Summary
В настоящем докладе описывается протокол для измерения абсолютного уровня плазмы Мирна, использование количественных реального времени обратной транскрипции ПЦР с или без предварительного усиления. Этот протокол предоставляет лучшего понимания количества плазмы адаптивной и позволяет качественной оценки соответствующих данных из различных исследований или лаборатории.
Abstract
RT-ПЦР является одним из наиболее распространенных методов для оценки отдельных целевых адаптивной. Интерферирующим уровни обычно измеряется относительно эталонного образца. Этот подход является подходящим для изучения физиологических изменений в целевые уровни выражения гена. Тем не менее абсолютное количественной оценки, используя лучше статистический анализ является предпочтительным для всеобъемлющей оценки уровни выражения гена. Абсолютная количественной оценки до сих пор не в общем пользовании. В настоящем докладе описывается протокол для измерения абсолютного уровня плазмы Мирна, используя RT-ПЦР с или без предварительного усиления.
Фиксированный объем (200 мкл) ЭДТА-плазмы был подготовлен из крови, собранные из бедренной вены обезьян Cynomolgus, получавших сознательного (n = 50). Общая РНК был извлечен с использованием коммерчески доступные системы. Интерферирующим плазмы были количественно методом на основе выборки RT-ПЦР анализа, которые содержит Мирна специфического праймера PCR реверса и зонд. Стандартные кривые для абсолютной количественной оценки были получены с помощью коммерчески доступных синтетические олигонуклеотиды РНК. Синтетический чел мир-238 был использован как внешнего управления для нормализации и качества оценки. Адаптивной, которые показали количественного определения цикла (Cq) значения выше 35 были предварительно усиливается до шаг ПЦР.
Среди 8 интерферирующим изучены мир-122, мир 133а и мир-192 были обнаруживаемыми без предварительного усиления, в то время как мир-1, мир-206 и мир 499a требуется предварительное усилители из-за их низкой выражение уровня. Мир 208А и мир 208В не было обнаружено даже после предварительного усиления. Пример обработки эффективность оценивалась по значениям Cq шипами чел мир-238. В этом методе анализа технические различия, по оценкам, будет меньше, чем 3 раза и нижний предел количественного определения (LLOQ) было 102 копии/мкл, для большинства обследованных адаптивной.
Этот протокол обеспечивает более точную оценку количества плазмы адаптивной и позволяет оценки качества соответствующих данных из различных исследований. Учитывая, что небольшое количество интерферирующим в жидкостях организма, предварительного усиления является полезным для улучшения обнаружения плохо выразил адаптивной.
Introduction
Все большее количество исследований изучает микроРНК (интерферирующим) в качестве биомаркеров для диагностики и прогноза рака, или мониторинг и обнаружение других заболеваний в доклинических и клинических исследований,1,2,3 . Количественные реального времени обратной транскрипции ПЦР (RT-ПЦР) является одним из наиболее распространенных методов, используемых для оценки отдельных целевых адаптивной, потому что этот метод является более чувствительным, чем microarray дна4 и РНК последовательности на основе платформы5. В общем Мирна выражение измеряется относительно эталонного образца, с помощью метода ΔCq6. Этот подход подходит для изучения физиологических изменений в целевые уровни выражения гена. Однако относительно количественной оценки циркулирующих интерферирующим ограниченную полезность из-за их малого количества. Кроме того технические изменения делает его трудно сравнивать результаты различных исследований, потому что различные лаборатории настроить RT-ПЦР экспериментальные протоколы по-разному, что приводит к несовместимым или даже противоречивые результаты от 7различные исследования.
С учетом проблем, упомянутых выше абсолютной количественной оценки может быть более подходящим для оценки небольших количествах интерферирующим в жидкостях организма. Метод количественной оценки абсолютной использует калибровочной кривой, созданный из известных концентрациях синтетические олигонуклеотиды РНК, которые идентичны в последовательности, соответствующей целевой Мирна8. Здравоохранения и экологических наук Институт (HESI) технический комитет по геномике недавно провели всеобъемлющие исследования для сравнения результатов абсолютных измерений интерферирующим плазмы, нескольких сайтах тест. Результаты показали, что использование стандартного протокола для абсолютной количественный интерферирующим показывают сопоставимые результаты через несколько сайтов тест9. RT-ПЦР анализа методом, описанным в настоящем исследовании практически идентичен HESI стандартный протокол, который включает мультиплексированных анализ нескольких целей Мирна и предварительного усиления помощи обнаружения низких выражение адаптивной.
В этом исследовании, фиксированного объема (200 мкл) ЭДТА-плазмы из крови собранные от бедренной вены обезьян Cynomolgus, получавших сознательного (n = 50) был используется10. Следующий протокол описывает процедуру для подготовки проб плазмы, добыча Мирна и RT-ПЦР, включая предварительное усилители. Что еще более важно дополнительную техническую информацию о протоколе была включена, так что количество целевых интерферирующим в пробах может быть проверен в сочетании с высококвалифицированных процесса. Во-первых стандартной кривой каждого Мирна был апробирован для его обнаружения отдельных диапазона до его количественной оценки в биологических образцах. Во-вторых качество нынешней методологии было всесторонне оценивать с помощью ов значения внешнего контроля (чел мир-238). Таким образом эта платформа дает более информативным и достоверных данных для сравнения результатов различных исследований или лаборатории.
Как представитель результаты в настоящем докладе были включены профили 8 интерферирующим от метода анализа, описанный здесь. Эти интерферирующим были предложены как потенциальной безопасности биомаркеров, связанные с повреждения тканей печени (мир-122 и мир-192), сердца (мир-1, мир 208А, мир 208В и мир 499a) и скелетных мышц (мир 133а и мир-206) в люди и грызунов в3, 11,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты были утверждены институциональный уход животных и использование Комитета Daiichi Санкё Co., Ltd.
1. Пробоподготовка
- Сбор крови (по крайней мере 0,5 мл) от бедренной вены обезьян Cynomolgus, получавших в 2K-содержащие ЭДТА трубы.
Примечание: Цитрата и гепарина не приемлемо потому, что эти антикоагулянты подавляют последующих ПЦР14,15. - Место собранные образцы сразу на льду и процесс для плазмы изоляции в течение 2 часов коллекции.
- Центрифугуйте образцы на 10000 x g при 4 ° C за 5 мин.
- Перенесите супернатант в 2 мл микропробирок, последующим центрифугированием в 16000 x g при 4 ° C за 5 мин для удаления мусора клеток и остаточные тромбоцитов.
Примечание: Количественная оценка интерферирующим могут быть затронуты существенно тромбоцитов загрязнение16. - Место 200 мкл аликвоты супернатант в свежий 2 мл пробирок и хранить при температуре-80 ° C до использования.
Примечание: Фиксированный объем каждого образца используется для извлечения РНК; Таким образом объем Алиготе должен быть точным.
2. РНК добыча
- Оттепель замороженных образцов на льду (с шагом 1,5).
- Держите образец холодный на льду во время извлечения РНК. Chill лизис реагента и метилхлороформа на льду до использования.
- Добавьте 5 томов (1000 мкл) лизис реагента, содержащий монофазные раствор фенола и гуанидина Изотиоцианаты, на пример (200 мкл) и смесь энергично, vortexing за 1 мин.
- 5 мкл 5 Нм синтетических Мирна Caenorhabditis elegans (Syn чел мир-238-3 p).
- Добавление 1 (200 мкл) количества метилхлороформа и смесь энергично, vortexing за 1 мин.
- Держите на льду для 2-3 мин, а затем Центрифугуйте образцы на 12000 x g при 4 ° C на 15 мин.
- Передать водяной участок тщательно новой микропробирок.
Примечание: Не передавать любые органические фазы (красный) или межфазовые изолирующие (белый). Объем водной фазы сбора должны быть единообразными чтобы избежать непоследовательности, что приводит к увеличению технических вариантов обработки. Обычно количество водной фазы, переведены в этот протокол был 650 мкл. - Добавить 1,5 томов (975 мкл) этанола и смешайте хорошо закупорить вверх и вниз.
- Передача образцов в соответствующий столбец и адаптер, а затем вакуумной сушки на 3 мин, с использованием вакуумных коллекторов. Если объем образца является более чем 700 мкл, повторите этот шаг, чтобы обработать оставшийся раствор.
Примечание: На основе столбцов РНК изоляция совместимы с методом вакуум и центрифугирования. - Добавьте 200 мкл этанола в столбце, следуют вакуумной сушки за 1 мин.
- 800 мкл буфера RWT, в столбце, а затем вакуумной сушки на 2 мин.
- 800 мкл буфера НПП, в столбце, а затем вакуумной сушки на 2 мин.
- Повторите шаг 2.11.
- Добавьте 300 мкл этанола в столбце, следуют вакуумной сушки за 1 мин.
- Поместите колонки на новой Микропробирка и центрифуги на 12000 x g при комнатной температуре (15-25 ° C) 1 мин.
- Передать новый Микропробирка столбец и добавьте 50 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
- Постоять при комнатной температуре (15-25 ° C) 3 мин и центрифуги на 8000 × g при комнатной температуре (15-25 ° C) 1 мин.
- Повторно примените элюата к столбцу.
- Повторите шаг 2.16 и хранить элюата-80 ° c до использования.
3. синтез cDNA
- Оттепель замороженных образцов (из шага 2.18).
-
Подготовьте известной концентрации синтетические олигонуклеотиды РНК, которые соответствуют целевой адаптивной.
- Использование синтетических РНК олигонуклеотида для генерации калибровочной кривой в ПЦР. Стоковый раствор 1 x 108 копия/мкл концентрации готовится для целей хранения.
- Разбавьте раствор 10 раз для получения 1 x 107 копирования/мкл (не предварительно усиленный образцы) или 1 x 105 копирование/МКЛ (предварительно усиленный образцы) рабочий раствор как самая высокая концентрация для построения калибровочной кривой. В общем предлагаемый диапазон для стандартной кривой концентрации — 1 x 10-7 до 1 x 102 копии/мкл (не предварительно усиленный образцы) или 1 x 10-5 до 1 x 100 копия/мкл (предварительно усиленный образцы).
- Подготовьте мультиплекс RT грунтовка бассейн, смешивая равных объемах 20 x RT Праймеры для целевых адаптивной.
Примечание: Как показано на рисунке 2, бассейн, содержащие до 4 Цель адаптивной могут быть сделаны смешивания 20 x RT праймеры каждого из интерферирующим в бассейне. Чел мир-238 (внешнего управления) должны быть включены в качестве одного из целевых интерферирующим в каждой тюбике. В случае менее 4 Цель адаптивной добавьте равных объемах 1/10 TE буфера вместо 20 x RT грунтовка. - Подготовьте смесь реакции RT: 3 мкл RT грунтовка Бильярд (из шага 3.3), 0,15 мкл дНТФ 100 мм с dTTP, 1 мкл обратной транскриптазы (50 U/мкл), 1.5 мкл 10 x буфер RT, 0.19 мкл АБС битор РНКазы (20 U/мкл) и 4.16 мкл нуклеиназы свободной воды.
- Смесь 10 мкл реакции RT смешать с 5 мкл пример РНК (из шага 3.1) или олигонуклеотиды (из шага 3.2), закупорить и инкубировать на льду на 5 мин.
- Запуск обратной транскрипции на аппарат тепловая велосипедист: 16 ° C в течение 30 мин, 42 ° C в течение 30 мин, следуют окончательный обратной транскриптазы инактивации шаг на 85 ° C за 5 мин обратной транскрипции образцов магазина-80 ° c до использования.
4. Предварительное усиление (опционально)
Примечание: Адаптивной, которые показывают значения Cq выше 35 или более последующих ПЦР предварительно усиливается.
- Оттепель замороженных образцов (из шага 3.6).
- Сделать десятикратного серийных разведений RT продукта от синтетические олигонуклеотиды РНК; 1 х 105 0 1 x 10 копирования/мкл для генерации калибровочной кривой.
- Подготовиться мультиплекс пробирного грунтовка бассейн смешиванием равных объемах (5 мкл) 20 x пробирного грунтовки целевой интерферирующим с конечной концентрации каждого пробирного грунт, будучи разбавленным кратное буфером TE окончательный объем 1000 мкл.
Примечание: Пробирного грунты, чья цель адаптивной может быть обнаружено в последующих ПЦР без предварительного усиления и те, для чел мир-238 (внешнего управления) не включены в грунт бассейн. - Подготовка предварительного усиления реакции микс: 12,5 мкл 2 x готовых к использованию идиомой реагента, 3,75 мкл пробирного грунтовка пула (от шага 4.3) и 6,25 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
- Mix 22,5 мкл предварительное усиление реакции смешать с 2,5 мкл обратной транскрипции образца (от шага 4.1) или олигонуклеотиды (из шага 4.2), закупорить и инкубировать на льду на 5 мин.
- Запуск реакции на аппарат тепловая велосипедист: 95 ° C в течение 10 минут; После 12 циклов 95 ° c на 15 s-60 ° C в течение 4 минут хранить предварительно усиленный образцов-80 ° c до использования.
5. Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР)
- Оттепель замороженных пробах (шаг 3,6 или шаг 4.6).
- 5 раз развести образцы стерильной водой.
- Подготовить десятикратного серийных разведений RT продукт, полученный из синтетические олигонуклеотиды РНК; 1 x 10-7 до 1 x 102 копии/мкл (не предварительно усиленный образцы) или 1 x 10-5 до 1 x 100 копия/мкл (предварительно усиленный образцов) для создания стандартных кривых.
- Подготовьте смесь реакции ПЦР: 10 мкл 2 x готовых к использованию амплификации реагента, 1 мкл 20 x пробирного реагента, содержащий реверса праймера PCR и соответствующий целевой Мирна, зонд и 7 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
- Передача 18 мкл из смеси реакции ПЦР на тарелки быстро оптических 96-луночных реакции и 2 мкл разбавленного образцов (от шаг 5.2 или шаг 5.3) в скважинах.
Примечание: Образцы и стандарты для ПЦР в задаются дубликаты. - Печать пластины с липкой пленкой и кратко центрифуги.
- Запуск реакции на реальном времени тепловая велосипедист: 95 ° C 20 s, а затем 45 циклов 95 ° c 1 s и 60 ° C для 20 s.
6. анализ данных
- Вычислите сырья копировать количество каждого образца, используя программное обеспечение для анализа данных, которая работает с соответствующего реального времени тепловая велосипедист.
Примечание: Линия порог устанавливается вручную для «1.0» в всех плит в исследовании, для подтверждения воспроизводимость по сравнению с их vales Cq. Пороговый уровень установлен на Cq > 40 циклов. - Вычислить среднее количество сырой копии каждого образца из дубликатов.
- Вычислить поправочный коэффициент путем деления копировать количество чел мир-238 в каждом образце в среднем копировать количество чел мир-238 от всех образцов в соответствующую трубку.
Примечание: Как показано на рисунке 2, каждая трубка содержит до 4 Цель адаптивной, включая чел мир-238 (внешний элемент). Таким образом поправочный коэффициент рассчитывается для каждой трубы, используя соответствующее значение чел мир-238. - Вычислить число скорректированных копирования путем деления числа усредненной сырой копии каждого образца (от шаг 6.2), поправочный коэффициент (от шаг 6.3) для каждого образца.
- Вычислить число абсолютной копией, умножив число скорректированных сырой копии каждого образца (с шагом 6,4) коэффициент разрежения для каждого образца.
Примечание: Коэффициент разрежения является «5» в настоящем Протоколе, который является производным от шаг 5.2. - Расчет эффективности амплификации PCR от склона участка ов значений для каждого последовательного растворения против журнала cDNA концентрации.
Примечание: Формула для расчета эффективности; E = (10(-1/склон) -1) x 100%. - Рассчитать технических вариантов, с помощью значения Cq чел мир-238 от всех образцов, используя формулу E = (2 x усиления эффективности)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
Примечание: Шаги 6.5 и 6.7 используются для оценки качества процедуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рабочий процесс анализа Мирна, RT-ПЦР и оценкой качестваt
Рисунок 1 показывает процесс Мирна пробирного из образцов крови с помощью ПЦР10. Можно проверить качество экспериментов, включая чел мир-238 как внешний элемент управления. Это покажет технические изменения в РНК добыча и последующих RT-ПЦР процессов. В этом исследовании среднее ± SD Cq значений вычисляется из 50 образцов был 21.0 ± 0,4 (Таблица 1). Если из-за предварительного усиления шаг был разбавлен чел мир-238, Cq значение было 24.2 ± 0,4 (Таблица 1). В методе анализа, описанный здесь масштабы технических вариантов составляла менее чем 3 раза на основании различий в значениях Cq. Степень изменения остались последовательной даже тогда, когда дополнительные предварительного усиления шаг должен был быть включены. Эти значения являются совместимыми с таковыми для других образцов из разных видов животных, таких как мышей, крыс и людей выполняются в этой лаборатории (данные не показаны).
Обнаруживаемая варьируются от стандартной кривой для целевой Мирна
Нет предварительного усиления образцов
Обратной транскрипции (RT) продукт от синтетические олигонуклеотиды РНК в концентрациях от 1 x 10-7 копирования/мкл серийно разводили до последующих ПЦР. Эти серии были использованы для создания стандартной кривой, которая обеспечивает последовательное освещение всех биологических образцов, которые были обнаруживаемыми без предварительного усиления шаг. Cq значения стандартного образца в концентрации 1 x 102 копии/мкл были обычно недалеко от cut off уровней для каждого целевого Мирна. Таким образом предел обнаружения составляла 1 x 102 копии/мкл (рис. 3).
Предварительно усиленный образцов
Чтобы определить поддающиеся обнаружению диапазон образцов, требующих предварительного усиления, были сопоставлены два разных серий разреженных образцов, как показано на рисунке 4. Для создания стандартной кривой A, были подготовлены серийных разведений RT продукта до предварительного усиления шаг. Затем ряд предварительно усиленный стандартов были использованы для последующих ПЦР. Для создания стандартной кривой B, первая разрежения был сделан из предварительно усиленный образцов до концентрации 1 х 105 копирование/мкл. Эти стандартные кривые показали видимо различных обнаружения пределов (рис. 5). Хотя стандартная кривая B показал линейный диапазон увеличения до 1 копия/мкл, калибровочной кривой A не могут использоваться для конкретных ампликонов в концентрациях менее 102 или 103 копии/мкл (рис. 5). Этот результат предложил, что очень малые количества интерферирующим невозможно оценить даже с предварительного усиления шаг. Кроме того, предварительно усиленный образцы должны толковаться тщательно когда Cq значения > 30, потому что пределов обнаружения предварительно усиленный образцов были близко к этому значению. Поэтому, как правило стандартная кривая B был использован в метод, описанный здесь, после определения обнаружению диапазон, только для того, чтобы избежать использования недостаточное количество стандартных участков.
Следовательно нижний предел количественного определения (LLOQ) был 102 копии/мкл для большинства интерферирующим (рис. 3 и рис. 5). Только мир-1 показан выше LLOQ (103 копии/мкл) (Рисунок 5). Среднее усиление эффективности был примерно 90%, коэффициент корреляции (R2) от 0,998 до 1.000 стандартных кривых. Отличительными чертами Точная assay RT-ПЦР считаются линейной R2 равен или больше, чем 0,98 и эффективности амплификации PCR от 90 до 110%17. Таким образом проверялось качество стандартных кривых в assay.
Эффекты предварительного усиления для небольших количеств адаптивной
Адаптивной, которые показали значения Cq выше 35 или выше в последующих ПЦР были предварительно усиливается. Эта процедура Улучшено обнаружение интерферирующим в небольших количествах. Например значения Cq (среднее ± SD) не pre усиливается мир-206 был 37.9 ± 1,9, а предварительно усиленный мир-206 снизилась до 27,0 ± 2,2. В образцы не pre усиливается при высоких значениях Cq (рис. 6) наблюдались существенные различия между парами повторяющихся измерений. В противоположность этому, предварительно усиленный образцов показал почти равные значения в дубликаты (рис. 6). Эти результаты показали, что предварительное усиление будет эффективным для предоставления более точных и надежных данных в случае небольших количеств проб.
Профилирование из плазмы интерферирующим у обезьян cynomolgus
Используя платформу установленных пробирного, плазменные уровни 8 интерферирующим (мир-1, мир-122, мир 133а, мир-192, мир-206, мир 208А, мир 208В и мир 499a) от 50 cynomolgus, что обезьяны были проанализированы (рис. 7)10. В этот assay мир-122, мир 133а и мир-192 были обнаруживаемыми без предварительного усиления, в то время как мир-1, мир-206 и мир 499a требуется предварительное усилители из-за их низкой выражение уровня. Однако мир 208А ни мир 208В было обнаружено даже с предварительного усиления. Данные не были распределены обычно; Таким образом логарифмическая трансформация была выполнена для вычисления их среднего и стандартного отклонения. Среди интерферирующим обследованных, мир-122 показали высокий уровень означает плазмы (5,71 х 104 копия/мкл), с небольшой динамическим диапазоном (20 раз). В отличие от больших динамических диапазонов наблюдались для мир-1 (581-fold), мир 133а (971-fold) и мир-206 (426-fold).
Рисунок 1 : Схема рабочего процесса Мирна пробирного по RT-ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Схема рабочего процесса обратной транскрипции Мирна пробирного. Бассейн, содержащие до 4 Цель адаптивной могут быть сделаны смешивания 20 x RT праймеры каждого из интерферирующим в бассейне. Чел мир-238 (внешнего управления) должны быть включены в качестве одного из целевых интерферирующим в каждой тюбике. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| анализ данных мир-238 | ||
| Без Предварительное усиление |
С Предварительное усиление |
|
| N | 50 | 50 |
| Среднее | 21,0 | 24.2 |
| SD | 0.4 | 0.4 |
| Макс Cq | 21,8 | 25.3 |
| Cq мин | 20.3 | 23.5 |
| Медиана | 21,0 | 24.2 |
| Макс мин | 1.3 | 1.8 |
| Усиления эффективности | 89 | 89 |
| Вариация | 2.4 | 2.8 |
Таблица 1: Оценка качества, с использованием количественного определения цикла (Cq) значений чел мир-238. Технические варианты были оценены из значения ов мир-238 в каждом assay. Пятьдесят образцы были разделены на две группы, соответствующее с (справа) или без (слева) шаг до амплификации. Вариация была рассчитана с использованием формула E = (2 x усиления эффективности)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). Усиления эффективности рассчитывался от склона калибровочной кривой. Образцы, требующих предварительного усиления шаг разводили на этапе предварительного усиления (мир-238, сам не был предварительно усиленный). Эта цифра была изменена от нашего отчет10.
Рисунок 3 : Участок стандартных кривых для не pre усиливается образцов. Стандартные кривые (N = 3, повторяющиеся) были получены путем построения журнала концентрации по сравнению с Cq. Линейный регрессионный анализ был рассчитан для определения склон, который соответствует эффективности амплификации. Стандарт кривые для мир-122 (верхний), мир-192 (посередине) и мир 133а (нижний) показал линейной зависимости между Cq и концентрация на проверенных диапазоне. В стандартных кривых погрешностей представляют одно стандартное отклонение от трех независимых анализов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Процедура для создания стандартных кривых для образцов, предварительно усиленный. (Калибровочной кривой A) Представитель концентрацию синтетических oligo (1 х 105 копирование/мкл) был обратной транскрипции, следуют подготовки десятикратного серийный разрежения серии стандартного образца. Эти предварительно усиленные стандарты были использованы для последующих ПЦР. (Калибровочной кривой B) Представитель концентрацию синтетических oligo (1 х 105 копирование/мкл) был обратной транскрипции и предварительно усиливается. Затем десятикратного последовательного растворения серии стандартных образцов были подготовлены до последующих ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Сюжет стандартных кривых A и B для образцов, предварительно усиленный. Калибровочной кривой A (n = 1, повторяющиеся) и стандартной кривой B (n = 3, повторяющиеся) были получены путем построения журнала концентрации по сравнению с Cq. Линейный регрессионный анализ был рассчитан для определения склон, который соответствует эффективности амплификации. (Верхняя) Калибровочной кривой (пунктирная линия) показали видимо неспецифической ампликон в 1 x 10-2 копии/мкл, тогда как стандартной кривой B (сплошная линия) показал линейной зависимости между Cq и концентрация на проверенных спектр мир-1. (Средний и ниже) Калибровочной кривой (пунктирная линия) показал не ампликон при концентрациях2 копии/мкл 1 x 10 или ниже, тогда как стандарт кривая B (сплошная линия) показал линейной зависимости между Cq и концентрация на проверенных спектр мир 499a и Мир-206. В стандартной кривой B погрешностей представляют одно стандартное отклонение от трех независимых анализов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Участок усилители для не pre усиливается и предварительно усиленный образцов. (Верхняя) амплификации сюжета мир-206 в репрезентативных выборок (A, B, C) без (верхний), или с предварительного усиления (нижний). Измерения были созданы в двух экземплярах. Существуют различия между двумя образцами как дубликаты в образцах, не pre усиливается, особенно в более высоких образцов Cq (A и B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Абсолютное значение микроРНК (интерферирующим) плазмы в обезьян cynomolgus. Уровни выражения интерферирующим представлены точка участков. Средняя и значение для двух стандартных отклонения ниже и выше среднего (показан в серой коробке), были определены после логарифмического преобразования. Эта цифра была изменена от нашего отчет10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нашей всеобъемлющей оценки представила более строгий статистический анализ степени динамического диапазона, который четко указал, что масштабы различия между отдельными пробами очень разные среди интерферирующим испытания. Хотя эти различия можно объяснить их небольших количествах в жидкостях организма, следует отметить, что эти данные отражают не только биологические различия, но и технические изменения. Большинство технических вариантов может быть оценена с помощью ов значения внешнего контроля (чел мир-238), который используется в других платформах пробирного18. Поскольку в Мирна анализа было нет стандартизированных механизмов внутреннего контроля, информацию о технических вариантов должны включаться в анализ для определения качества пробирного19. Технические изменения, по оценкам, будет меньше, чем 3 раза в метод, описанный в настоящем докладе. Хотя это не возможно определить уровень качества для этой процедуры из-за отсутствия сопоставимых технической информации в других исследованиях, включая такую информацию, способствует повышению надежности и обеспечивает совместимость между различные исследования.
Ряд недавних документов сообщили, что различные предварительно аналитических переменных, таких как пробами, условий хранения и длительность хранения перед обработкой может повлиять на надежность и воспроизводимость циркулирующих Мирна измерений20 , 21. Хотя это исследование не учитывают последствия предварительного аналитического переменных, следующие шаги были тщательно следили за во время подготовки проб к минимуму вариации. Во-первых чтобы свести к минимуму эффект стабильности интерферирующим в плазме8,22кратчайшие сроки (в течение 2 часов после сбора) было обработано плазмы. Хотя считается, что интерферирующим при комнатной температуре (15-25 ° C), до сих пор неясно ли интервал между крови сбора и обработки плазме или сыворотке влияет на уровни Мирна. Во-вторых каждый образец плазмы визуально был проинспектирован по ликвидации аналитической предвзятости, обусловленной загрязнение Опаковые красных кровяных клеток, который представляет собой один из отягощающих факторов, которые могут повлиять на уровень циркулирующих интерферирующим23.
Предварительное усиление полезны для улучшения обнаружения чрезвычайно малые количества интерферирующим в biofluids без введения обнаружения смещения24. В настоящем исследовании Cq значения стандартных кривых, построенный с помощью предварительно усиленный синтетические олигонуклеотиды показали высокую воспроизводимость через анализов. Это позволило абсолютной количественный, используя предварительно усиленный образцов, которые включено обнаружение интерферирующим в небольших количествах. С другой стороны низкая копирования число стандартов (1 x 10-2 или 103 копии/мкл) не показывают конкретные ампликонами, в сочетании с предварительно амплификации. Местдагом и др. 24 сообщили измерения низких копии номер интерферирующим показали выше изменения после процедуры предварительного усиления, по сравнению с средней или высокой копии номер адаптивной, из-за низкой эффективности обратной транскрипции, которая может быть результатом Мирна характеристики последовательности. Таким образом дальность обнаружения стандартных кривых для каждого Мирна должны быть проверены до количественной оценки биологических проб, особенно для предварительно усиленный адаптивной, чтобы устранить ложно положительных результатов. Что еще более важно необходимо отметить, что абсолютных уровней по-разному обработанные интерферирующим такие образцы предварительно усиливается и не pre усиливается нельзя сравнивать напрямую, потому что количество предварительно усиленный образца не указан в каждом Мирна.
Этот доклад описывает процедуру для определения абсолютной Мирна уровней в образцах плазмы с помощью RT-ПЦР. Даже после предварительного усиления не были обнаружены некоторые адаптивной. Для обнаружения таких низких выражение адаптивной, другой подход могут и должны использоваться. Хотя с помощью большего количества образца может обойти эту проблему, как простое решение, большое количество образцов не всегда доступны. На сегодняшний день, технологические достижения позволили развития различных платформ для профилирования25,26Мирна. Капелька цифровой ПЦР (ddPCR) была разработана недавно и предлагает альтернативный метод для обычных RT-ПЦР для количественного определения абсолютной. Сообщается, что эта инновационная технология быть точным, воспроизводимые и чувствительных метод, который может обнаружить цель Мирна на уровнях 1 копия/мкл27,28. Если ddPCR можно обнаружить низкой концентрации интерферирующим без предварительного усиления шаг, было бы большим преимуществом, потому что уровни нескольких интерферирующим можно сравнить друг с другом. Изменения в процедуры извлечения и последующих RT-ПЦР, молекулярные платформы и реагенты используемые неизбежно принесет различные результаты. Однако эти вариации может быть решен, если прозрачный результаты внешнего контроля и абсолютные уровни для отдельных интерферирующим предоставляются. Надлежащего качества оценки метода является ключом к улучшению проницательность биологических изменений в Мирна, профилирование исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор не имеет никакого конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Это исследование не получил каких-либо конкретных грант от финансирующих учреждений в государственных, коммерческих, или не для некоммерческих секторах.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | - | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
