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Chemistry

Partícula magnética de ADN vinculante el análisis por la dispersión ligera dinámica y electroforética

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56815
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, 2Central European Institute of Technology, Brno University of Technology

Summary

Este protocolo describe la síntesis de partículas magnéticas y evaluación de sus propiedades de unión al ADN mediante dispersión de luz dinámica y electroforética. Este método se centra en monitorear los cambios en el tamaño de las partículas, su polidispersidad y potencial zeta de superficie de la partícula que juegan importante papel en el atascamiento de materiales como el ADN.

Abstract

Aislamiento de ADN utilizando partículas magnéticas es un campo de gran importancia en la investigación de biotecnología y biología molecular. Este protocolo describe la evaluación de las partículas magnéticas de DNA de enlace vía dispersión ligera dinámica (DLS) y dispersión de la luz electroforética (ELS). Análisis por DLS ofrece valiosa información sobre las propiedades fisicoquímicas de las partículas incluyendo tamaño de partícula, polidispersidad y potencial zeta. Este último describe la carga superficial de la partícula que juega papel importante en la Unión electrostática de materiales como el ADN. Aquí, un análisis comparativo explota tres modificaciones químicas de nanopartículas y micropartículas y sus efectos sobre la Unión de ADN y elución. Modificaciones químicas por ramificaron polietilenimina, Tetraetilo ortosilicato y (3-aminopropil) trietoxisilano son investigados. Puesto que el ADN exhibe una carga negativa, se espera que potencial zeta de superficie de la partícula disminuye al atascamiento de la DNA. Formación de clusters debe afectar también a tamaño de partícula. Para investigar la eficacia de estas partículas en el aislamiento y la elución de la DNA, las partículas se mezclan con el ADN en pH bajo (~ 6), la alta fuerza iónica y el ambiente de la deshidratación. Se lavan las partículas de imán y luego ADN es eluido por tampón Tris-HCl (pH = 8). Número de copias de ADN se estima usando la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (PCR). Tamaño de partícula, potencial zeta y datos cuantitativos de PCR, polidispersidad se evaluó y se comparó. DLS es una perspicaz y método de análisis que agrega una nueva perspectiva para el proceso de proyección de partículas de ADN de apoyo.

Introduction

Extracción de ADN es uno de los pasos más esenciales en biología molecular. El desarrollo de métodos de extracción de ácidos nucleicos tiene gran impacto en los campos emergentes de la genómica, la metagenómica, la epigenética y la transcriptómica. Hay una amplia gama de aplicaciones biotecnológicas para el aislamiento de la DNA incluyendo médicos (herramientas forenses y diagnóstico y pronóstico) y aplicaciones medioambientales (diversidad biológica de la metagenómica, prevalencia del patógeno y vigilancia). Ha habido una creciente demanda para purificar y aislar ADN de diversos materiales y en diferentes escalas como sangre, orina, tierra, madera y otros tipos de muestras. 1 , 2 , 3 , 4

Partículas de tamaño nano y micro son convenientes para el aislamiento de ADN debido a su alta área superficial y, en particular cuando puede ser inmovilizados por un campo magnético. Propiedades fisicoquímicas de las partículas, tales como tamaño o carga, pueden influir mucho su capacidad objetivo biomoléculas. 5 para mejorar aún más la Unión de biomoléculas y estabilizar las partículas, se pueden utilizar diferentes modificaciones químicas (capas superficiales). Las muchas estrategias diferentes para el atascamiento se clasifican según las interacciones covalentes y no covalentes. 6 el tamaño de las partículas afecta directamente a sus propiedades de magnetización, considerando que la composición de partículas puede ser adaptado por la incorporación de metal, aleación u otros materiales que pueden influir en su densidad, porosidad y superficie. 7 hay no hay manera confiable para medir la carga superficial de las partículas pequeñas. En cambio, se puede medir potencial eléctrico en el plano de deslizamiento (lejos de superficie de nanopartículas). 8 este valor se llama zeta potencial y es una potente herramienta que se utiliza generalmente para la evaluación de estabilidad de nano y micropartículas por DLS. 9 puesto que su valor depende no sólo el pH y fuerza iónica del medio dispersivo, sino también en las características superficiales de las partículas, puede también probar los cambios en esta superficie causado por la interacción entre el partículas y moléculas de interés. 10

Por otra parte, estructura del ADN en condiciones deshidratado (forma A-ADN) exposiciones conformaciones compactada que facilitan su precipitación (agregación) en comparación a comúnmente ocurriendo forma de B-DNA. Electrostática (iónico y el enlace H) son las principales fuerzas controlando el atascamiento de la DNA a otros materiales debido a su accesible sterically fosfato y nitrógeno bases (sobre todo guanina). 7 , 10

En este trabajo se analizan tres modificaciones químicas representativas de nanopartículas magnéticas y micropartículas (figura 1A). Se describen el método de síntesis y modificación química de nanopartículas y micropartículas. Una solución vinculante, acuerdos de principios teóricos de la precipitación de ADN (pH, fuerza iónica y deshidratación) se utiliza para evaluar la elución y atascamiento de la DNA. PCR cuantitativa se utiliza para evaluar la eficacia de la elución de la DNA de la representante de nanopartículas y micropartículas (figura 1B). Granulometría, índice de polidispersidad y potencial zeta son parámetros importantes que se utilizan para visualizar los cambios fisicoquímicos que ocurren en la superficie de la partícula (figura 1). Es importante destacar en la caracterización química de la superficie de la partícula magnética. Mientras que este paso era más allá del alcance de este protocolo, pueden aplicarse varias técnicas modernas para investigar la eficacia de modificaciones químicas. 11 , 12 , 13 , 14 espectroscopia de infrarrojo de transformación de Fourier (FTIR) puede utilizarse para evaluar el espectro infrarrojo de la superficie de la partícula y se compara con el espectro de modificadores químicos gratis. Espectroscopía de fotoelectrones de rayos x (XPS) es otra técnica que puede utilizarse para identificar la composición elemental de la superficie del material. Pueden utilizar otros métodos electroquímicos, microscópicas y espectroscópicas para arrojar luz sobre la calidad de síntesis de partículas. Este trabajo pone de relieve una nueva perspectiva para el análisis de ADN magnético interacciones de partículas a través de DLS.

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Protocol

1. síntesis de nanopartículas magnéticas

  1. síntesis de nanopartículas magnéticas estabilizan con citrato (MNPs)
    1. Añadir 20 mmol de FECLAS 3 ∙ 6 H 2 O (5,406 g) y 10 mmol de FECLAS 2 ∙ 4 H 2 O (1,988 g) en 20 mL de agua bidestilada desoxigenada (agua de ddd). Revuelva obtenida la solución vigorosamente en vaso bajo atmósfera de N 2 con un agitador mecánico hasta obtener una solución transparente.
    2. Bajo agitación mecánica rápida, añadir 150 mL de 1 M NH 4 OH, gota a gota con embudo (tomar 1 h o más si es necesario). Transferir la solución en un vaso screwable después de agregar todos los NH 4 OH. Tornillo de la solución del recipiente y el calor a 75 ° C durante 30 minutos
      PRECAUCIÓN: NH 4 OH está clasificado como corrosivo y peligroso para el medio ambiente.
      Nota: Preparar NH 4 OH solución de alto grado 28% NH 4 OH en agua usando agua desoxigenada.
    3. Recoger el precipitado negro con imán y lavado con 100 mL de agua de ddd. Repita 3 veces. Añadir 50 mL de 0,5 M tri-sodio citrato dihidrato para precipitar. Tornillo de la nave.
      Nota: Utilizar solución desoxigenada de tri-sodio citrato dihidrato.
    4. Volver a dispersar el precipitado mediante sonicación (35 kHz, amplitud del 100%) y un recipiente de calor a 80 ° C por 1 h.
      Nota: Es necesario un sonicador de suficiente potencia.
    5. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Recoger el precipitado usando un imán y eliminar el sobrenadante. Volver a dispersar a barro negro en 50 mL de agua de ddd con sonicador (35 Hz, amplitud de 100%).
    6. Transferir alícuotas (~ 25 mL) en tubos de centrífuga de 50 mL y agregar 20 mL de acetona. Centrifugue a 2400 x g durante 10 min y retirar el sobrenadante.
    7. Volver a dispersar precipitado y dializo solución contra agua con dispositivo de diálisis de corte de bajo peso molecular (500-1.000 Da) de volumen adecuado para 24 h.
      Nota: Prepare el dispositivo de diálisis según fabricante ' requisitos de s.
  2. Síntesis de nanopartículas magnéticas modificadas con polietilenimina ramificado (MNPs_PEI)
    1. añadir 2 mL de la solución obtenida de MNPs (~0.1 g/mL) en un vaso de vidrio. Añadir 38 mL de agua de ddd y someter a ultrasonidos (35 Hz, amplitud de 100%) la suspensión (10 min).
    2. Bajo agitación mecánica rápida, añadir 10 mL de 10% ramificado polietilenimina (promedio 25 kDa). Agitar la solución para posteriores 3 h
    3. Recoger precipita con imán y eliminar el sobrenadante. Volver a dispersar precipitado en 20 mL de agua de ddd. Repita 5 veces y luego someter a ultrasonidos la suspensión final (35 Hz, amplitud de 100%).
  3. Síntesis de nanopartículas magnéticas de partículas modificación con silicona (MNPs_TEOS)
    1. añadir 10 mL de la solución obtenida de MNPs (~0.1 g/mL) en un vaso de vidrio. Añadir 60 mL de agua y 130 mL de etanol. Someter a ultrasonidos solución y agregar 6 mL de 28% NH 4 OH.
    2. Bajo agitación mecánica rápida, añadir 1 mL de Tetraetilo ortosilicato. Agitar la solución para la posterior h. 12
    3. Recoger el precipitado negro con imán y lave con 50 mL de etanol (3 veces) y 50 mL de agua (3 veces). Volver a dispersar las partículas en 10 mL de ddd de agua y someter a ultrasonidos la suspensión (35 Hz, amplitud de 100%).
  4. Síntesis de nanopartículas magnéticas, modificadas con grupos amino (MNPs_APTES)
    1. añadir 5 mL de la solución obtenida de MNPs_TEOS (~0.1 g/mL) en un vaso de vidrio. Agregar 45 mL de agua y 50 mL de etanol. Someter a ultrasonidos solución (35 Hz, amplitud de 100%).
    2. Bajo agitación mecánica rápida, Añadir 0,5 mL de trietoxisilano (3-aminopropil). Agitar la solución para posteriores 3 h
    3. Recoger el precipitado negro con imán y lave con 50 mL de etanol (3 veces) y 50 mL de agua (3 veces). Volver a dispersar las partículas en 5 mL de ddd de agua y someter a ultrasonidos la suspensión (35 Hz, amplitud de 100%).

2. Síntesis de micropartículas magnéticas

  1. síntesis de micropartículas magnéticas estabilizan con citrato (MMPs)
    1. añadir 25 mL de 2 M 3 de KNO, 12,5 mL de 1 M de KOH y 205,875 mL de ddd agua en un vaso screwable. Añadir 6,675 mL de 1 M de FeSO 4 durante la agitación magnética. Inmediatamente transferencia buque a un baño de agua precalentada (90 ° C) durante 2 h.
      Nota: Preparar soluciones KOH en ddd y KNO 3 agua.
    2. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Recoger el precipitado negro con imán y lavado con 50 mL de agua de ddd (5 veces). Añadir 50 mL de 0,5 M tri-sodio citrato dihidrato para precipitar. Tornillo de la nave.
    3. Redisperse el precipitado mediante sonicación (35 kHz, amplitud del 100%) y un recipiente de calor a 80 ° C para precipitado negro recoge 1 h. con imán y lavado con 50 mL de agua de ddd (10 veces).
    4. Modificar MMP con polietilenimina ramificado (MMPs_PEI), sílice (MMPs_TEOS) y grupos amino (MMPs_APTES) similares al Protocolo de MNPs. Consulte las secciones 2.2, 2.3 y 2.4, respectivamente para más detalles.
  2. Síntesis de micropartículas magnéticas modificadas con polietilenimina ramificado (MMPs_PEI)
    1. añadir 5 mL de solución de MMPs (~0.1 g/mL) en un vaso de vidrio. Añadir 38 mL de agua de ddd y someter a ultrasonidos la solución (35 Hz, amplitud del 100%, 10 min). Bajo agitación mecánica rápida agregar 10 mL de 10% ramificado polietilenimina (promedio 25 kDa). Agitar la solución para posteriores 3 h
    2. Recoger el precipitado usando un imán y eliminar el sobrenadante. Redisperse precipitado 20 ml de agua bidestilada. Repita 5 veces y luego someter a ultrasonidos la solución final (35 Hz, amplitud de 100%).
  3. Síntesis de micropartículas magnéticas modificada con silicona (MMPs_TEOS)
    1. añadir 5 mL de solución de MMPs (~0.1 g/mL) en un vaso de vidrio. Añadir 60 mL de agua y 130 mL de etanol. Someter a ultrasonidos suspensión (35 Hz, amplitud de 100%) y añadir 6 mL de 28% NH 4 OH.
    2. Bajo agitación mecánica rápida, añadir 1 mL de Tetraetilo ortosilicato. Agitar la solución para la posterior h. 12
    3. Recoger el precipitado negro usando un imán y lave con 50 mL de etanol (3 veces) y 50 mL de agua (3 veces). Redisperse partículas en 5 mL de agua de ddd y someter a ultrasonidos la suspensión (35 Hz, amplitud de 100%).
  4. Síntesis de micropartículas magnéticas modificado con grupos amino (MMPs_APTES)
    1. añadir 3 mL de solución de MMPs_TEOS (~0.1 g/mL) en un vaso de vidrio. Agregar 45 mL de agua y 50 mL de etanol. Someter a ultrasonidos la suspensión (35 Hz, amplitud de 100%).
    2. Bajo agitación mecánica rápida, Añadir 0,5 mL de trietoxisilano (3-aminopropil). Agitar la solución para posteriores 3 h
    3. Recoger el precipitado negro con imán y lave con 50 mL de etanol (3 veces) y 50 mL de agua (tiempo 3). Redisperse partículas en 3 mL de agua de ddd y someter a ultrasonidos la suspensión (35 Hz, amplitud de 100%).

3. Magnética partícula tamaño análisis utilizando DLS

  1. tamaño de partícula en agua
    1. uso un DLS instrumento que se aplica un posterior dispersión detector de ángulo (173 °) y una longitud de onda del haz de 633 nm.
      Nota: Back scattering DLS es adecuado para muestras concentradas donde puede evitarse la dispersión múltiple. Dispersión lateral (ángulo 90° de detector) y dispersión hacia delante (15° de ángulo del detector) DLS son convenientes para las partículas más pequeñas y mezcladas partículas, respectivamente.
    2. Previo a la medición en el agua, someter a ultrasonidos partículas por 3 minutos
      Nota: Utilizar una solución diluida de las partículas. Para ello, mezcla 9,6 μl de partículas con 96 μl de agua.
    3. Cuidadosamente pipetee 50 μl de solución de la partícula en látex poliestireno cubetas y evitar formación de burbujas de.
      Nota: Para cada muestra usar cubeta desechable (véase la tabla de materiales).
    4. En cuenta la claridad de la cubeta y la dirección del haz de luz. Insertar la celda en el porta muestra y cerrar la cámara de.
    5. Utiliza los siguientes parámetros de medición: temperatura: 25 ° C, índice de refracción de la fase dispersa (hierro): 2.344; índice de refracción del medio dispersivo (agua): 1,333
      Nota: Realizar la medida del índice de refracción utilizando un refractómetro para obtener resultados más precisos, especialmente cuando el desarrollo de materiales de la novela o el híbrido.

4. Preparación de Stock de ADN, partículas magnéticas y tampón de Binding

  1. stock de ADN
    1. uso tampón de 10 mM Tris-HCL (pH = 8) para la dilución y almacenamiento de ADN. Utilizar una muestra de ADN estándar que puede ser amplificada específicamente con un protocolo PCR directo en el laboratorio (consulte la sección 5.2 para las condiciones y parámetros de reacción). Para amplificar 498 par base (bp) del gene de xis de control de bacteriófago λ, utilice los siguientes iniciadores. Adelante la cartilla: 5 ' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Revertir la cartilla: 5 ' - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 '
    2. producto de PCR de purificar mediante kit de purificación de ADN comercial.
      Nota: Producción de kits comerciales mediante procedimiento basado en la columna de sílice > purificado de 100 ng/μl ADN.
    3. Medida de concentración de ADN mediante el método espectrofotométrico (absorbancia a 260 nm). Diluir el stock de ADN de 10 11 copias/μl como se indica arriba a soluciones de trabajo de 10 10 10 9 10 8 y 10 7 copias/μl.
      Nota: El número de copias del producto de PCR se puede calcular según la siguiente ecuación, asumiendo el peso molecular promedio es de 650 Da para cada bp:
      copias/μl de ADN = (cantidad en ng/μl * 6.022x10 23 copias/mol) / (498 bp * 650 g/mol de bp * 1 x 10 9 ng/g)
  2. partículas magnéticas
    1. permite las partículas de sedimento sin el imán y eliminar el sobrenadante. Mezcla de 1:20 ratio v/v de partículas magnéticas con ddd agua (partículas: agua).
      Nota: Enfoque basado en el volumen se utiliza para describir cantidades de partículas magnéticas, ya que eran fácilmente difíciles comparar masas iguales de MNPs y MMPs.
  3. Binding buffer
    1. para la preparación rápida de solución de HCL de acetato de sodio de 0.75 M (pH = 6), mezclar 1 mL de acetato de sodio de 3 M con 3 mL de ácido clorhídrico de 1 mM.
      Nota: Todas las soluciones utilizadas en encuadernación pueden almacenarse a 4 ° C. Nota que baja temperatura aumenta significativamente la Unión particular en el caso de solución de etanol. Controlar la temperatura de las soluciones para la mejor reproducibilidad y exactitud de la detección.

5. Pruebas de eficiencia de ADN aislamiento utilizando PCR cuantitativa

  1. aislamiento de ADN modificado MMPs o MNPs
    1. utilizar una placa de 96 pocillos y un imán personalizado para placa de 96 pocillos para experimentos de pequeño volumen.
    2. Use el siguiente enlace solución mezcla: 8 μl modificado MMPs o MNPs, 10 μl sodio acetato-HCl (0.75 M, pH = 6), 60 μL de etanol al 85%, 10 μl de DNA (solución de copias de 10 10).
    3. Mezcla bien mediante pipeteo y coloca la placa sobre el imán durante 3 minutos. Mientras que la placa está en el imán, retirar la solución y añadir 100 μl de etanol al 85% para el lavado.
    4. Quitar etanol.
      Nota: Deje que el etanol se seque durante unos segundos pero no deje que las partículas demasiado seco o mostrar grietas. Si las partículas se secan demasiado será difíciles de disolver con solución de elución.
    5. Extraiga la placa del imán y agregar 40 μl de solución de elución. Mezclar por pipeteo. Coloque la placa en el imán y recoger ADN eluída (~ 37 μL). Almacenar eluyente a-20 ° C hasta análisis.
  2. PCR cuantitativa
    1. utilizar los iniciadores que se utilizaron para preparar stock ADN en el paso 4.1.1 cuantificar copias del gen xis, según el Protocolo por Haddad et al. 10
    2. mix master la solución según la cantidad de muestras a ensayar, a continuación, distribuir la mezcla en tubos PCR o una placa de 96 pocillos de fondo blanco.
    3. Utilizar las siguientes cantidades para un volumen total de la mezcla PCR de 20 μl: 10 polimerasa μl / intercalando mezcla de tinte (véase tabla de materiales), 2 μl de muestra de ADN, primer avance 2 μl (10 μm), primer revés de 2 μl (10 μm)
    4. Configurar el termociclador según el siguiente programa: 95 ° C por 120 s, 40 ciclos (95 ° C por 15 s, 64 ° C por 15 s, 68 ° C por 45 s), 68 ° C por 5 min
    5. Triplicado usando estándares y muestras, calcular el umbral de ciclo y construir una curva estándar para estimar el número de copias de ADN obtenido en cada muestra. El instrumento utilizado aquí realiza esto automáticamente.
    6. , El número de copias de ADN se estima para el volumen de elución total (~ 40 μL). Porcentaje de ADN obtenido corresponde a la cantidad original añadida obligatorio solución (totalmente 10 11 copias) puede variar más allá del intervalo de 0 a 100.

6. Utilizando DLS de obligatorio análisis de ADN magnético partículas

experimentos
  1. Atascamiento de la DNA
    1. de gran volumen (en tubo de 1,5 mL), utilizar la siguiente mezcla de solución vinculante: 96 μl modificado MMPs o MNPs, 120 μl sodio acetato-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 μl de etanol al 85%, 120 μl ADN (solución de copias de 10 10) o 120 μl de tampón Tris-HCL (10 mM, pH = 8) para el control de.
  2. Análisis de potenciales zeta
    1. Prepare dos soluciones de enlace, uno con el ADN y otro con tampón Tris-HCL para control como se indica en el paso 6.1.1. Para evitar formación de burbujas, cuidadosamente pipetear 800 μl de la mezcla obligatoria en una celda disponible.
      Nota: Use cubeta desechable para medición de potencial zeta superficial (véase la tabla de materiales).
  3. Utilice los siguientes parámetros para la medición en el instrumento DLS: modelo de Smoluchowski con una F(ka) de 1.5, temperatura: 25 ° C, índice de refracción de la fase dispersa (hierro): 2.344, índice de refracción del medio dispersivo (agua): 1,333.
    Nota: La tasa de interacción partícula magnética de ADN afecta directamente a la medición de repeticiones. Una sola medición en el instrumento toma s 60-70. Aquí, el instrumento se le ordenó tomar 10 medidas con 1 min de intervalos de retardo. Para simplificar, los resultados se mostrarán en tiempo = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 minutos de la primera lectura.

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Representative Results

Utilizando el protocolo descrito aquí para síntesis química y la modificación de las partículas magnéticas, seis partículas magnéticas se sintetiza y se analizaron para el atascamiento de la DNA. Un resumen del análisis se muestra en la tabla 1. Comparando el tamaño de las partículas en el agua y en la solución de Unión, es claro que todas las partículas de agregaron en enlace solución por pliegues 2-22. Algunas partículas más agregan a más pliegues en la presencia de ADN; sin embargo esto no fue directamente relacionado con la recuperación del ADN detectado por PCR cuantitativo (tabla 1). Comparación del potencial de zeta (10 mediciones en intervalos de 2 min) de partículas en comparación con los controles con ADN demostrada marcada caída de tres partículas; a saber: MNPs_APTES, MMPs_TEOS y MMPs_APTES (figura 2). También se observaron tendencias en zeta potencial con el tiempo, mostrando las variaciones en las primeras tres lecturas antes de que se estabilizan en la mayoría de los casos (figura 3). Sobre todo se observó variación después de la exposición al ADN de MMPs (figura 2). Desviación estándar inferior fue observada por omitir las tres primeras lecturas representando primero 5 min después de la exposición de partículas al ADN (tabla 1).

En general, vista de los análisis en la tabla 1 muestra las diferentes características de enlace de ADN-partícula como al tamaño de la partícula magnética y modificaciones químicas. Brevemente, las nanopartículas de MNPs_PEI aumentaron de tamaño después de atar la DNA de cuatro dobleces sin cambio significativo en el índice de polidispersidad o potencial zeta. Sin embargo, el ADN no era recuperable en este procedimiento. Nanopartículas de MNPs_TEOS aumentaron de tamaño y disminuyeron índice de polidispersidad imperceptible cambio en potencial zeta después de la exposición del ADN, pero eran las mejores partículas en sus tasas de recuperación en el 20,3%. Nanopartículas de MNPs_APTES disminución ligeramente de tamaño y notablemente en zeta potencial a la exposición del ADN. Micropartículas de MMPs_PEI no mostraron cambio en tamaño a la exposición del ADN, sin embargo se aumentó en el índice de polidispersidad y descendió ligeramente en el potencial zeta. Micropartículas de MMPs_TEOS demostraron características tamaño alternativo a sus nanopartículas homólogos , es decir MNPs_TEOS. Sorprendentemente, disminuyeron notablemente en potencial zeta pero no más allá de la gama de MNPs_TEOS. MMPs_APTES aumentado de tamaño de partícula sobre la exposición del ADN y también disminución de potencial zeta. Es importante tener en cuenta que MNPs_APTES y MMPs_APTES habían conservado tamaños similares después de modificación química a pesar de que fueron hechos de diferente tamaño precursores. También han mostrado propiedades de Unión similares. MNPs_TEOS mostró ningún cambio significativo por sus valores de potencial zeta en el extremo más bajo se detectaron en este estudio.

Los estabilización de seguimiento en el tiempo para el potencial zeta demostrada valores después de 5-10 min, especialmente en el caso de MNPs (Figura 3A, 3C y 3E). Una tendencia continua en el potencial zeta se encontró en algunas lecturas de MMPs (figura 3B, 3D y 3F). En algunos casos, las variaciones de potencial zeta correspondieron a las variaciones en el tamaño de partícula y el índice de polidispersidad pero no con la recuperación de ADN por elución.

Figure 1
Figura 1: esquema de protocolo. (A) modificaciones químicas de las partículas magnéticas incluyendo polietilamina ramificado, sílice y grupos amino. (B) medidas de aislamiento ADN utilizando tampón de Unión y partículas magnéticas inmovilizadas en el imán, seguido por PCR cuantitativa. (C) partícula de ADN vinculante el análisis usando DLS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: potencial Zeta de las partículas magnéticas representante en presencia y ausencia de DNA. La exposición a DNA causó visible disminución del potencial zeta en MNPs_APTES, MMPs_TEOS y MMPs_APTES. Barras de error representan la desviación estándar (N = 10). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: potencial Zeta de las partículas magnéticas representativas en el tiempo de presencia y ausencia de ADN. Potencial zeta de las partículas en solución de encuadernación se midió en tiempo = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 min distancia entre las curvas de potencial zeta de control vs con ADN son evidentes en casos de MMPs_TEOS, MNPs_APTES y MMPs_APTES. (A) potencial de Zeta de MNPs_PEI es altamente positivo, indicando que no hay interacciones. (B) potencial de Zeta de MMPs_PEI disminuyó con el tiempo, lo que sugiere una interacción muy lenta entre las partículas y el ADN. (C) potencial Zeta de MNPs_TEOS era muy negativa en ausencia y presencia de ADN. (D) potencial de Zeta de MMPs_TEOS muestra valores más bajos en presencia de ADN en comparación con controles. (E) potencial de Zeta de MNPs_APTES muestra valores más bajos en presencia de ADN en comparación con controles. (F) potencial de Zeta de MMPs_APTES muestra valores más bajos en presencia de ADN en comparación con controles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Características MNPs_PEI MNPs_TEOS MNPs_APTES MMPs_PEI MMPs_TEOS MMPs_APTES
Tamaño de las partículas (nm)
en el agua 141.8 91.3 1106.4 825.0 1281.3 1281.3
en la solución de enlace 531.2 1990.1 3091.0 2669.0 2669.0 1990.1
en bindin
g de solución con el ADN 1990.1 3091.0 2669.0 2669.0 1990.1 4145.4 cambio observado aumentó aumentó aumentó Índice de polidispersidad en el agua 0.237 0.240 0.219 0.410 0.281 0.206 en la solución de enlace 0.225 0.773 0.090 0.107 0.374 0.397 en la solución de unión con el ADN 0.240 0.298 0.282 0.301 0.387 0.319 cambio observado disminución de aumentó aumentó Potencial zeta (mV) * en la solución de enlace 42.29 -27.83 33.23 30.80 -6.86 -0.66 (±SD) 1.15 1.17 2.89 8.99 7.99 5.42 en la solución de unión con el ADN 41.81 -25.97 12,28 27.81 -23.67 -15.22 (±SD) 2.02 0.80 2.21 4.33 0.95 4.28 cambio observado disminución de disminución de disminución de PCR cuantitativa recuperación ** Número de copias de DNA obtenido 1.22E + 03 1.01E + 09 3.18E + 06 1.44E + 06 3.76E + 08 6.88E + 06 (±SD) 8.05E + 02 7.55E + 07 2.83E + 06 1.98E + 06 1.08E + 08 3.33E + 06 Porcentaje de recuperación de ADN 0.0 20.3 0.1 0.0 7.5 0.1 (±SD) 0.0 1.5 0.1 0.0 2.2 0.1 * Sólo estable las mediciones después de 5 minutos de enlace se muestra (N = 7). ** R² = 0.940 por triplicado de las normas.

Tabla 1: caracterización de partículas magnéticas representante y sus habilidades para atar y recuperar ADN. En caso de exposición a solución de enlace, todas las partículas demostraron agregación (aumento de tamaño de partícula). Cuando ADN estaba presente en la solución de encuadernación, aumento de tamaño de partícula fue visible en MNPs_PEI, MNPs_TEOS y MMPs_APTES. Las partículas eran sistemas polidispersas en vinculantes de solución, particularmente MNPs_TEOS que se convirtió en menos polydispersed al atascamiento de la DNA. MNPs_APTES demostradas incremento en el índice de polidispersidad y disminución de potencial a la exposición al ADN zeta. MMPs_TEOS y MMPs_APTES mostraron gran disminución de potencial a la exposición al ADN zeta. MNPs_TEOS y MMPs_TEOS mostraron las tasas más altas de la recuperación del ADN de 20.3% y 7.5%, respectivamente, como se muestra por PCR cuantitativa. MNPs_APTES y MMPs_APTES mostraron tasas de recuperación de ADN de 0.1%.

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Discussion

En el presente Protocolo, los principios teóricos que explican la Unión de ADN a las partículas magnéticas vía potencial zeta estaban bajo pregunta. El protocolo describe la síntesis y modificación de nanopartículas magnéticas y micropartículas. También se describen el método para la preparación de la solución de control y enlace de ADN. Aquí se muestran dos estrategias para la detección de interacciones de partículas de ADN: PCR cuantitativa y DLS se acerca. DLS ofrece tres indicadores de cambios fisicoquímicos en las partículas: granulometría, índice de polidispersidad y potencial zeta. Cambios de tamaño de partícula directamente indican agregación o disgregación. Valor de índice de polidispersidad describe la distribución de las especies de partículas en el sistema de generación (índice < 0.05) a altamente polydispersed (índice > 0,7). Potencial zeta puede clasificar las partículas según carga superficial donde las partículas altamente positivas muestran valores mayores de 30 mV y partículas altamente negativas muestran valores inferiores a -30 mV. Como se predijo, el potencial zeta de las partículas magnéticas de polycharged en enlace solución relativamente disminuida cuando las partículas fueron expuestas al ADN. La excepción a esta regla es MNPs_TEOS. Estas partículas sólo difieren en que poseen una carga superficial negativa altamente única (figura 2). Esto sugiere que la fuerza iónica desempeñó un papel importante en la celebración de las partículas, ADN e iones positivos juntos. Por otro lado, los cambios en el tamaño de partícula pueden indicar el papel de la precipitación/agregación de partículas de ADN durante el proceso de enlace, particularmente en la presencia de filamentos más largos de la DNA.

Durante la síntesis de partículas magnéticas y modificaciones químicas, hay varios pasos críticos que requieren atención: en primer lugar, la reproducibilidad del método de síntesis depende en gran medida precisas cantidades de precursores químicos utilizados en síntesis así como de buena agitación y tiempo había controlado además de NH4OH. Para obtener una población homogeneizada de partículas (de similar tamaño, forma, densidad y composición), es importante seguir sonicación y agitación pasos completamente cuando se le indique. En segundo lugar, en muchos casos realistas las modificaciones químicas no predicen la realidad de lo que está en la superficie de las partículas magnéticas. Un paso de caracterización completa es necesario para confirmar la composición química de la superficie de la partícula, como se describe en la sección de introducción. Entre las técnicas utilizadas, los investigadores confían en FTIR, XPS, electroquímica, la espectroscopia así como DLS.

Además, se requieren varios pasos críticos durante la DLS mediciones y análisis: en primer lugar, la opción de enlace solución afecta varios pasos incluyendo compatibilidad química con partículas de ADN y también propiedades espectrales. Opción de índices de refracción de la solución y la partícula material obligatorio puede basado en estudios previos o evaluado por refractometría. En segundo lugar, las interacciones entre las partículas y los electrodos en las cubetas deben ser vigiladas cuidadosamente como proceso de oxidación/reducción puede afectar la medición. En tercer lugar, como se muestra en la figura 3, la tasa de enlace puede ser una función del tiempo. Es fundamental observar la estabilidad de la interacción, y esto es una gran ventaja para el uso de DLS en este tipo de estudios. Aquí, el observador es control de agregación de las partículas y cambios fisicoquímicos en tiempo real. En cuarto lugar, polidispersidad del sistema puede establecer limitaciones en el alcance del análisis. Valor de índice de polidispersidad abajo 0.05 describe un sistema de generación, mientras que valores superiores a 0,7 describen un sistema de polydispersed de varios tamaños de partículas. El tamaño de las partículas y la distribución de partículas de diferentes especies pueden ser estudiadas mediante varios tipos de DLS, incluyendo back-esparcidas, lado dispersos y esparcidos hacia adelante, como se menciona en la sección 3.1 del protocolo. Finalmente, sonicación de partículas antes de la prueba obviamente puede afectar sus propiedades físicas (por ejemplo , tamaño y superficie) y si se hace excesivamente puede causar liberación de algunas modificaciones químicas.

En este protocolo, información adquirida via DLS es comparado con datos obtenidos por PCR cuantitativa, también conocido como real-time PCR. Este último es el gold standard para la detección y cuantificación de ADN. 15 técnica de PCR es ampliamente utilizado en laboratorios, hospitales y universidades. Sin embargo, cuando se prueba la exposición del ADN a novela y materiales sintetizados es importante tener la química de la polimerización en cadena en consideración. Enzima polimerasa, el elemento clave de la reacción en cadena de polimerasa, es sensible a ciertos inhibidores químicos y potenciadores. Además de los controles internos, pruebas de los materiales sintéticos y buenas prácticas de laboratorio pueden ayudar a reducir sesgos en los resultados de PCR. Mecanismos de acción de inhibidores y potenciadores varían entre los productos químicos que se unen directamente a la polimerasa y otras que quelar iones de Mg2 +-dependiente polimerasa en solución. Algunas ideas acerca de ADN son difíciles de conseguir utilizando detección de PCR. DLS puede mostrar casos cuando ADN se une a las partículas pero más bien se lava o no responsables (no detectado por PCR de DNA). Por ejemplo, MNPs_APTES y MMPs_APTES mostró significativa disminución de potencial a la exposición de ADN (tabla 1) zeta pero el ADN detectado en la elución no correlacionaron con los resultados. Es posible modificar el enlace, lavado, soluciones de elución para controlar la liberación de ADN de las partículas. DLS es un método relativamente rápido para la evaluación de las interacciones de la partícula de ADN. La estabilidad y la velocidad de interacción también se observan por este método (figura 3), que puede afectar el uso de partículas magnéticas - basado en protocolos de aislamiento de ADN.

Los retos para el uso de DLS en análisis son muy sencillos. Esta técnica requiere un volumen relativamente grande de muestra para análisis (~ 1 mL) en comparación con la PCR. Algunos parámetros como los índices de refracción requieren evaluación cuidadosa al utilizar nuevas soluciones en las muestras. Además, es muy común observar las reacciones de oxidación/reducción en los electrodos de cubetas al probar nuevo material. Una cuidadosa evaluación y conocimiento de la composición química de la muestra pueden ayudar a evaluar la factibilidad de la reutilización de la misma cubeta. Cabe mencionar que análisis DLS se limita a la especificidad y sensibilidad de la PCR, sin embargo, ofrece diferentes tipos de conocimiento para el proceso de unión de partículas de ADN.

Como todas las técnicas espectroscópicas, modificaciones y resolución de problemas de DLS como objetivo para el desarrollo de mediciones más precisas y sensibles. Esto se logra al proporcionar mejor comprensión de la naturaleza del material probado físicamente y químicamente. En otras palabras, propiedades ópticas y detalles de la composición química son la clave para obtener datos precisos y sensibles de DLS. Propiedades ópticas pueden ser adquiridos por refractometría, mientras que la composición química de partículas / superficie de partículas puede ser estudiada mediante diversas técnicas como FTIR, XPS, electroquímica y otros métodos espectroscópicos. En este protocolo, solución vinculante puede mejorarse utilizando diversas concentraciones iónicas, otros agentes de deshidratación (por ejemplo, isopropanol), diferentes pH y temperaturas bajas. Por otra parte, las modificaciones químicas de la superficie de la partícula se dejan a la imaginación de los químicos.

El desarrollo de materiales para aislamiento de DNA seguirán aumentando en las próximas décadas centrándose más en la especificidad, la pureza y límite de detección. La calidad de los métodos de extracción juega papel importante en los estudios de escala unicelular, mescalas de etagenomic y muestras de origen inusual. En la actualidad, es importante realizar análisis DLS de nanopartículas y micropartículas modificado con varias clases de materiales. Este paso es necesario antes de establecer un modelo teórico fuerte que describe el comportamiento de las interacciones de la partícula de ADN.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Mucho se reconoce el apoyo financiero por la Fundación para la ciencia Checa (proyecto GA CR 17-12816S) y CEITEC 2020 (LQ1601).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iron(III) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 207926 Magnetic particle synthesis
Iron(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich 380024 Magnetic particle synthesis
Iron(II) sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich F8263 Magnetic particle synthesis
Acetone Penta 10060-11000 Magnetic particle synthesis
Sodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich W302600 Magnetic particle synthesis
Tetraethyl orthosilicate Sigma-Aldrich 131903 Magnetic particle synthesis
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140 Magnetic particle synthesis
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 Sigma-Aldrich 408727 Magnetic particle synthesis
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 221228-M  Magnetic particle synthesis
Ethanol Penta 71250-11000 Magnetic particle synthesis
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P6083 Magnetic particle synthesis
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 1.05012 Magnetic particle synthesis
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) Spectrum labs G235063 Magnetic particle synthesis
Overhead Stirrer witeg Labortechnik GmbH DH.WOS01035 Magnetic particle synthesis
Waterbath Memmert GmbH + Co. 84198998 Magnetic particle synthesis
Sonicator Bandelin 795 Magnetic particle synthesis
BRAND UV cuvette micro Sigma-Aldrich BR759200-100EA Cuvette for size measurement
BRAND cap for UV-cuvette micro Sigma-Aldrich BR759240-100EA Cuvette caps for size measurement
Folded Capillary Zeta Cell Malvern DTS1070 Cuvette for zeta potential measurement
Zetasizer Nano ZS Malvern ZEN3600 Device for measurement of size and zeta potential
Infinite 200 PRO
NanoQuant instrument		 Tecan 396 227 V1.0, 04-2010 device for measurement of DNA concentration
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit Sigma-Aldrich QR0100 PCR kit
Mastercycler pro S instrument Eppendorf 6325 000.013 Thermocycler
MinElute kit Qiagen 28004 DNA purification kit
Sodium acetate Sigma-Aldrich S7670 DNA binding

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References

  1. Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
  2. Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
  3. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
  4. Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
  5. Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
  6. Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
  7. Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).
  8. Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
  9. Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
  10. Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
  11. Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
  12. Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
  13. Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
  14. Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
  15. Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).

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Química número 129 de ADN partícula magnética modificación química dinámica de dispersión de luz PCR cuantitativa
Partícula magnética de ADN vinculante el análisis por la dispersión ligera dinámica y electroforética
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Haddad, Y., Dostalova, S., Kudr, J., Zitka, O., Heger, Z., Adam, V. DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering. J. Vis. Exp. (129), e56815, doi:10.3791/56815 (2017).

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