Summary
Denne rapport beskriver en protokol til måling af de absolutte niveauer af plasma miRNA, ved hjælp af kvantitative real-time reverse transkription PCR, med eller uden forudgående forstærkning. Denne protokol giver bedre forståelse af mængden af plasma miRNAs og giver mulighed for kvalitativ vurdering af tilsvarende data fra forskellige undersøgelser eller laboratorier.
Abstract
RT-qPCR er en af de mest almindelige metoder til at vurdere individuelle mål miRNAs. MiRNAs niveauer måles generelt i forhold til en kontrolprøve. Denne tilgang er relevant for behandlingen af fysiologiske ændringer i gen expression målværdier. Men absolut kvantificering ved hjælp af bedre statistisk analyse er at foretrække frem for en omfattende vurdering af gene expression niveauer. Absolut kvantificering er ikke stadig i fælles brug. Denne rapport beskriver en protokol til måling af de absolutte niveauer af plasma miRNA, ved hjælp af RT-qPCR, med eller uden forudgående forstærkning.
En fast volumen (200 µL) af EDTA-plasma blev udarbejdet af blod indsamlet fra den femoralis vene af bevidst cynomolgus aber (n = 50). Total RNA blev udvundet ved hjælp af kommercielt tilgængelige system. Plasma miRNAs var kvantificeres ved sonde-baserede RT-qPCR assays, som indeholder miRNA-specifikke frem/tilbage PCR primer og sonde. Standard kurver for absolut kvantificering blev genereret ved hjælp af kommercielt tilgængelige syntetisk RNA-oligonukleotider. En syntetisk cel-miR-238 blev brugt som en ekstern kontrol til normalisering og kvalitet vurdering. De miRNAs, der viste kvantificering cyklus (Cq) værdier over 35 var pre forstærket før qPCR trin.
Blandt de 8 miRNAs undersøgt, miR-122, miR-133a og miR-192 var påviselige uden forudgående forstærkning, miR-1, miR-206 og miR-499a kræves forudgående forstærkning på grund af deres lave udtryk niveauer. MiR-208a og miR-208b var ikke detectable selv efter pre forstærkning. Prøve behandling effektivitet blev evalueret af Eva værdierne af de spidse cel-miR-238. I denne analyse metode, tekniske variation blev anslået til at være mindre end 3-fold og den nedre grænse for kvantificering (LLOQ) var 102 kopi/µL, for de fleste af de undersøgte miRNAs.
Denne protokol giver et bedre skøn over mængden af plasma miRNAs, og giver mulighed for kvalitetsvurdering af tilsvarende data fra forskellige undersøgelser. I betragtning af det lave antal miRNAs i kropsvæsker, før forstærkning er nyttigt at forbedre afsløring af dårligt udtrykt miRNAs.
Introduction
Et stigende antal undersøgelser har været at udforske MicroRNA (miRNAs) som biomarkører for diagnose og prognose af kræft, eller overvågning og påvisning af andre sygdomme i kvalitetsdata og kliniske undersøgelser1,2,3 . Kvantitative real-time reverse transkription PCR (RT-qPCR) er en af de mest almindelige metoder anvendt til at vurdere individuelle mål miRNAs, fordi denne teknik er mere følsomme end microarray4 og RNA sekventering baseret platforme5. I almindelighed, er miRNA udtryk målt i forhold til en referenceprøve benytter den ΔCq metode6. Denne tilgang er relevant for at undersøge fysiologiske ændringer i gen expression målværdier. Relative kvantificering af cirkulerende miRNAs har dog begrænset nytte på grund af deres små mængder. Derudover gør tekniske variation det vanskeligt at sammenligne resultaterne fra forskellige undersøgelser, fordi forskellige laboratorier tilpasse RT-qPCR eksperimentelle protokoller forskelligt, hvilket fører til strid eller endda modstridende resultater fra forskellige studier7.
I lyset af de bekymring, der er nævnt ovenfor, kan absolut kvantificering være mere egnet til vurdering af de små mængder af miRNAs i kropsvæsker. Den absolutte kvantificering metode bruger en standardkurve genereret af kendte koncentrationer af syntetisk RNA-oligonukleotider, der er identiske i rækkefølge med de tilsvarende mål miRNA8. Sundheds- og miljømæssige Sciences Institute (HESI) tekniske udvalg på genomforskning for nylig foretaget omfattende undersøgelser for at sammenligne resultaterne af absolutte målinger af plasma miRNAs, på tværs af flere forsøgssteder. Resultaterne viste, at ved hjælp af en standardprotokol for den absolutte kvantitering af miRNAs viste sammenlignelige resultater på tværs af flere test sites9. RT-qPCR assay metode beskrevet i den nuværende undersøgelse er næsten identisk med den HESI standardprotokol, som indeholder multipleksede analyse af flere miRNA mål, og før forstærkning til støtte påvisning af lav udtryk miRNAs.
I denne undersøgelse, en fast volumen (200 µL) af EDTA-plasma fremstillet af blod indsamlet fra den femoralis vene af bevidst cynomolgus aber (n = 50) blev brugt10. Følgende protokol beskriver proceduren for udarbejdelse af plasmaprøver, udvinding af miRNA og RT-qPCR, herunder pre forstærkning. Endnu vigtigere, er yderligere tekniske oplysninger om protokollen medtaget, således at target miRNAs i prøverne mængde kan valideres i kombination med en velkvalificeret proces. Først, Standardkurven for hver miRNA blev valideret for sin individuelle registreringsområde, før dens kvantificering i biologiske prøver. Andet, kvaliteten af den nuværende metode blev grundigt evalueret ved hjælp af Cq værdier af et eksternt objekt (cel-miR-238). Derfor, denne platform giver mere informative og pålidelige data for at sammenligne resultaterne fra forskellige undersøgelser eller laboratorier.
Profiler af 8 miRNAs er medtaget i denne betænkning som repræsentative resultater fra analysen metode beskrevet her. Disse miRNAs er blevet foreslået som mulige sikkerhed biomarkører forbundet med vævsskade at leveren (miR-122 og miR-192), hjerte (miR-1, miR-208a, miR-208b og miR-499a) og skeletmuskulatur (miR-133a og miR-206) i gnavere og mennesker3, 11,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Daiichi Sankyo Co., Ltd.
1. Prøvetilberedning
- Indsamle blod (mindst 0,5 mL) fra den femoralis vene cynomolgus aber i EDTA 2K-holdige rør.
Bemærk: Citrat og heparin er ikke acceptabelt, fordi disse antikoagulantia hæmme efterfølgende PCR14,15. - Placer de indsamlede prøver straks på is og proces for plasma isolation inden 2 timer efter indsamlingen.
- Der centrifugeres prøver på 10.000 x g ved 4 ° C i 5 min.
- Overføre supernatanten i et 2 mL microtube, efterfulgt af centrifugering ved 16.000 x g ved 4 ° C i 5 min at fjerne celle debris og resterende blodplader.
Bemærk: Kvantificering af miRNAs kan påvirkes betydeligt af trombocyt forurening16. - Placer 200 µL delprøver af supernatanten i frisk 2 mL-microtubes, og opbevares ved-80 ° C indtil brug.
Bemærk: Et fast volumen af hver prøve bruges til RNA udvinding; Derfor, alikvot mængde skal være nøjagtige.
2. RNA udvinding
- Optø frosne prøver på is (fra trin 1,5).
- Hold prøve kold på is under RNA udvinding. Chill lysis reagens og chloroform på is før brug.
- Tilføj 5 bind (1000 µL) lysis reagens, der indeholder monofasiske løsning af phenol og guanidin isothiocyanat trichloromethan (200 µL), og bland kraftigt af vortexing for 1 min.
- Tilsæt 5 µL af 5 nM syntetisk Caenorhabditis elegans miRNA (Syn-cel-miR-238-3 p).
- Tilsæt 1 volumen (200 µL) af chloroform, og bland kraftigt af vortexing for 1 min.
- Holde på is i 2-3 min, og derefter centrifugeres prøver på 12.000 x g ved 4 ° C i 15 min.
- Overføre den vandige fase omhyggeligt til en ny microtube.
Bemærk: Ikke overføre nogen af de organiske fase (rød) eller interphase (hvid). Omfanget af den vandige fase indsamlet bør være ensartet at undgå håndtering inkonsekvens, hvilket resulterer i øget teknisk variation. Den sædvanlige mængde af vandig fase overført i denne protokol var 650 µL. - Tilføj 1,5 diskenheder (975 µL) ethanol, og bland godt ved pipettering op og ned.
- Overføre prøven til et tilsvarende kolonne og adapter, efterfulgt af vakuum tørring i 3 min. ved hjælp af vakuum mangfoldigheder. Hvis prøven er mere end 700 µL, Gentag dette trin for at behandle de resterende løsning.
Bemærk: Kolonne-baserede RNA isolering er kompatibel med vakuum og centrifugering metode. - Tilføje 200 µL af ethanol til kolonnen, efterfulgt af vakuum tørring i 1 minut.
- Tilføje 800 µL af RWT Buffer til kolonnen, efterfulgt af vakuum tørring i 2 min.
- Tilføje 800 µL af ÅV Buffer til kolonnen, efterfulgt af vakuum tørring i 2 min.
- Gentag trin 2.11.
- Tilføje 300 µL af ethanol til kolonnen, efterfulgt af vakuum tørring i 1 minut.
- Placere kolonnen på en ny microtube, og der centrifugeres ved 12.000 x g ved stuetemperatur (15-25 ° C) for 1 min.
- Overfør kolonnen til et nyt microtube, og tilsæt 50 µL nukleasen-gratis vand.
- Stå ved stuetemperatur (15-25 ° C) for 3 min, og der centrifugeres ved 8.000 × g ved stuetemperatur (15-25 ° C) i 1 min.
- Ansøge igen eluatet til kolonnen.
- Gentag trin 2.16, og gemme eluatet ved-80 ° C indtil brug.
3. cDNA syntese
- Optø frosne prøver (fra trin 2.18).
-
Forberede kendt koncentration af syntetisk RNA-oligonukleotider, der svarer til målet miRNAs.
- Bruge syntetisk RNA oligonukleotid til at generere en standardkurve i qPCR. Stamopløsningen af 1 x 108 kopi/µL koncentration er forberedt til oplagringsformål.
- Fortynd stamopløsningen 10-fold for at få 1 x 107 kopi/µL (ikke pre forstærket prøver) eller 1 x 105 kopi/µL (pre forstærket prøver) brugsopløsning som den højeste koncentration til at konstruere standardkurven. Et foreslået område for standardkurven koncentrationer er generelt 1 x 107 til 1 x 102 kopi/µL (ikke pre forstærket prøver) eller 1 x 105 til 1 x 100 kopi/µL (pre forstærket prøver).
- Forberede multiplex RT primer pool ved at blande lige store mængder af 20 x RT primere for target miRNAs.
Bemærk: Som vist i figur 2, en pool, der indeholder op til 4 mål miRNAs kan gøres ved at blande 20 x RT primere af hver af miRNAs i poolen. Cel-miR-238 (ekstern kontrol) skal medtages som en af target miRNAs i hver tube. I tilfælde af færre end 4 mål miRNAs, tilføje lige store mængder af 1/10 TE buffer i stedet for 20 x RT primer. - Forberede RT mastermix: 3 µL af RT primer pool (fra trin 3.3), 0,15 µL af 100 mM dNTP'er med dTTP, 1 µL af reverse transkriptase (50 U/µL), 1,5 µL 10 x RT buffer, 0,19 µL af RNase inhibitor (20 U/µL) og 4.16 µL af nukleasen-gratis vand.
- Mix 10 µL af RT reaktion blandes med 5 µL af RNA prøve (fra trin 3.1) eller oligonukleotider (fra trin 3.2) ved pipettering, og der inkuberes i isbad i 5 min.
- Køre reverse transkription på en apparater, der termisk cycler: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 min, efterfulgt af en sidste reverse transkriptase inaktivering skridt på 85 ° C i 5 min. butik omvendt transskriberede prøver på-80 ° C indtil brug.
4. preamplification (valgfrit)
Bemærk: De miRNAs, der viser Cq værdier over 35 eller derover i efterfølgende qPCR er pre forstærker.
- Optø frosne prøver (fra trin 3.6).
- 10-fold serielle fortyndinger af RT produkt fra syntetisk RNA-oligonukleotider; 1 x 105 til 1 x 100 kopi/µL til generering af standardkurven.
- Forberede multiplex assay primer pool ved at blande lige store mængder (5 µL) 20 x assay primere for target miRNAs med hvert assay primer bliver fortyndet 200-fold endelige koncentration af TE buffer i en endelige mængden af 1.000 µL.
Bemærk: Assay primere hvis målet miRNAs kan kunne påvises i efterfølgende qPCR uden forudgående forstærkning, og dem for cel-miR-238 (ekstern kontrol) er ikke inkluderet i primer pool. - Forberede før forstærkning mastermix: 12,5 µL af 2 x klar-til-brug preamplification reagens, 3,75 µL af assay primer pool (fra trin 4.3) og 6,25 µL nukleasen-gratis vand.
- Mix 22,5 µL af pre forstærkning reaktion blandes med 2,5 µL af reverse transskriberede prøve (fra trin 4.1) eller oligonukleotider (fra trin 4.2) af pipettering, og der inkuberes i isbad i 5 min.
- Køre reaktion på en apparater, der termisk cycler: 95 ° C i 10 min. efterfulgt af 12 cyklusser af 95 ° C til 15 s og 60 ° C i 4 min. gemme pre forstærket prøver på-80 ° C indtil brug.
5. kvantitative Real-time PCR (qPCR)
- Optø frosne prøver (fra trin 3.6 eller trin 4.6).
- Fortynde prøverne 5-fold med sterilt vand.
- Forberede 10-fold serielle fortyndinger af RT produkt fremstillet af syntetisk RNA-oligonukleotider; 1 x 107 til 1 x 102 kopi/µL (ikke pre forstærket prøver) eller 1 x 105 til 1 x 100 kopi/µL (pre forstærket prøver) til at generere standard kurver.
- Forberede qPCR mastermix: 10 µL af 2 x klar-til-brug forstærkning reagens, 1 µL af 20 x assay reagens, der indeholder frem/tilbage PCR primer og sonde svarer til målet miRNA, og 7 µL nukleasen-gratis vand.
- Overføre 18 µL fra qPCR mastermix til fast optisk 96-brønd reaktion plader, og tilsæt 2 µL af de fortyndede prøver (fra trin 5.2 eller trin 5.3) i brøndene.
Bemærk: Prøver og standarder for qPCR er sat i dubletter. - Forsegle pladen med selvklæbende film, og centrifugeres kort.
- Køre reaktion på en real-time termisk cycler: 95 ° C til 20 s, efterfulgt af 45 cyklusser af 95 ° C for 1 s og 60 ° C i 20 s.
6. dataanalyse
- Beregne rå kopi antallet af hver prøve ved hjælp af data analyse software, der arbejder med tilsvarende real-time termisk cycler.
Bemærk: Tærskel linje er indstillet manuelt til "1,0" i alle plader i undersøgelsen, at bekræfte reproducerbarhed forhold til deres Cq vales. Cut-off indstilles på Cq > 40 cyklusser. - Beregne gennemsnittet af rå kopi antallet af hver prøve fra dubletter.
- Beregne korrektionsfaktoren ved at dividere en kopi antal cel-miR-238 i hver prøve af gennemsnittet af kopi antallet af cel-miR-238 fra alle prøver i en tilsvarende tube.
Bemærk: Som vist i figur 2, hver tube indeholder op til 4 mål miRNAs herunder cel-miR-238 (ekstern kontrol). Derfor beregnes korrektionsfaktoren for hver tube bruger tilsvarende cel-miR-238 værdi. - Beregne den korrigerede eksemplarnummer ved at dividere gennemsnit rå kopi antallet af hver prøve (fra trin 6.2) af korrektionsfaktoren (fra trin 6.3) for hver prøve.
- Beregne den absolutte eksemplarnummer ved at multiplicere den justerede rå kopi antallet af hver prøve (fra trin 6.4) ved den fortyndingsfaktor for hver prøve.
Bemærk: Fortyndingsfaktoren er "5" i denne protokol, som er afledt af trin 5.2. - Beregne effektivitetsgevinsterne af PCR-amplifikation fra hældningen af plot Cq værdierne for hver serie fortynding mod log cDNA koncentration.
Bemærk: Formel til beregning af effektiviteten; E = (10(-1/hældning) -1) x 100%. - Beregne den tekniske variation ved hjælp af Cq værdierne af cel-miR-238 fra alle prøver ved hjælp af formel E = (2 x forstærkning effekt)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
Bemærk: Trin 6.5 og 6.7 bruges til kvalitetsvurdering af proceduren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbejdsgang af miRNA assay af RT-qPCR og kvalitet assessment
Figur 1 viser arbejdsprocesser af miRNA analyse fra blodprøver bruge qPCR10. Kvaliteten af eksperimenterne kan verificeres ved herunder cel-miR-238 som en ekstern kontrol. Dette vil afsløre tekniske variationer i RNA ekstraktion og efterfølgende RT-qPCR processer. I denne undersøgelse var den gennemsnit ± SD Cq værdierne er beregnet ud fra 50 prøver 21.0 ± 0,4 (tabel 1). Hvis cel-miR-238 blev udvandet på grund af trinnet pre forstærkning, var værdien Cq 24,2 ± 0,4 (tabel 1). I analysen metode beskrevet her, blev omfanget af tekniske variation anslået til at være mindre end 3-fold baseret på forskellen i Cq værdier. Grad af variation opholdt sig konsekvent, selv når supplerende pre-forstærkning skridt skulle være inkluderet. Disse værdier er forenelige med de øvrige prøver fra forskellige dyrearter, såsom mus, rotter og mennesker udføres på dette laboratorium (data ikke vist).
Påviselige spænder fra Standardkurven for target miRNA
Ingen pre forstærkning af prøverne
Den omvendte transskriberede (RT) produkt fra syntetisk RNA-oligonukleotider i koncentrationer på 1 x 107 kopi/µL var seriefremstillede fortyndes før efterfølgende qPCR. Disse serier blev brugt til at generere standardkurve, som sikres ensartet dækning af alle biologiske prøver, der var påviselige uden præ forstærkning trin. Cq værdier for standardprøven ved 1 x 102 kopi/µL koncentration var generelt tæt på cut off niveauer for hvert mål miRNA. Derfor blev detektionsgrænsen anslået til 1 x 102 kopi/µL (figur 3).
Pre forstærket prøver
Bestem den påviselige række prøver der kræver pre forstærkning ved blev to forskellige serier af fortyndede prøver sammenlignet, som illustreret i figur 4. For at generere standardkurven A, blev serielle fortyndinger af RT produktet inden før forstærkning skridt udarbejdet. Derefter blev serie af pre forstærket standarder brugt til efterfølgende qPCR. For at generere standardkurven B, var den første fortynding lavet af pre forstærket prøver til en koncentration af 1 x 105 kopi/µL. Disse standard kurver viste tilsyneladende forskellige påvisningsgrænserne (figur 5). Selv om standardkurven B viste lineære område af stigning ned til 1 kopi/µL, standardkurven A ikke kunne bruges til specifikke amplikoner i koncentrationer på mindre end 102 eller 103 kopi/µL (figur 5). Dette resultat foreslået, at meget små mængder af miRNAs ikke kan vurderes selv med pre forstærkning trin. Derudover pre forstærket prøverne skal fortolkes nøje, når Cq værdierne > 30, fordi påvisningsgrænserne for de pre forstærket prøver var tæt på denne værdi. Derfor som hovedregel blev standardkurven B brugt i metoden beskrevet her, når rækken kan påvises kun for at undgå at bruge utilstrækkeligt antal standard parceller.
Derfor, den nedre grænse for kvantificering (LLOQ) var 102 kopi/µL for de fleste af miRNAs (figur 3 og figur 5). Kun miR-1 viste en højere LLOQ (103 kopi/µL) (figur 5). Den gennemsnitlige forstærkning effektivitet var ca. 90%, med korrelationskoefficient (R2) af standard kurver spænder fra 0.998 til 1,000. Kendetegnende for en nøjagtig RT-qPCR analysen anses for at være en lineær R2 lig med eller større end 0,98 og en PCR forstærkning effektivitet af 90 til 110%17. Derfor, kvaliteten af de standard kurver i analysen blev efterprøvet.
Virkningerne af pre forstærkning for små mængder af miRNAs
De miRNAs, der viste Cq værdier over 35 eller højere i efterfølgende qPCR var Pre forstærker. Denne procedure forbedrede påvisning af små mængder af miRNAs. For eksempel, Cq værdier (gennemsnit ± SD) i pre-forstærker miR-206 var 37.9 ± 1,9, mens de i Pre forstærker miR-206 faldt til 27,0 ± 2.2. Væsentlige forskelle mellem dublerede måling par blev observeret i pre-forstærker prøver på høje Cq værdier (figur 6). Derimod viste pre forstærket prøver næsten ens værdier i dubletter (figur 6). Disse resultater viste, at før forstærkning ville være effektiv for at give mere nøjagtige og pålidelige data i tilfælde af små mængder af prøver.
Profilering af plasma miRNAs i cynomolgus aber
Ved hjælp af etablerede assay platform, analyseret plasmaniveauer af 8 miRNAs (miR-1, miR-122, miR-133a, miR-192, miR-206, miR-208a, miR-208b, og miR-499a) fra 50 cynomolgus aber blev (figur 7)10. I denne analyse, miR-122, miR-133a og miR-192 var påviselige uden forudgående forstærkning, miR-1, miR-206 og miR-499a kræves forudgående forstærkning på grund af deres lave udtryk niveauer. Men hverken miR-208a eller miR-208b var påviselige selv med pre forstærkning. Dataene blev ikke normalt fordelt; Derfor blev en logaritmisk transformation udført for at beregne deres gennemsnit og standardafvigelser. Blandt miRNAs undersøgt, miR-122 viste det højeste gennemsnitlige plasma niveau (5,71 x 104 kopi/µL), med en lille dynamikområde (20-fold). Derimod store dynamiske områder blev observeret for miR-1 (581-fold), miR-133a (971-fold), og miR-206 (426-fold).
Figur 1 : Skematisk workflow af miRNA assay af RT-qPCR. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Skematisk arbejdsproces af reverse transkription af miRNA assay. En pool, der indeholder op til 4 mål miRNAs kan laves ved at blande 20 x RT primere af hver af miRNAs i poolen. Cel-miR-238 (ekstern kontrol) skal medtages som en af target miRNAs i hver tube. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| miR-238 dataanalyse | ||
| Uden Før forstærkning |
Med Før forstærkning |
|
| N | 50 | 50 |
| Middelværdi | 21,0 | 24.2 |
| SD | 0,4 | 0,4 |
| Max Cq | 21,8 | 25,3 |
| Min Cq | 20.3 | 23,5 |
| Median | 21,0 | 24.2 |
| Max-Min | 1.3 | 1.8 |
| Forstærkning effektivitet | 89 | 89 |
| Variation | 2.4 | 2.8 |
Tabel 1: vurdering ved hjælp af kvantificering cyklus (Cq) værdier af cel-miR-238. Tekniske varianter blev evalueret fra Cq værdier af miR-238 i hvert assay. 50 prøver var opdelt i to grupper svarende til med (højre) eller uden (venstre) før forstærkningen trin. Variation blev beregnet ved hjælp af formel E = (2 x forstærkning effekt)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). Forstærkning effekten blev beregnet fra hældningen af standardkurven. De prøver, som kræver pre forstærkning skridt var fortyndes under trinnet pre forstærkning (miR-238, selv var ikke pre forstærker). Dette tal er blevet ændret fra vores rapport10.
Figur 3 : Plot af standard kurver for pre-forstærker prøver. Standard kurver (N = 3, dubletter) blev genereret af plotte log koncentration versus Cq. lineær regressionsanalyse var beregnet til at bestemme den hældning, som svarer til forstærkning effektivitet. Standard kurver for miR-122 (øverste), miR-192 (i midten) og miR-133a (lavere) viste lineær sammenhæng mellem Cq og koncentration på de testede rækkevidde. I de standard kurver udgør fejllinjer én standardafvigelse fra tre uafhængige assays. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Procedure til at generere standard kurver for pre forstærket prøver. (Standard kurve A) En repræsentativ koncentrationen af syntetiske oligo (1 x 105 kopi/µL) var omvendt transskriberet, efterfulgt af forberede 10-fold seriel fortynding af standardprøven. Disse præ forstærket standarder blev brugt til efterfølgende qPCR. (Standard kurve B) En repræsentativ koncentrationen af syntetiske oligo (1 x 105 kopi/µL) var omvendt transskriberet og pre forstærkes. Derefter, en 10-fold seriel fortynding serie af standardprøverne blev udarbejdet før efterfølgende qPCR. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Plot af standard kurver A og B for pre forstærket prøver. Standardkurven A (n = 1, dubletter) og standardkurven B (n = 3, dubletter) blev genereret af plotte log koncentration versus Cq. lineær regressionsanalyse var beregnet til at bestemme den hældning, som svarer til forstærkning effektivitet. (Øverste) Standardkurven en (stiplet linje) viste tilsyneladende ikke-specifikke amplikon på 1 x 102 kopi/µL, mens standardkurven B (solid line) viste lineær sammenhæng mellem Cq og koncentration på de testede vifte af miR-1. (Midterste og nederste) Standardkurven en (stiplet linje) viste ingen amplikon i koncentrationer på 1 x 102 kopi/µL eller lavere, mens standard kurve B (solid line) viste lineær sammenhæng mellem Cq og koncentration på de testede vifte af miR-499a og miR-206. I standardkurven B udgør fejllinjer én standardafvigelse fra tre uafhængige assays. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Forstærkning plot for pre-forstærker og pre forstærket prøver. (Øverste) forstærkning plot af miR-206 i repræsentative prøver (A, B, C) uden (øverste), eller med pre forstærkning (lavere). Målinger blev sat i to eksemplarer. Der var forskelle mellem de to prøver, der er oprettet som dubletter i pre-forstærker prøver, navnlig højere Cq prøver (A og B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Absolut værdi af plasma MicroRNA (miRNAs) i cynomolgus aber. Udtrykket niveauer af miRNAs repræsenteres af dot parceller. Mener, og værdien for to standardafvigelser nedenfor og ovenfor middelværdien (vist i grå boks), blev fastsat efter en logaritmisk transformation. Dette tal er blevet ændret fra vores rapport10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores omfattende vurdering forudsat en strengere statistisk analyse af omfanget af dynamikområde, som klart tilkendegivet, at omfanget af variation mellem individuelle prøver var yderst forskellige blandt de miRNAs testet. Selvom disse variationer kan henføres til deres små mængder i kropsvæsker, skal det bemærkes, at disse data afspejler ikke kun biologiske variationer, men også tekniske varianter. De fleste af de tekniske variation kan vurderes ved hjælp af Cq værdier af den eksterne kontrol (cel-miR-238), som bruges i andre assay platforme18. Da der har været ingen standardiserede interne kontroller i miRNA analyse, medtages oplysninger om tekniske variation i analyse, bestemmelse af kvaliteten af analysen19. Tekniske variation blev anslået til at være mindre end 3-fold i metoden beskrevet i denne betænkning. Selv om det ikke er muligt at bestemme kvalitetsniveau for denne procedure på grund af manglen på sammenlignelige tekniske oplysninger i anden forskning, herunder sådanne oplysninger bidrager til at forbedre pålideligheden og sikrer kompatibilitet mellem forskellige undersøgelser.
En række nyere artikler har rapporteret, at forskellige pre analytiske variabler som prøve håndtering, betingelser for opbevaring og opbevaring varighed før behandling kan påvirke pålidelighed og reproducerbarhed af cirkulerende miRNA målinger20 , 21. selv om denne undersøgelse ikke tage hensyn til virkningerne af pre analytiske variabler, følgende trin blev fulgt nøje under forberedelse af prøver at minimere variationer. For det første blev plasma behandlet så hurtigt som muligt (indenfor 2 timer efter samling) for at minimere effekten af stabiliteten af miRNAs i plasma8,22. Selvom miRNAs anses for at være stabile ved stuetemperatur (15-25 ° C), er det stadig uklart, om intervallet mellem indsamling og forarbejdning af plasma- eller serumprøver påvirker miRNA niveauer. For det andet var hver plasmaprøve visuelt inspiceret for at eliminere analytiske bias skyldes forurening med hemolyzed røde blodlegemer, som repræsenterer en af de forstyrrende faktorer, der kan påvirke niveauet af cirkulerende miRNAs23.
Før forstærkning er nyttigt at forbedre afsløring af meget små mængder af miRNAs i biofluids uden at indføre en påvisning bias24. I den foreliggende undersøgelse viste Cq værdier af standard kurver konstrueret ved hjælp af pre forstærket syntetiske oligonukleotider høj reproducerbarhed på tværs af assays. Dette må absolut kvantificering ved hjælp af pre forstærket prøver, som aktiveret påvisning af små mængder af miRNAs. På den anden side viser lav kopi nummer standarder (1 x 102 eller 103 kopi/µL) ikke specifikke amplikoner, i kombination med pre forstærkning. Mestdagh mfl. 24 rapporterede, at måling af lav kopi nummer miRNAs viste højere variation efter pre forstærkning procedure, sammenlignet med moderat eller høj kopi nummer miRNAs, på grund af den lave effektivitet af reverse transkription, som kunne være resultatet af miRNA sekvens karakteristika. Derfor skal rækkevidden af standard kurver for hver miRNA valideres før kvantificering af biologiske prøver, navnlig til pre forstærket miRNAs, at fjerne falsk-positive resultater. Vigtigere er, skal det bemærkes, at de absolutte niveauer af forskelligt forarbejdede miRNAs såsom pre forstærket og ikke forstærket pre prøver ikke kan sammenlignes direkte, fordi mængden af pre forstærket prøven ikke er angivet i hver miRNA.
Denne rapport beskriver en procedure til bestemmelse af absolutte miRNA niveauer i plasmaprøver ved hjælp af RT-qPCR. Nogle miRNAs blev ikke opdaget selv efter pre forstærkning. For at påvise en sådan lav udtryk miRNAs, kan en anden fremgangsmåde skal anvendes. Selv om ved hjælp af en større vareprøveantal kan omgå dette problem som en enkel løsning, er store mængder af prøven ikke altid tilgængelige. Til dato, har teknologiske fremskridt aktiveret udviklingen af forskellige platforme for miRNA profilering25,26. Droplet digital PCR (ddPCR) er blevet udviklet for nylig og tilbyder en alternativ metode til konventionelle RT-qPCR for absolut kvantificering. Denne innovative teknologi er blevet rapporteret at være en præcis, reproducerbare og følsom metode, der kan registrere en target miRNA på niveau 1 kopi/µL27,28. Hvis ddPCR kan registrere en lav koncentration af miRNAs uden en forudgående forstærkning trin, ville det være en stor fordel, fordi niveauerne af flere miRNAs kan sammenlignes med hinanden. Ændringer i ekstraktion procedurer og efterfølgende RT-qPCR, Molekylær platform og reagenser, der anvendes vil uundgåeligt give variable resultater. Men disse variationer kan løses hvis gennemsigtige resultater af eksterne kontroller og absolutte niveauer for individuelle miRNAs leveres. Passende kvalitetsvurdering af metoden er nøglen til at forbedre dømmekraft af biologiske ændringer i miRNA profilering undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har nogen interessekonflikt at videregive.
Acknowledgments
Denne forskning har ikke modtaget nogen særlige tilskud fra finansielle organer i de offentlige, kommercielle eller ikke-for-profit sektorer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | - | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
