DNA-magnético partícula análise por dispersão de luz dinâmica e eletroforético de vinculação

Summary

Este protocolo descreve a síntese de partículas magnéticas e avaliação de suas propriedades de ligação a DNA através de espalhamento de luz dinâmica e eletroforético. Este método concentra-se em acompanhamento de alterações no tamanho da partícula, sua polidispersividade e potencial zeta de superfície de partícula que desempenham grande papel na ligação de materiais tais como o DNA.

Abstract

Isolamento de DNA utilizando partículas magnéticas é um campo de grande importância na pesquisa de biotecnologia e biologia molecular. Este protocolo descreve a avaliação de partículas magnéticas-DNA ligação via difusão dinâmica da luz (DLS) e espalhamento de luz eletroforético (ELS). Análise por DLS fornece informações valiosas sobre as propriedades físico-químicas das partículas, incluindo o tamanho de partícula, polidispersividade e potencial zeta. O último descreve a carga superficial da partícula que desempenha papel importante na ligação eletrostática de materiais tais como o DNA. Aqui, uma análise comparativa explora três modificações químicas de nanopartículas e micropartículas e seus efeitos sobre a ligação do DNA e eluição. Modificações químicas por ramificada o polyethylenimine, tetraetila orthosilicate e (3-aminopropil) triethoxysilane são investigados. Desde que o DNA apresenta uma carga negativa, espera-se que potencial zeta de superfície de partícula irá diminuir a ligação do DNA. Formação de clusters deve também afetam o tamanho de partícula. Para investigar a eficiência dessas partículas isoladamente e eluição do DNA, as partículas são misturadas com DNA em pH baixo (~ 6), alta força iônica e ambiente de desidratação. As partículas são lavadas no ímã e então DNA é eluída por tampão Tris-HCl (pH = 8). Número de cópia do DNA é estimado usando quantitativa cadeia da polimerase (PCR). Potencial zeta, tamanho de partícula, polidispersividade e dados quantitativos de PCR são avaliados e comparados. DLS é uma perspicaz e método de análise que adiciona uma nova perspectiva para o processo de triagem de partículas para isolamento de DNA de apoio.

Introduction

Isolamento do DNA é um dos passos mais importantes em biologia molecular. O desenvolvimento de métodos de extração de ácido nucleico tem grande impacto sobre os campos emergentes da genómica, metagenômica, epigenética e transcriptomics. Há uma ampla gama de aplicações biotecnológicas para isolamento de DNA, incluindo médicos (ferramentas forenses/diagnóstico e prognósticos biomarcadores) e aplicações ambientais (biodiversidade metagenomic, prevalência do patógeno e vigilância). Tem havido crescente demanda para purificar e isolar o DNA de diferentes materiais e em diferentes escalas tais como sangue, urina, solo, madeira e outros tipos de amostras. ^{1 , 2 , 3 , 4}

E micropartículas nanométricas são apropriadas para isolamento de DNA devido à sua elevada área superficial e, em especial quando eles podem ser imobilizados por um campo magnético. Propriedades físico-químicas de partículas, tais como tamanho ou carga, grandemente podem influenciar a sua capacidade de biomoléculas alvo. ⁵ para aumentar ainda mais a vinculação de biomoléculas e estabilizar as partículas, as modificações químicas diferentes (revestimentos de superfície) podem ser utilizadas. As muitas estratégias diferentes para ligação são classificadas de acordo com interações não covalentes e covalentes. ⁶ o tamanho das partículas afeta diretamente suas propriedades de magnetização, Considerando que a composição da partícula pode ser costurada por incorporação de metálico, ligas ou outros materiais que podem influenciar a sua densidade, porosidade e superfície. ⁷ não há nenhuma maneira confiável para medir a carga superficial das partículas pequenas. Em vez disso, o potencial elétrico no plano de escorregamento (alguma distância longe da superfície de nanopartículas) pode ser medido. ⁸ este valor é chamado de zeta potencial e é uma ferramenta potente que geralmente é utilizada para avaliação da estabilidade de nano - e micropartículas através de DLS. ⁹ desde que seu valor é altamente dependente não só o pH e força iônica do meio ambiente dispersivo, mas também sobre as características de superfície das partículas, pode também provar as alterações nesta superfície causado pela interação entre o partículas e moléculas de interesse. ¹⁰

Por outro lado, a estrutura do DNA em condições desidratado (forma A-DNA) exposições compactado conformações que facilitam sua precipitação (agregação) quando comparado ao comumente ocorrendo formulário B-DNA. Eletrostática (iônica e ligação-H) são as principais forças controlando a ligação do DNA a outros materiais devido à sua estericamente acessível fosfato e bases nitrogenadas (particularmente a guanina). ^{7 , 10}

Neste trabalho, analisam-se três modificações químicas representativas de nanopartículas magnéticas e micropartículas (figura 1A). São descritos o método de síntese e modificação química de nanopartículas e micropartículas. Uma solução de ligação, que acordos de princípios teóricos da precipitação do DNA (pH, força iônica e desidratação), é usada para avaliar a eluição e vinculação de DNA. PCR quantitativo é usado para avaliar a eficiência de eluição do DNA do representante nanopartículas e micropartículas (figura 1B). Granulometria, índice de polidispersividade e potencial zeta são importantes parâmetros que são usados para visualizar as alterações físico-químicas que ocorrem na superfície da partícula (Figura 1). É importante ressaltar sobre a caracterização química de superfície de partícula magnética. Enquanto esta etapa foi para além do âmbito do presente protocolo, várias técnicas modernas podem ser aplicadas para investigar a eficiência de modificações químicas. ^{11 , 12 , 13 , 14} a espectroscopia no infravermelho (FTIR) transformada de Fourier pode ser usada para avaliar o espectro infravermelho de superfície de partícula e compará-lo com o espectro de modificadores químicos livre. Espectroscopia de fotoelétron de raios x (XPS) é outra técnica que pode ser usada para identificar a composição elementar da superfície do material. Outros métodos eletroquímicos, microscópicos e espectroscópicos podem ser usados para lançar a luz sobre a qualidade da síntese de partículas. Este trabalho destaca uma nova perspectiva de análise de DNA-magnético interações de partículas via DLS.

Protocol

1. síntese de nanopartículas magnéticas

1. síntese de nanopartículas magnéticas estabilizado com citrato (MNPs)
   1. Adicionar 20 mmol de FeCl ₃ ∙ 6 H ₂ O (g 5,406) e 10 mmol de FeCl ₂ ∙ 4 H ₂ O (g 1,988) em 20 mL de água bidestilada venoso (água de ddd). Celeuma obtida solução vigorosamente no béquer sob atmosfera ₂ N, utilizando um agitador mecânico, até à obtenção de uma solução transparente.
   2. Sob agitação mecânica rápida, adicionar 150 mL de 1 M NH ₄ OH, gota a gota usando funil (tomar 1 h ou mais se necessário). Transferi a solução para um navio screwable depois todos NH ₄ OH é adicionado. Dane-se a solução de navio e calor a 75 ° C por 30 min.
      Cuidado: NH ₄ OH é classificado como corrosivo e perigoso para o ambiente.
      Nota: Preparar a solução de NH ₄ OH de alto grau 28% NH ₄ OH em água usando água pobre em oxigênio.
   3. Recolher o precipitado preto usando o ímã e lavagem usando 100 mL de água de ddd. Repeti 3 vezes. Adicione 50 mL de 0,5 M dihidrato de citrato tri-sódico para precipitar. Dane-se o navio.
      Nota: Usar solução venoso de dihidrato de citrato de sódio-tri.
   4. Re-dispersar o precipitado via sonication (35 kHz, amplitude de 100%) e vaso de calor a 80 ° C, durante 1 h.
      Nota: Um sonicador de alimentação suficiente é necessária.
   5. Deixe arrefecer o solução à temperatura ambiente. Recolher o precipitado usando um ímã e remover o sobrenadante. Re-dispersar lama negra em 50 mL de água ddd usando sonicador (35 kHz, amplitude de 100%).
   6. Transferir alíquotas (~ 25 mL) em tubos de centrífuga de 50 mL e adicionar 20 mL de acetona. Centrifugar a 2400 x g durante 10 minutos e remover os sobrenadantes.
   7. Re-dispersar precipitado e Dialize solução contra água utilizando dispositivo de diálise de corte baixo peso molecular (500-1.000 Da) de volume adequado para 24 h.
      Nota: Preparar o aparelho de diálise, de acordo com o fabricante ' requisitos de s.
2. Síntese de nanopartículas magnéticas modificadas com o polyethylenimine de cadeia ramificado (MNPs_PEI)
   1. Adicionar 2 mL de solução de MNPs obtida (~0.1 g/mL) para um copo de vidro. 38 ml de água do ddd e proceda à sonicação (35 kHz, amplitude de 100%) a suspensão (10 min).
   2. Sob agitação mecânica rápida, adicionar 10 mL de 10% ramificado o polyethylenimine (média de 25 kDa). Agitar a solução para posterior h. 3
   3. Coletar precipitar usando o ímã e remove o sobrenadante. Re-disperse o precipitado em 20 mL de água de ddd. Repita 5 vezes, em seguida, proceda à sonicação a suspensão final (35 kHz, amplitude de 100%).
3. Síntese de nanopartículas magnéticas partículas modificado com sílica (MNPs_TEOS)
   1. Adicionar 10 mL de solução de MNPs obtida (~0.1 g/mL) para um copo de vidro. Adicione 60 mL de água e 130 mL de etanol. Proceda à sonicação solução e adicione 6 mL de 28% NH ₄ OH.
   2. Sob agitação mecânica rápida, adicionar 1 mL de orthosilicate tetraetila. Agitar a solução para posterior h. 12
   3. Recolher precipitado preto usando o ímã e lavá-lo usando 50 mL de etanol (3 vezes) e 50 mL de água (3 vezes). Re-dispersar partículas em 10 mL de ddd de água e proceda à sonicação a suspensão (35 kHz, amplitude de 100%).
4. Síntese de nanopartículas magnéticas modificadas com grupos aminoácidos (MNPs_APTES)
   1. Adicionar 5 mL de solução de MNPs_TEOS obtida (~0.1 g/mL) para um copo de vidro. Adicione 45 mL de água e 50 mL de etanol. Proceda à sonicação solução (35 kHz, amplitude de 100%).
   2. Sob agitação mecânica rápida, adicionar 0,5 mL de triethoxysilane (3-aminopropil). Agitar a solução para posterior h. 3
   3. Recolher precipitado preto usando o ímã e lavá-lo usando 50 mL de etanol (3 vezes) e 50 mL de água (3 vezes). Re-dispersar partículas em 5 mL de ddd de água e proceda à sonicação a suspensão (35 kHz, amplitude de 100%).

2. Síntese de micropartículas magnéticas

1. síntese de micropartículas magnéticas estabilizado com citrato (MMPs)
   1. Adicionar 25 mL de 2m KNO ₃, 12,5 mL de 1m KOH e 205,875 mL de água ddd dentro de um vaso screwable. Adicione 6,675 mL de 1m Filipa ₄ durante agitação magnética. Navio de transferência imediatamente para um banho de água pré-aquecida (90 ° C) por 2 h.
      Nota: Preparar soluções KOH em ddd e KNO ₃ água.
   2. Deixe arrefecer o solução à temperatura ambiente. Recolha o precipitado preto usando o ímã e lavagem com 50 mL de água de ddd (5 vezes). Adicione 50 mL de 0,5 M dihidrato de citrato tri-sódico para precipitar. Dane-se o navio.
   3. Redisperse o precipitado via sonication (35 kHz, amplitude de 100%) e vaso de calor a 80 ° C para o precipitado de preto coletar 1 h., usando o ímã e lavagem com 50 mL de água de ddd (10 vezes).
   4. Modificar MMPs com o polyethylenimine de cadeia ramificado (MMPs_PEI), sílica (MMPs_TEOS) e grupos aminoácidos (MMPs_APTES), semelhantes ao protocolo MNPs. Consulte seções 2.2, 2.3 e 2.4, respectivamente, para mais detalhes.
2. Síntese de micropartículas magnéticas modificadas com o polyethylenimine de cadeia ramificado (MMPs_PEI)
   1. Adicionar 5 mL de solução de MMPs (~0.1 g/mL) para um copo de vidro. 38 ml de água do ddd e proceda à sonicação a solução (35 kHz, amplitude de 100%, 10 min). Sob agitação mecânica rápida Adicione 10 mL de 10% ramificado o polyethylenimine (média de 25 kDa). Agitar a solução para posterior h. 3
   2. Recolher precipitado usando um ímã e remover o sobrenadante. Redisperse precipitado em 20 mL de água bidestilada. Repita 5 vezes, em seguida, proceda à sonicação a solução final (35 kHz, amplitude de 100%).
3. Síntese de micropartículas magnéticas modificadas com sílica (MMPs_TEOS)
   1. Adicionar 5 mL de solução de MMPs (~0.1 g/mL) para um copo de vidro. Adicione 60 mL de água e 130 mL de etanol. Proceda à sonicação suspensão (35 kHz, amplitude de 100%) e adicione 6 mL de 28% NH ₄ OH.
   2. Sob agitação mecânica rápida, adicionar 1 mL de orthosilicate tetraetila. Agitar a solução para posterior h. 12
   3. Recolher precipitado preto usando um ímã e lavá-lo usando 50 mL de etanol (3 vezes) e 50 mL de água (3 vezes). Redisperse partículas em 5 mL de água ddd e proceda à sonicação a suspensão (35 kHz, amplitude de 100%).
4. Síntese de micropartículas magnéticas modificadas com grupos aminoácidos (MMPs_APTES)
   1. Adicionar 3 mL de solução de MMPs_TEOS (~0.1 g/mL) para um copo de vidro. Adicione 45 mL de água e 50 mL de etanol. Proceda à sonicação a suspensão (35 kHz, amplitude de 100%).
   2. Sob agitação mecânica rápida, adicionar 0,5 mL de triethoxysilane (3-aminopropil). Agitar a solução para posterior h. 3
   3. Recolher precipitado preto usando o ímã e lavá-lo usando 50 mL de etanol (3 vezes) e 50 mL de água (3 vez). Redisperse partículas em 3 mL de água ddd e proceda à sonicação a suspensão (35 kHz, amplitude de 100%).

3. Magnético das partículas tamanho análise usando DLS

1. tamanho de partícula em água
   1. uso um DLS instrumento que se aplica a um ângulo de detector de dispersão traseira (173 °) e um comprimento de onda do feixe de 633 nm.
      Nota: Dispersão traseira DLS é adequado para amostras concentradas onde múltiplo espalhamento pode ser evitado. Dispersão de lado (ângulo 90° do detector) e espalhamento frontal (15° de ângulo de detector) DLS são adequados para partículas menores e misturadas partículas, respectivamente.
   2. Prévio para medição de água, proceda à sonicação partículas de 3 min.
      Nota: Use uma solução diluída de partículas. Para este efeito, misture 9,6 µ l de partículas com 96 µ l de água.
   3. Cuidadosamente pipete 50 µ l de solução de partículas de látex de poliestireno cubetas e evitar a formação de bolhas.
      Nota: Para cada amostra, use cubeta descartável (ver tabela de materiais).
   4. Observe a clareza da cubeta e a direção do feixe de luz. Insira o celular no porta-amostras e fechar a câmara.
   5. Use os seguintes parâmetros para medição: temperatura: 25 ° C; índice de refração da fase dispersiva (ferro): 2.344; índice de refração do ambiente dispersivo (água): 1.333
      Nota: Realizar a medição do índice de refração usando um refratômetro para resultados mais precisos, especialmente quando o desenvolvimento de materiais de romance ou híbrido.

4. Preparação de DNA Stock, partículas magnéticas e Binding Buffer

1. estoque de DNA
   1. uso buffer de 10 mM Tris-HCL (pH = 8) para diluição e armazenamento de DNA. Use uma padrão de DNA que pode ser amplificada especificamente com um protocolo PCR direto no laboratório (consulte a seção 5.2 para configurações de reação e condições). Para amplificar a 498 pares de base (PB) do gene da xis de controle de bacteriófago λ, use os seguintes primers. Encaminhar a cartilha: 5 ' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Reverter a primeira demão: 5 ' - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 '
   2. produto PCR purificar através do kit de purificação de DNA comercial.
      Nota: Rendem de jogos comerciais usando o procedimento baseado em coluna de sílica > 100 ng / µ l purificado DNA.
   3. Medida de concentração de DNA utilizando o método espectrofotométrico (absorvância a 260 nm). Diluir o estoque de DNA de ¹¹ 10 cópias / µ l, conforme as instruções acima para soluções de trabalho de 10 ¹⁰, 10 ⁹, 10, ⁸ e 10 ⁷ cópias / µ l.
      Nota: O número de cópias do produto do PCR pode ser calculado de acordo com a seguinte equação, supondo que o peso molecular médio é de 650 Da cada BP:
      cópias de DNA / µ l = (quantidade em ng / µ l * 6.022x10 ²³ cópias/mol) / (498 bp * 650 g/mol de bp * 1 x 10 ⁹ ng/g)
2. partículas magnéticas
   1. permitem que as partículas de sedimentos sem o ímã e remover o sobrenadante. Misture 01:20 relação v/v das partículas magnéticas com água ddd (partículas: água).
      Nota: Abordagem baseada em Volume é usada para descrever as quantidades de partículas magnéticas, desde massas iguais de MNPs e MMPs eram prontamente difícil comparar.
3. Binding buffer de
   1. para a rápida preparação da solução de HCL de acetato de sódio 0,75 M (pH = 6), misturar 1 mL de acetato de sódio 3M com 3 mL de HCL de 1 mM.
      Nota: Todas as soluções utilizadas na ligação podem ser armazenadas em 4 ° C. Observe que baixa temperatura aumenta significativamente a ligação, particularmente no caso de solução de etanol. Controlar cuidadosamente a temperatura de soluções para melhor reprodutibilidade e precisão da despistagem.

5. Teste de eficiência de DNA isolamento usando PCR quantitativo

1. isolamento de DNA modificado MMPs ou MNPs
   1. usar uma placa de 96 poços e um ímã personalizado para placa de 96 poços para experimentos de pequeno volume.
   2. Usar a mistura de solução de ligação seguintes: 8 µ l modificado MMPs ou MNPs, 10 µ l de acetato de sódio-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µ l de 85% de etanol, 10 µ l de DNA (10 ¹⁰ cópias solução).
   3. Mix bem pipetando e coloque a placa sobre o ímã por 3 min. Enquanto a placa é o imã, remover a solução e adicionar 100 µ l de 85% de etanol para lavar.
   4. Remover etanol.
      Nota: Permitir que o etanol secar por alguns segundos, mas não deixe que as partículas excessivamente seco ou mostrar rachaduras. Se as partículas excessivamente seca eles serão difíceis de dissolver com solução de eluição.
   5. Remover a placa de ímã e adicionar 40 µ l de solução de eluição. Misture bem por pipetagem. Coloque a placa de volta sobre o ímã e coletar DNA eluted (~ 37 µ l). Armazenar o eluente a-20 º C até uma análise mais aprofundada.
2. PCR quantitativo
   1. usar os primers que foram usados para preparar o estoque DNA na etapa 4.1.1 quantificar cópias do gene xis, de acordo com o protocolo por Haddad et al. ¹⁰
   2. preparar a solução de mistura de mestre de acordo com a quantidade de amostras a serem testadas e, em seguida, distribua a mistura em cadeia da polimerase ou uma placa de 96 poços de fundo branco.
   3. Utilizar as seguintes quantidades para um volume total da mistura PCR 20 µ l: polymerase de 10 µ l / intercalante mistura de corante (ver tabela de materiais), 2 µ l da amostra DNA, 2 µ l para a frente da primeira demão (10 µM), 2 µ l inversa da primeira demão (10 µM)
   4. Configurar o thermocycler de acordo com o seguinte programa: 95 ° C por 120 s, 40 ciclos (95 ° C por 15 s, 64 ° C por 15 s, 68 ° C por 45 s), 68 ° C por 5 min.
   5. Usando triplica para padrões e amostras, calcular o limiar de ciclo e construir uma curva padrão para estimar o número de cópias de DNA obtida em cada amostra. O instrumento utilizado aqui isso executa automaticamente.
   6. Aqui, o número de cópias de DNA é estimado para o volume total de eluição (~ 40 µ l). Porcentagem de DNA obtida, correspondente à quantidade original adicionada à solução (totalmente 10 ¹¹ cópias) de vinculação pode variar além do intervalo de 0 a 100.

6. DLS usando vinculação de análise de DNA-magnético partículas

1. Ligação de DNA
   1. para grande volume de experimentos (em tubo de 1,5 mL), use a seguinte mistura de solução de vinculação: 96 µ l modificado MMPs ou MNPs, 120 µ l de acetato de sódio-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 µ l de 85% de etanol, 120 µ l de DNA (10 ¹⁰ cópias solução) ou 120 µ l-tampão Tris HCL (10 mM, pH = 8) para controle.
2. Análise de potencial zeta
   1. Prepare duas soluções de ligação com o DNA e outro com tampão Tris-HCL para controle conforme instruído na etapa 6.1.1. Para evitar a formação de bolhas, cuidadosamente Pipetar 800 µ l da mistura de ligação para um celular descartável.
      Nota: Use cubeta descartável para a medição de superfície zeta potencial (ver tabela de materiais).
3. Use os seguintes parâmetros para medição no instrumento DLS: Smoluchowski modelo com um F(ka) de 1.5, temperatura: 25 ° C, índice de refração da fase dispersiva (ferro): 2.344, índice de refração do ambiente dispersivo (água): 1.333.
   Nota: A taxa de interação de partículas magnéticas-DNA afeta diretamente a medição de repetições. Uma única medida pelo instrumento leva 60-70 s. Aqui, o instrumento foi instruído a tirar 10 medidas com 1 min intervalos de atraso. Para manter a simplicidade, o resultado será mostrado na tempo = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 18 min da primeira leitura.

Representative Results

Usando o protocolo descrito aqui por síntese química e modificação das partículas magnéticas, seis partículas magnéticas foram sintetizadas e analisadas para ligação de DNA. Um resumo da análise é mostrado na tabela 1. Comparando o tamanho de partícula em água e em solução de ligação, é claro que todas as partículas de agregado na solução de ligação por dobras 2-22. Algumas partículas mais agregados mais dobras na presença de DNA; no entanto isto não foi diretamente correlacionado com recuperação de DNA detectada por PCR quantitativo (tabela 1). Comparação do potencial zeta (10 medições em intervalos de ~ 2 min) de partículas em controles versus com DNA mostrou queda acentuada nos três partículas; ou seja: MNPs_APTES, MMPs_TEOS e MMPs_APTES (Figura 2). Tendências em zeta potencial ao longo do tempo também foram observadas, apresentando variações nas três primeiras leituras antes de eles são estabilizados na maioria dos casos (Figura 3). Variação após a exposição ao DNA observou-se principalmente no MMPs (Figura 2). Menor desvio padrão foi observado, omitindo as três primeiras leituras que representa primeiro 5 min após a exposição das partículas ao DNA (tabela 1).

No geral vista da análise do quadro 1 mostra as diferentes características de ligação de DNA-partícula como atribuída ao tamanho de partícula magnética e modificações químicas. Brevemente, nanopartículas MNPs_PEI tamanho aumentaram após ligação DNA por quatro dobras com nenhuma mudança significativa no índice de polidispersividade ou potencial zeta. No entanto, DNA não era recuperável neste procedimento. MNPs_TEOS nanopartículas tamanho aumentaram e diminuição no índice de polidispersividade com imperceptível mudança no potencial zeta após exposição de DNA, ainda eram as partículas melhores em suas taxas de recuperação em 20,3%. Nanopartículas de MNPs_APTES diminuíram ligeiramente em tamanho e visivelmente em zeta potencial após a exposição do DNA. Micropartículas de MMPs_PEI não mostrou mudança no tamanho após a exposição do DNA, no entanto eles aumento no índice de polidispersividade em diminuiu ligeiramente em potencial zeta. MMPs_TEOS micropartículas mostraram características tamanho alternativo para suas nanopartículas homólogos ou seja, MNPs_TEOS. Surpreendentemente, eles diminuíram visivelmente em potencial zeta, mas não além do intervalo exibido pelo MNPs_TEOS. MMPs_APTES aumentada em tamanho de partícula após exposição de DNA e também diminuiu em potencial zeta. É importante notar que tanto MNPs_APTES como MMPs_APTES retidos tamanhos similares após modificação química, apesar do fato de que eles foram feitos de diferentes tamanho de precursores. Eles também têm exibido semelhantes Propriedades de vinculação. MNPs_TEOS mostrou nenhuma mudança significativa no zeta potencial por seus valores estavam no extremo mais baixo detectado neste estudo.

Os valores de acompanhamento ao longo do tempo para potencial zeta mostrou estabilização após 5-10 min, particularmente no caso de MNPs (Figura 3A, 3C e 3E). Uma tendência contínua do potencial zeta foi encontrada em algumas leituras de MMPs (Figura 3B, 3D e 3F). Em alguns casos, as variações no potencial zeta correspondem a variações no tamanho de índice e partículas de polidispersividade mas não com a recuperação do DNA por eluição.

Figura 1: esquema de protocolo. (A) modificações químicas das partículas magnéticas, incluindo polyethyleneimine ramificada, sílica e grupos aminoácidos. (B) os passos de isolamento de DNA usando vinculação buffer e partículas magnéticas imobilizadas em ímã, seguido por PCR quantitativo. (C) análise de ligação do DNA-partícula usando DLS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: potencial Zeta das partículas magnéticas representativas na presença e na ausência de DNA. A exposição ao DNA causado diminuição visível do potencial zeta em MNPs_APTES, MMPs_TEOS e MMPs_APTES. Barras de erro representam o desvio padrão (N = 10). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: potencial Zeta das partículas magnéticas representativas ao longo do tempo, na presença e na ausência de DNA. Potencial zeta de partículas em solução de vinculação foi medida no tempo = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 18 min. lacuna entre as curvas de potencial zeta de controle vs com DNA são evidentes em casos de MMPs_TEOS, MNPs_APTES e MMPs_APTES. (A) potencial Zeta de MNPs_PEI é altamente positivo, indicando sem interações. (B) o potencial Zeta de MMPs_PEI diminuiu ao longo do tempo, sugerindo uma interação muito lenta entre partículas e DNA. (C) o potencial Zeta de MNPs_TEOS foi muito negativo na ausência e presença de DNA. (D) o potencial Zeta de MMPs_TEOS mostra valores mais baixos na presença de DNA quando comparados aos controles. (E) o potencial Zeta de MNPs_APTES mostra valores mais baixos na presença de DNA quando comparados aos controles. (F) o potencial Zeta de MMPs_APTES mostra valores mais baixos na presença de DNA quando comparados aos controles. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Características	MNPs_PEI	MNPs_TEOS	MNPs_APTES	MMPs_PEI	MMPs_TEOS	MMPs_APTES
Tamanho de partícula (nm)
na água	141,8	91,3	1106.4	825.0	1281.3	1281.3
em solução de vinculação	531.2	1990.1	3091.0	2669.0	2669.0	1990.1
em bindin

solução g com DNA 1990.1 3091.0 2669.0 2669.0 1990.1 4145.4 mudança observada aumentou aumentou aumentou Índice de polidispersividade na água 0,237 0,240 0.219 0.410 0,281 0,206 em solução de vinculação 0,225 0.773 0,090 0.107 0,374 0.397 em solução de ligação com o DNA 0,240 0.298 0,282 0.301 0,387 0.319 mudança observada diminuição da aumentou aumentou Zeta potencial (mV) * em solução de vinculação 42.29 -27.83 33.23 30.80 -6.86 -0.66 (±SD) 1.15 1.17 2.89 8,99 7.99 5.42 em solução de ligação com o DNA 41.81 -25.97 12,28 27,81 -23.67 -15.22 (±SD) 2.02 0,80 2.21 4.33 0,95 4.28 mudança observada diminuição da diminuição da diminuição da Recuperação de PCR quantitativo * Número de cópia de DNA Obtido 1.22E + 03 1.01E + 09 3.18E + 06 1.44E + 06 3.76E + 08 6.88E + 06 (±SD) 8.05E + 02 7.55E + 07 2.83E + 06 1.98E + 06 1.08E + 08 3.33E + 06 Percentual de recuperação do DNA 0.0 20.3 0.1 0.0 7.5 0.1 (±SD) 0.0 1.5 0.1 0.0 2.2 0.1 * Apenas estável medições após 5 minutos de ligação são mostrados (N = 7). * * R² = 0.940 para triplica de normas.

Tabela 1: caracterização das partículas magnéticas representativas e suas habilidades para vincular e recuperar o DNA. Após a exposição à solução de vinculação, todas as partículas mostraram agregação (aumento de tamanho de partícula). Quando o DNA estava presente na solução de vinculação, aumento de tamanho de partícula foi visível em MNPs_PEI, MNPs_TEOS e MMPs_APTES. As partículas eram sistemas polydisperse em solução, particularmente MNPs_TEOS, que se tornou menos polydispersed a ligação do DNA de ligação. MNPs_APTES mostrou aumento no índice de polidispersividade e diminuição de zeta potencial após a exposição ao DNA. MMPs_TEOS e MMPs_APTES mostraram grande diminuição de zeta potencial após a exposição ao DNA. MNPs_TEOS e MMPs_TEOS apresentaram as maiores taxas de recuperação do DNA de 20,3% e 7,5%, respectivamente, como mostrado por PCR quantitativo. MNPs_APTES e MMPs_APTES mostraram taxas de recuperação de DNA de 0,1%.

Discussion

Neste protocolo, os princípios teóricos que explicam o emperramento do ADN para partículas magnéticas através de potencial zeta foram em questão. O protocolo descreve a síntese e modificação de nanopartículas magnéticas e micropartículas. Método para a preparação da solução de controle e vinculação de DNA também são descritos. Duas estratégias são mostradas aqui para triagem de interações DNA-partícula: PCR quantitativo e DLS se aproxima. DLS fornece três indicadores de alterações físico-químicas em partículas: granulometria, índice de polidispersividade e potencial zeta. Alterações de tamanho de partícula indicam diretamente a agregação ou desintegração. Valor do índice de polidispersividade descreve a distribuição das espécies de partícula no sistema variando de monodispersas (índice < 0,05) para altamente polydispersed (índice > 0.7). Potencial zeta pode classificar as partículas de acordo com a carga de superfície onde partículas altamente positivas mostram valores superiores a 30 mV e partículas altamente negativas apresentem valores inferior a -30 mV. Como previsto, o potencial zeta das partículas magnéticas polycharged na vinculação solução relativamente diminuiu quando as partículas foram expostas ao DNA. A exceção a essa regra é MNPs_TEOS. Essas partículas só diferem em que possuem uma única carga de superfície altamente negativa (Figura 2). Isto sugere que a força iônica desempenhou um papel importante na retenção de partículas, DNA e íons positivos juntos. Por outro lado, as alterações no tamanho de partícula podem indicar o papel de precipitação/agregação de DNA-partículas durante o processo de ligação, particularmente na presença de mais de DNA.

Durante a síntese de partículas magnéticas e as modificações químicas, existem vários passos críticos que requerem atenção: em primeiro lugar, a reprodutibilidade do método de síntese depende grandemente as quantidades precisas de precursores químicos utilizados na síntese bem como boa agitação e oportuna controlada adição de NH₄OH. Para adquirir uma população homogeneizada das partículas (de tamanho semelhante, forma, densidade e composição), é importante seguir sonication e agitação passos cuidadosamente quando instruído. Em segundo lugar, em muitos casos realistas as modificações químicas não prever a realidade do que está na superfície das partículas magnéticas. Um passo de caracterização detalhada é necessário para confirmar a composição química da superfície da partícula, conforme descrito na seção Introdução. Entre as técnicas usadas, os pesquisadores dependem de FTIR, XPS, electroquímica, espectroscopia, bem como DLS.

Além disso, várias etapas críticas são necessárias durante a análise e medidas de DLS: em primeiro lugar, a escolha da solução de vinculação afeta várias etapas, incluindo a compatibilidade química com partículas e DNA e também Propriedades espectrais. Escolha de índices de refração da solução e a partícula material obrigatório pode ser baseada em estudos anteriores ou avaliada por refratometria. Em segundo lugar, as interações entre as partículas e os eléctrodos nas cubetas devem ser cuidadosamente monitoradas como processo de oxidação/redução pode afetar a medição. Em terceiro lugar, como mostrado na Figura 3, a taxa de ligação pode ser uma função do tempo. É fundamental observar a estabilidade da interação, e isto é uma grande vantagem para o aplicativo de DLS em tais estudos. Aqui, o observador está monitorando a agregação de partículas e alterações físico-químicas em tempo real. Em quarto lugar, polidispersividade do sistema pode definir limitações ao escopo de análise. Valor do índice de polidispersividade abaixo de 0.05 descreve um sistema monodispersas enquanto valores acima de 0,7 descrevem um sistema de polydispersed de vários tamanhos de partículas. O tamanho das partículas e a distribuição de partículas diversas espécies podem ser estudadas usando vários tipos de DLS, incluindo dispersão traseira, lado-espalharam e dispersaram para a frente, conforme mencionado na seção 3.1 de protocolo. Finalmente, sonication de partículas antes do teste obviamente pode afetar suas propriedades físicas (por exemplo, tamanho e área de superfície), e se feito excessivamente pode causar a liberação de algumas modificações químicas.

Neste protocolo, informações adquiridas via DLS são comparadas com dados adquiridos por PCR quantitativo, também conhecido como real-time PCR. O último é o padrão ouro para detecção e quantificação de DNA. ¹⁵ a técnica PCR é amplamente utilizada em laboratórios, hospitais e universidades. No entanto, quando o teste de exposição do DNA a novela e materiais sintetizados é importante para a química do PCR em consideração. Enzima polimerase, o elemento-chave de cadeia da polimerase, é sensível a determinados químicos inibidores e intensificadores. Adição de controles internos, testes dos materiais sintéticos e de boas práticas de laboratório podem ajudar a reduzir vieses nos resultados PCR. Mecanismos de ação de inibidores e realçadores variam entre produtos químicos que se ligam diretamente a polimerase e outros que quelato íons de Mg^{2 +}-polimerase dependente em solução. Alguns insights sobre a isolação do ADN são difíceis de obter usando o rastreio de PCR. DLS pode mostrar casos quando DNA vincula-se a partículas mas prefiro está lavado ou não eluir (não detectado por PCR de DNA). Por exemplo, tanto MNPs_APTES como MMPs_APTES mostrou significativa diminuição de zeta potencial após a exposição de DNA (tabela 1), mas o DNA detectado em eluição não se correlacionam com estes resultados. É possível modificar a ligação, lavagem, soluções de eluição para controlar a liberação de DNA de partículas. DLS é um método relativamente mais rápido para a avaliação de interações DNA-partícula. A estabilidade e a taxa de interação podem também ser observados por esse método (Figura 3), que pode afetar o tempo usado em partículas magnéticas - com base em protocolos de isolamento do DNA.

Os desafios para o uso de DLS em análise são para a frente. Esta técnica requer um volume relativamente grande de amostra para análise (~ 1 mL) em relação ao PCR. Alguns parâmetros como índices de refracção requerem cuidadosa avaliação quando usando novas soluções nas amostras. Além disso, é muito comum observar reações de oxidação/redução nos elétrodos de cubetas, ao testar o novo material. Cuidadosa avaliação e conhecimento da composição química da amostra podem ajudar a avaliar a viabilidade de re-utilizar a mesma cubeta. Vale ressaltar que DLS análise é limitada para a especificidade e a sensibilidade fornecido pelo PCR, ainda fornece um tipo diferente de visão para o processo de ligação de DNA-partícula.

Como todas as técnicas espectroscópicas, modificações e solução de problemas de DLS aponta para o desenvolvimento de medidas mais precisas e sensíveis. Isto pode ser conseguido, fornecendo o melhor entendimento da natureza do material testado fisicamente e quimicamente. Em outras palavras, propriedades óticas e detalhes de composição química são a chave para obter dados precisos e sensíveis de DLS. Propriedades ópticas podem ser adquiridas por refratometria, enquanto a composição química das partículas / superfície das partículas pode ser estudado por várias técnicas como FTIR, XPS, eletroquímica e outros métodos espectroscópicos. Neste protocolo, solução de ligação pode ser melhorada usando vários pontos fortes iônicos, outros agentes de desidratação (por exemplo, isopropanol), vários pH e temperaturas baixas. Por outro lado, as modificações químicas da superfície da partícula são deixadas à imaginação dos químicos.

O desenvolvimento de materiais para isolamento do DNA continuará a aumentar nas próximas décadas com mais foco em especificidade, pureza e limite de detecção. A qualidade dos métodos de extração desempenha papel importante em estudos de escala única célula, metagenomic balanças e amostras de origens incomuns. Neste momento, é importante realizar a análise DLS de nanopartículas e micropartículas modificadas com vários tipos de materiais. Esta etapa é necessária antes de estabelecer um modelo teórico forte que descreve o comportamento de interações DNA-partícula.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	207926	Magnetic particle synthesis
Iron(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	380024	Magnetic particle synthesis
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8263	Magnetic particle synthesis
Acetone	Penta	10060-11000	Magnetic particle synthesis
Sodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	W302600	Magnetic particle synthesis
Tetraethyl orthosilicate	Sigma-Aldrich	131903	Magnetic particle synthesis
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140	Magnetic particle synthesis
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000	Sigma-Aldrich	408727	Magnetic particle synthesis
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228-M	Magnetic particle synthesis
Ethanol	Penta	71250-11000	Magnetic particle synthesis
Potassium nitrate	Sigma-Aldrich	P6083	Magnetic particle synthesis
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1.05012	Magnetic particle synthesis
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)	Spectrum labs	G235063	Magnetic particle synthesis
Overhead Stirrer	witeg Labortechnik GmbH	DH.WOS01035	Magnetic particle synthesis
Waterbath	Memmert GmbH + Co.	84198998	Magnetic particle synthesis
Sonicator	Bandelin	795	Magnetic particle synthesis
BRAND UV cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759200-100EA	Cuvette for size measurement
BRAND cap for UV-cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759240-100EA	Cuvette caps for size measurement
Folded Capillary Zeta Cell	Malvern	DTS1070	Cuvette for zeta potential measurement
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	Device for measurement of size and zeta potential
Infinite 200 PRO NanoQuant instrument	Tecan	396 227 V1.0, 04-2010	device for measurement of DNA concentration
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit	Sigma-Aldrich	QR0100	PCR kit
Mastercycler pro S instrument	Eppendorf	6325 000.013	Thermocycler
MinElute kit	Qiagen	28004	DNA purification kit
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S7670	DNA binding