet avsnitt 3.1. Slutligen, ultraljudsbehandling av partiklar före provning kan naturligtvis påverka deras fysiska egenskaper (t.ex. storlek och yta) och om gjort överdrivet kan det orsaka utsläpp av vissa kemiska modifieringar.
I detta protokoll, är information som förvärvats via DLS jämfört data förvärvas av kvantitativa PCR, även känd som realtids-PCR. Det senare är den gyllene standarden för upptäckt och kvantifiering av DNA. 15 PCR-teknik används ofta i laboratorier, sjukhus och universitet. Men när testning DNA exponering för roman och syntetiskt material är det viktigt att ta PCR kemi hänsyn. Polymeras enzym, den viktigaste delen av polymeras-kedjereaktion, är känslig för vissa kemiska hämmare och smakförstärkare. Tillägg av interna kontroller, testning av syntetiska material och god laboratoriesed kan bidra till att minska fördomar i PCR-resultat. Verkningsmekanismer för hämmare och smakförstärkare varierar mellan kemikalier som direkt binder till polymeras och andra som kelat joner från det Mg2 +-beroende polymeras i lösning. Några insikter på DNA isolering är svåra att få med hjälp av PCR-screening. DLS kan visa fall när DNA binds till partiklar men snarare tvättas eller inte eluera (DNA inte upptäcks av PCR). Exempelvis både MNPs_APTES och MMPs_APTES visade signifikant minskning i zeta potential vid DNA exponering (tabell 1) men DNA påvisas i eluering var inte korrelerad med dessa resultat. Det är möjligt att ändra bindningen, tvättmaskin, eluering lösningar att kontrollera frisättningen av DNA från partiklar. DLS är en relativt snabbare metod för utvärdering av DNA-partikel interaktioner. Stabilitets- och graden av interaktion kan också observeras genom denna metod (figur 3), vilket kan påverka den tid som används i magnetiska partiklar - baserad DNA isolering protokoll.
Utmaningarna för att använda DLS i analysen är rakt fram. Denna teknik kräver en relativt stor provvolymen för analys (~ 1 mL) jämfört med PCR. Vissa parametrar som refractive index kräver noggrann utvärdering när nya lösningar i proven. Dessutom är det mycket vanligt att iaktta oxidation/reduktion reaktioner på elektroderna av kyvetter när du testar nya material. Noggrann bedömning och kunskap om den kemiska sammansättningen av provet kan hjälpa till att utvärdera genomförbarheten av återanvändning av den samma kyvetten. Det är värt att nämna att DLS analys är begränsad till specificitet och känslighet som tillhandahålls av PCR, men det ger olika slags insikt till DNA-partikel bindande processen.
Som alla spektroskopiska tekniker, modifieringar och felsökning av DLS målet för utvecklingen av mer exakta och känsliga mätningar. Detta kan uppnås genom att ge bättre förståelse av typ av material testas fysiskt och kemiskt. Med andra ord, är optiska egenskaper och Detaljer för kemisk sammansättning nyckeln till att få korrekt och känsliga data från DLS. Optiska egenskaper kan förvärvas med refraktometer, medan kemiska sammansättningen av partiklar / partiklarnas yta kan studeras genom olika tekniker såsom FTIR, XPS, elektrokemi och andra spektroskopiska metoder. I detta protokoll, kan bindande lösning förbättras med hjälp av olika Joniska styrkor, andra uttorkande agenter (e.g. isopropanol), olika pH och låga temperaturer. Däremot, kvar de kemiska modifieringar av partikel yta för kemister fantasi.
Utveckling av material för isolering av DNA kommer att fortsätta att stiga under de närmaste årtiondena med mer fokus på specificitet, renhet och detektionsgräns. Kvaliteten på extraktionsmetoder spelar viktig roll i studier av enstaka cell skala, metagenomic skalor och prover av ovanliga ursprung. För närvarande är det viktigt att utföra DLS analys av nanopartiklar och mikropartiklar modifierad med olika typer av material. Detta steg krävs innan upprätta en stark teoretisk modell som beskriver beteendet hos DNA-partikel interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Ekonomiskt stöd av tjeckiska vetenskapsstiftelsen (projektet GA CR 17-12816S) och CEITEC 2020 (LQ1601) är kraftigt erkänt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
| Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
| Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
| ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
| Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
| Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
| Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
| BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
| BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
| Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
| Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
| SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
| Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |
References
- Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
- Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
- Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
- Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
- Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
- Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).
- Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
- Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
- Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
- Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
- Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
- Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
- Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
