Summary
Este relatório descreve um protocolo para medir os níveis absolutos de plasma miRNA, usando quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR com ou sem pré-amplificação. Este protocolo permite melhor entendimento da quantidade de plasma miRNAs e permite a avaliação qualitativa da correspondentes dados de diferentes estudos ou laboratórios.
Abstract
RT-qPCR é um dos métodos mais comuns para avaliar os miRNAs destino individual. Níveis de MiRNAs são geralmente medidos em relação a uma amostra de referência. Esta abordagem é apropriada para examinar as alterações fisiológicas em níveis de expressão de gene alvo. No entanto, quantificação absoluta usando melhor análise estatística é preferível para uma avaliação global dos níveis de expressão do gene. Quantificação absoluta é ainda não de uso comum. Este relatório descreve um protocolo para medir os níveis absolutos de plasma miRNA, usando RT-qPCR, com ou sem pré-amplificação.
Um volume fixo (200 µ l) de plasma-EDTA foi preparado a partir do sangue coletado da veia femoral de macacos cynomolgus consciente (n = 50). O RNA total foi extraído utilizando sistema comercialmente disponível. Plasma miRNAs foram quantificados por ensaios de RT-qPCR sonda-based, que contém a sonda e a primeira demão PCR de avanço/retrocesso miRNA-específica. Curvas padrão para quantificação absoluta foram geradas usando oligonucleotides de RNA sintéticos disponíveis comercialmente. Um sintético cel-miR-238 foi usado como um controle externo para avaliação de normalização e qualidade. Os miRNAs que mostrou a quantificação ciclo (Cq) valores acima de 35 foram pre-amplificados antes da etapa de qPCR.
Entre os 8 miRNAs examinados, 122-miR, miR-133a e miR-192 foram detectáveis sem pré-amplificação, Considerando que miR-1 e miR-206 miR-499a pré-amplificação por causa de seus níveis baixos de expressão. MiR-208a e miR-208b não foram detectáveis mesmo após pré-amplificação. Eficiência de processamento da amostra foi avaliada pelos valores da cel-miR-238 cravado de Cq. Neste método de ensaio, variação técnica foi estimada em menos de 3 vezes e o limite inferior de quantificação (LLOQ) foi 102 cópia / µ l, para a maioria dos miRNAs examinadas.
Este protocolo fornece uma melhor estimativa da quantidade de plasma miRNAs e permite a avaliação da qualidade de correspondentes dados de diferentes estudos. Considerar que o baixo número de miRNAs em fluidos corporais, pré-amplificação é útil para realçar a deteção de mal expressa miRNAs.
Introduction
Um número crescente de estudos foram explorar microRNAs (miRNAs) como biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico de câncer, ou monitoramento e detecção de outras doenças em estudos clínicos e adequado1,2,3 . Quantitativo em tempo real transcrição reversa PCR (RT-qPCR) é um dos métodos mais comuns utilizados para avaliar os miRNAs destino individual, porque esta técnica é mais sensível do que microarray4 e sequenciamento de RNA baseiam plataformas5. Em geral, expressão de miRNA é medido em relação a uma amostra de referência usando o método de ΔCq6. Esta abordagem é apropriada para investigar mudanças fisiológicas nos níveis de expressão de gene alvo. No entanto, quantificação relativa de miRNAs em circulação tem limitado utilitário por causa de suas pequenas quantidades. Além disso, variação técnica torna difícil comparar os resultados de estudos diferentes, porque diferentes laboratórios personalizar os protocolos experimentais RT-qPCR diferente, que leva a inconsistente ou contraditório mesmo resulta da diferentes estudos7.
Tendo em conta as preocupações acima mencionadas, a quantificação absoluta pode ser mais adequada para a avaliação das quantidades pequenas de miRNAs em fluidos corporais. O método de quantificação absoluta usa uma curva padrão gerada a partir de concentrações conhecidas de oligonucleotides RNA sintéticos idênticos em sequência ao destino correspondente miRNA8. A saúde e a Comissão técnica do Instituto de ciências ambientais (HESI) na genômica recentemente conduziram estudos abrangentes para comparar os resultados de medições absolutas de plasma miRNAs, através de vários sites de teste. Os resultados mostraram que usando um protocolo padrão para a quantificação absoluta de miRNAs produziu resultados comparáveis entre os múltiplos de sites teste9. O método de ensaio de RT-qPCR descrito no presente estudo é quase idêntico ao protocolo padrão do HESI, que inclui análise multiplexada de múltiplos alvos de miRNA e pré-amplificação para auxiliar a detecção de baixa expressão miRNAs.
Neste estudo, um volume fixo (200 µ l) de plasma-EDTA preparada a partir do sangue coletado da veia femoral de macacos cynomolgus consciente (n = 50) foi utilizado10. O protocolo seguinte descreve o procedimento para a preparação de amostras de plasma, extração de miRNA e RT-qPCR, incluindo pré-amplificação. Mais importante ainda, informações técnicas adicionais sobre o protocolo foi incluídas, para que a quantidade de alvo miRNAs nas amostras pode ser validada em combinação com um processo bem qualificado. Primeiro, a curva padrão de cada miRNA foi validada para a sua gama de deteção individuais, antes da sua quantificação, em amostras biológicas. Em segundo lugar, a qualidade da metodologia atual foi exaustivamente avaliada através de valores de Cq de um controle externo (cel-miR-238). Portanto, esta plataforma produz dados mais informativos e confiável para comparar resultados de diferentes estudos ou laboratórios.
Os perfis dos 8 miRNAs foram incluídos neste relatório como resultados representativos do método de ensaio descrito aqui. Estes miRNAs têm sido propostos como potenciais biomarcadores de segurança associados a lesões de tecidos para o fígado (miR-122 e miR-192), coração (miR-1, miR-208a, miR-208b e miR-499a) e o músculo esquelético (miR-133a e miR-206) em roedores e humanos3, 11,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Daiichi Sankyo co., Ltd.
1. preparação da amostra
- Colete sangue (pelo menos de 0,5 mL) da veia femoral de macacos cynomolgus em tubos de 2K-contendo EDTA.
Nota: Citrato e heparina não são aceitáveis porque estes anticoagulantes inibem subsequente PCR14,15. - Coloca as amostras coletadas imediatamente sobre o gelo e o processo de isolamento do plasma dentro de 2 horas de coleção.
- Centrifugar as amostras a 10.000 x g a 4 ° C por 5 min.
- Transferi o sobrenadante para um microtubo de 2 mL, seguido de centrifugação a 16.000 x g a 4 ° C por 5 min remover os restos de células e plaquetas residuais.
Nota: Quantificação dos miRNAs pode ser afetada significativamente por plaquetas contaminação16. - Coloque 200 alíquotas µ l do sobrenadante no frescos 2 mL-microtubos e armazene a-80 ° C até o uso.
Nota: Um volume fixo de cada amostra é utilizado para extração de RNA; Portanto, o volume da alíquota deve ser exato.
2. extração do RNA
- Descongele as amostras congeladas no gelo (da etapa 1.5).
- Não deixar amostra no gelo durante a extração do RNA. Refrigere o reagente de Lise e clorofórmio na prévia de gelo para usar.
- Adicione 5 volumes (1000 µ l) de reagente de Lise, contendo solução monofásica de isotiocianato de fenol e de guanidina, para a amostra (200 µ l) e misture vigorosamente num Vortex durante 1 min.
- Adicionar 5 µ l de 5 nM sintético miRNA Caenorhabditis elegans (Syn-cel-miR-238-3 p).
- Adicionar 1 volume (200 µ l) de clorofórmio e misture vigorosamente num Vortex durante 1 min.
- Fique no gelo durante 2 a 3 min e centrifugar as amostras a 12.000 x g a 4 ° C por 15 min.
- Transferi a fase aquosa com cuidado para um microtubo de novo.
Nota: Não transfira a fase orgânica (vermelho) ou interfase (branco). O volume da fase aquosa recolhida deve ser uniforme para evitar a inconsistência, o que resulta em maior variação de técnica de manipulação. A quantidade habitual de fase aquosa transferido neste protocolo foi 650 µ l. - Adicione 1,5 volumes (975 µ l) de álcool etílico e misture bem pipetando para cima e para baixo.
- Transferi a amostra para uma coluna correspondente e adaptador, seguido de secagem a vácuo para 3 min usando Manifold. Se o volume da amostra é mais de 700 µ l, repita este passo para processar o restante da solução.
Nota: Isolamento de RNA baseado na coluna é compatível com o método de vácuo e centrifugação. - Adicione 200 µ l de etanol para a coluna, seguida de secagem a vácuo por 1 min.
- Adicione 800 µ l de tampão de RWT à coluna, seguida de secagem a vácuo por 2 min.
- Adicione 800 µ l de tampão de RPE para a coluna, seguida de secagem a vácuo por 2 min.
- Repita a etapa 2.11.
- Adicione 300 µ l de etanol para a coluna, seguida de secagem a vácuo por 1 min.
- Coloque a coluna para um microtubo de novo e centrifugar a 12.000 x g, à temperatura ambiente (15 a 25 ° C) por 1 min.
- Transferir a coluna para um microtubo de novo e adicionar 50 µ l de água livre de nuclease.
- Ficar à temperatura ambiente (15 a 25 ° C) por 3 min e centrifugar 8.000 × g, à temperatura ambiente (15 a 25 ° C) por 1 min.
- Re-aplica o eluato à coluna.
- Repita a etapa 2.16 e armazenar eluído a-80 ° C até o uso.
3. síntese de cDNA
- Descongele as amostras congeladas (da etapa 2.18).
-
Prepare uma concentração conhecida de oligonucleotides sintéticos do RNA que correspondem ao alvo miRNAs.
- Use sintético do oligonucleotide do RNA para a geração de uma curva padrão em qPCR. Solução de concentração de cópia / µ l 1 x 108 está preparada para fins de armazenamento.
- Dilua a solução-mãe 10-fold para obter 1 x 107 cópia / µ l (não pre-amplificadas amostras) ou solução de trabalho de cópia / µ l (amostras pre-amplificadas) 1 x 105 como a concentração mais elevada para a construção da curva padrão. Em geral, um intervalo sugerido para as concentrações da curva padrão é 1 x 107 a 1 x 102 cópia / µ l (não pre-amplificadas amostras) ou 1 x 105 a 1 x 100 cópia / µ l (pre-amplificadas amostras).
- Prepare-se piscina de cartilha multiplex RT misturando volumes iguais de 20 x RT as primeiras demão para miRNAs alvo.
Nota: Conforme mostrado na Figura 2, uma piscina que contém até 4 miRNAs alvo pode ser feita misturando os primers de RT 20 x de cada um dos miRNAs na piscina. Cel-miR-238 (controle externo) deve ser incluído como um dos alvo miRNAs em cada tubo. Em caso de menos de 4 alvo miRNAs, adicione volumes iguais de buffer de TE 1/10 em vez de cartilha de RT x 20. - Preparar a mistura de reação de RT: 3 µ l de primer RT pool (da etapa 3.3), 0,15 µ l de dNTPs 100mm com dTTP, 1 µ l de transcriptase reversa (50 U / µ l), 1,5 µ l 10 x buffer de RT, 0,19 µ l de inibidor de RNase (20 U / µ l) e 4,16 µ l de nuclease-livre de água.
- Mix 10 µ l de reação de RT misturar com 5 µ l de amostra de RNA (da etapa 3.1) ou oligonucleotídeos (da etapa 3.2) pipetando e incubar no gelo por 5 min.
- Executar a transcrição reversa em um aparelho termociclador: 16 ° C por 30 min, 42 ° C por 30 min, seguido por uma etapa de inactivação final transcriptase reversa a 85 ° C por 5 min. amostras transcritas reversos de loja a-80 ° C até o uso.
4. preamplificação (opcional)
Nota: Os miRNAs que mostram valores de Cq acima de 35 ou mais em qPCR subsequente são pre-amplificados.
- Descongele as amostras congeladas (da etapa 3.6).
- Fazer 10 vezes diluições em série do produto RT de oligonucleotides sintéticos de RNA; 1 x 105 a 1 x 100 cópia / µ l para gerar a curva padrão.
- Preparar piscina de cartilha de ensaio multiplex misturando volumes iguais (5 µ l) de 20 x primeiras demão de ensaio para alvo miRNAs com a concentração final de cada primer de ensaio sendo diluído 200-fold pelo buffer TE em um volume final de 1.000 µ l.
Nota: Os primers de ensaio cujos destino os miRNAs podem ser detectáveis em qPCR subsequente sem pré-amplificação e os de cel-miR-238 (controle externo) não estão incluídos na piscina da primeira demão. - Preparar a mistura de reação de Pre-amplificação: 12,5 µ l de 2 x 6,25 µ l de água livre de nuclease, 3,75 µ l de piscina de cartilha do ensaio (da etapa 4.3) e reagente de pré-amplificação ready-to-use.
- Mix 22,5 µ l da reação de pré-amplificação misturar com 2,5 µ l de amostra transcrita reversa (da etapa 4.1) ou oligonucleotídeos (da etapa 4.2) pipetando e incubar no gelo por 5 min.
- Executar a reação em um aparelho termociclador: 95 ° C por 10 min; seguido por 12 ciclos de 95 ° C por 15 s e 60 ° C durante 4 min. armazenam amostras pre-amplificadas a-80 ° C até o uso.
5. quantitativo PCR em tempo real (qPCR)
- Descongele as amostras congeladas (do passo 3.6 ou 4.6).
- Diluir as amostras 5-fold com água estéril.
- Prepare-se 10 vezes diluições em série do produto RT derivado sintéticos oligonucleotides de RNA; 1 x 107 a 1 x 102 cópia / µ l (não pre-amplificadas amostras) ou 1 x 105 a 1 x 100 cópia / µ l (pre-amplificadas amostras) para a geração de curvas padrão.
- Preparar a mistura de reação de qPCR: 10 µ l de 2 x reagente de amplificação de ready-to-use, 1 µ l de reagente de ensaio, contendo a primeira demão do PCR e sonda correspondente ao alvo miRNA, avanço/retrocesso de 20x e 7 µ l de água livre de nuclease.
- Transferência de 18 µ l da mistura de reação de qPCR para as placas de reação rápido óptico de 96 poços e adicionar 2 µ l das amostras diluídas (de passo 5.2 ou 5.3) nos poços.
Nota: Amostras e padrões para qPCR são configurados em duplicatas. - A placa com a película adesiva do selo e centrifugar brevemente.
- Executar a reação em um termociclador em tempo real: 95 ° C por 20 s, seguido de 45 ciclos de 95 ° C por 1 s e 60 ° C durante 20 s.
6. análise de dados
- Calcule o número de cópia bruta de cada amostra utilizando o software de análise de dados que funciona com o correspondente termociclador em tempo real.
Nota: A linha de limite é definida manualmente como "1.0" em todas as placas no estudo, para confirmar a reprodutibilidade em comparação com os seus vales de Cq. Nível de interrupção é definido no Cq > 40 ciclos. - Calcule a média do número de cópia bruta de cada amostra de duplicatas.
- Calcule o factor de correcção, dividindo um número de cópia de cel-miR-238 em cada amostra pela média do número de cópia de cel-miR-238 de todas as amostras em um tubo correspondente.
Nota: Conforme mostrado na Figura 2, cada tubo contém até 4 alvo miRNAs incluindo cel-miR-238 (controle externo). Portanto, o fator de correção é calculado para cada tubo utilizando o valor correspondente do cel-miR-238. - Calcule o número de cópia ajustado, dividindo o número de cópia bruta média de cada amostra (do passo 6.2) pelo fator de correção (da etapa 6.3) para cada amostra.
- Calcular o número de cópia absoluta multiplicando o número de cópia bruta ajustada de cada amostra (do passo 6.4) pelo factor de diluição para cada amostra.
Nota: O fator de diluição é "5" no presente protocolo, que é derivado de passo 5.2. - Calcule as eficiências de amplificação por PCR de encosta da trama dos valores de Cq para cada diluição serial contra a concentração de cDNA de log.
Nota: Fórmula para calcular a eficiência; E = (10(-1/inclinação) -1) x 100%. - Calcular a variação de técnica usando os valores de Cq da cel-miR-238 de todas as amostras, usando a fórmula E = (eficácia de amplificação de 2 x)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
Nota: As etapas 6.5 e 6.7 são utilizadas para avaliação da qualidade do processo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluxo de trabalho de miRNA ensaio por RT-qPCR e qualidade assessment
A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho de miRNA ensaio de amostras de sangue usando qPCR10. A qualidade das experiências pode ser verificada por incluindo cel-miR-238 como um controle externo. Isto irá revelar variações técnicas de extração do RNA e RT-qPCR subsequente processos. Neste estudo, a média ± DP do Cq valores calculados a partir de 50 amostras foi 21,0 ± 0,4 (tabela 1). Se o cel-miR-238 foi diluída devido a etapa pré-amplificação, o valor de Cq foi 24,2 ± 0,4 (tabela 1). No método de ensaio descrito aqui, a extensão da variação técnica foi estimada em menos de 3 vezes baseado na diferença nos valores de Cq. O grau de variação ficou consistente, mesmo quando a etapa pré-amplificação adicional tinha que ser incluído. Esses valores são compatíveis com os de outras amostras de diferentes espécies animais, tais como ratos, ratos e seres humanos realizados neste laboratório (dados não mostrados).
Detectável variam de curva padrão para alvo miRNA
Sem pré-amplificação das amostras
O produto de (RT) transcrito reverso de oligonucleotides RNA sintéticos em concentrações de7 cópia de 1 x 10 / µ l foi serialmente diluído antes qPCR subsequente. Estas séries foram usadas para gerar a curva padrão, que garantiu a cobertura consistente de todas as amostras biológicas que eram detectáveis sem etapa pré-amplificação. Os valores de Cq da amostra-padrão na concentração de 1 x 102 cópia / µ l foram geralmente perto da corte níveis para cada alvo miRNA. Portanto, o limite de detecção foi estimado em 1 x 102 cópia / µ l (Figura 3).
Amostras pré-amplificadas
Para determinar o intervalo detectável de amostras que exigem pré-amplificação, foram comparadas duas diferentes séries de amostras diluídas, como ilustrado na Figura 4. Para gerar a curva padrão A, foram preparadas diluições em série do produto antes da etapa de pré-amplificação RT. Então a série de normas pre-amplificadas foram usada para qPCR subsequente. Para gerar a curva padrão B, a primeira diluição foi feita de amostras pre-amplificadas a uma concentração de 1 x 105 cópia / µ l. Estas curvas padrão mostraram limites aparentemente diferentes de detecção (Figura 5). Embora a curva padrão B mostrou gama linear de aumento até 1 cópia / µ l, curva padrão A não podia ser utilizada para amplicons específico em concentrações inferiores a 102 ou 103 cópia / µ l (Figura 5). Este resultado sugere que quantidades extremamente pequenas de miRNAs não podem ser avaliadas mesmo com etapa pré-amplificação. Além disso, as amostras pre-amplificadas devem ser interpretadas com cuidado quando os valores de Cq são > 30, porque os limites de detecção das amostras pre-amplificados foram perto para esse valor. Portanto, como regra, curva padrão B foi usada no método descrito aqui, depois de determinar o intervalo detectável, apenas para evitar o uso de número insuficiente de parcelas padrão.
Consequentemente, o limite inferior de quantificação (LLOQ) foi 102 cópia / µ l para a maioria dos miRNAs (Figura 3 e Figura 5). Só miR-1 mostrou uma maior LLOQ (103 cópia / µ l) (Figura 5). A eficiência de amplificação média era cerca de 90%, com o coeficiente de correlação (R2) das curvas padrão desde 0.998 até 1.000. As principais características de um ensaio de RT-qPCR preciso são consideradas um linear R2 igual ou superior a 0,98 e uma eficiência de amplificação do PCR de 90 a 110%17. Verificou-se, portanto, a qualidade das curvas padrão no ensaio.
Efeitos de pré-amplificação para pequenas quantidades de miRNAs
Os miRNAs que apresentaram valores de Cq acima de 35 ou superior em qPCR subsequente foram pre-amplificados. Este procedimento aprimorado a detecção de pequenas quantidades de miRNAs. Por exemplo, os valores de Cq (média ± DP) de miR-206 não pre-amplificados foi 37,9 ± 1,9, enquanto as da miR-206 pre-amplificado diminuiu para 27,0 ± 2.2. Foram observadas diferenças significativas entre pares de medição duplicados em amostras não pre-amplificados em altos valores de Cq (Figura 6). Em contraste, pre-amplificadas amostras mostraram valores quase iguais em duplicatas (Figura 6). Estes resultados indicaram que Pre-amplificação seria eficaz para fornecer dados mais precisos e confiáveis em casos de pequenas quantidades de amostras.
Criação de perfil de plasma miRNAs em macacos cynomolgus
Usando a plataforma de ensaio estabelecidas, os níveis plasmáticos de 8 miRNAs (miR-1, miR-122, 133a-miR, miR-192, 206-miR, miR-208a, miR-208b e miR-499a) de 50 cynomolgus macacos foram analisaram (Figura 7)10. Neste ensaio, 122-miR, miR-133a e miR-192 foram detectáveis sem pré-amplificação, Considerando que miR-1 e miR-206 miR-499a pré-amplificação por causa de seus níveis baixos de expressão. No entanto, miR-208a nem miR-208b foi detectável mesmo com pré-amplificação. Os dados não foram normalmente distribuídos; Portanto, realizou-se uma transformação logarítmica, para calcular a média e desvios-padrão. Entre os miRNAs examinados, miR-122 mostrou o mais alto nível de plasma média (5,71 x 104 cópia / µ l), com uma pequena faixa dinâmica (20 vezes). Em contraste, grandes intervalos dinâmicos foram observados para miR-1 (581-fold), miR-133a (971-fold) e o miR-206 (426-fold).
Figura 1 : Fluxo de trabalho esquemático de ensaio de miRNA por RT-qPCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Fluxo de trabalho esquemático da transcrição reversa de miRNA ensaio. Uma piscina que contém até 4 miRNAs alvo pode ser feita misturando os primers de RT 20 x de cada um dos miRNAs na piscina. Cel-miR-238 (controle externo) deve ser incluído como um dos alvo miRNAs em cada tubo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| análise de dados de miR-238 | ||
| Sem Pré-amplificação |
Com Pré-amplificação |
|
| N | 50 | 50 |
| Quer dizer | 21,0 | 24.2 |
| SD | 0.4 | 0.4 |
| Max Cq | 21,8 | 25,3 |
| Cq de min | 20.3 | 23.5 |
| Median | 21,0 | 24.2 |
| Max-Min | 1.3 | 1.8 |
| Eficácia de amplificação | 89 | 89 |
| Variação | 2.4 | 2.8 |
Tabela 1: avaliação de qualidade usando valores de ciclo (Cq) quantificação de cel-miR-238. Variações técnicas foram avaliadas a partir dos valores de Cq de miR-238 em cada ensaio. 50 amostras foram divididas em dois grupos correspondentes com (direita) ou sem (esquerda) a pré-amplificação etapa. Variação foi calculada usando a fórmula E = (eficácia de amplificação de 2 x)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). A eficácia de amplificação foi calculada a partir do declive da curva padrão. As amostras que exigem pré-amplificação passo foram diluídas durante a etapa de pré-amplificação (miR-238 em si não era pre-amplificados). Esta figura foi modificada em nosso relatório10.
Figura 3 : Parcela de curvas padrão para amostras não pre-amplificados. Curvas padrão (N = 3, duplicados) foram gerados por conspirar a concentração de registro contra Cq. Linear, análise de regressão foi computadorizada para determinar a inclinação, o que corresponde a eficiência de amplificação. Padrão curvas para miR-122 (superior), miR-192 (médio) e o miR-133a (inferior) mostraram uma relação linear entre concentração e Cq no intervalo testado. Nas curvas padrão, barras de erro representam um desvio padrão de três ensaios independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Procedimento para gerar curvas padrão para amostras pre-amplificadas. (Padrão curva A) Uma concentração representativa de oligo sintética (1 x 105 cópia / µ l) era a ré transcrito, seguido por prepara série de diluição serial 10 vezes da amostra-padrão. Estes padrões pre-amplificados foram usados para qPCR subsequente. (Curva padrão B) Uma concentração representativa de oligo sintética (1 x 105 cópia / µ l) era a ré transcrito e pre-amplificado. Em seguida, uma série de diluição serial 10 vezes de amostras-padrão foram preparadas antes da qPCR subsequente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Lote padrão das curvas de A e B para amostras pre-amplificadas. Curva padrão A (n = 1, duplicados) e curva padrão B (n = 3, duplicados) foram gerados por conspirar a concentração de registro contra Cq. Linear, análise de regressão foi computadorizada para determinar a inclinação, o que corresponde a eficiência de amplificação. (Superior) Curva padrão (linha pontilhada) mostrou aparentemente não-específica amplicon na cópia de 1 x 102 / µ l, Considerando que a curva padrão B (linha sólida) mostrou uma relação linear entre concentração e Cq no intervalo testado de miR-1. (Meio e inferior) Curva padrão (linha pontilhada) não mostrou nenhum amplicon em concentrações de 1 x 102 cópia / µ l ou inferior, Considerando que o padrão de curva B (linha sólida) mostrou uma relação linear entre concentração e Cq no intervalo de miR-499a testado e miR-206. Na curva padrão B, barras de erro representam um desvio padrão de três ensaios independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Amplificação trama para amostras não pre-amplificados e pre-amplificadas. (Superior) enredo de amplificação do miR-206 em amostras representativas (A, B, C) sem (superior), ou com pré-amplificação (inferior). As medições foram criadas em duplicado. Havia diferenças entre as duas amostras configurar como duplicatas em amostras não pre-amplificados, especialmente em maiores amostras de Cq (A e B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Valor absoluto de plasma microRNAs (miRNAs) em macacos cynomolgus. Os níveis de expressão dos miRNAs são representados por lotes do ponto. A média e o valor para dois desvios-padrão abaixo e acima da média (mostrado na caixa cinza), foram determinadas após uma transformação logarítmica. Esta figura foi modificada em nosso relatório10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nossa avaliação abrangente fornecido uma análise estatística mais rigorosa da extensão da faixa dinâmica, que indicava claramente que a magnitude da variação entre amostras individuais foi extremamente diferente entre os miRNAs testados. Embora estas variações podem ser atribuíveis à suas pequenas quantidades em fluidos corporais, note-se que esses dados refletem não apenas variações biológicas, mas também variações técnicas. A maioria da variação técnica pode ser avaliada por meio de valores de Cq do controle externo (cel-miR-238), que é usado em outras plataformas de ensaio18. Desde que não tenha havido nenhum controle interno padronizado na análise de miRNA, a informação sobre a variação de técnica deve ser incluída na análise, para determinar a qualidade do ensaio19. Variação técnica foi estimada em menos de 3 vezes no método descrito neste relatório. Embora não seja possível determinar o nível de qualidade para este procedimento, devido à falta de informações técnicas comparáveis em outras pesquisas, incluindo informações contribui para melhorar a confiabilidade e garante a compatibilidade entre diferentes estudos.
Um número de trabalhos recentes têm relatado que diversas variáveis pré-analíticas como duração de armazenamento antes do processamento, condições de armazenamento e manuseio de amostras podem afetar a confiabilidade e reprodutibilidade de miRNA medições20 em circulação , 21. embora este estudo não levou em consideração os efeitos das variáveis pré-analíticos, as seguintes etapas foram seguidas com cuidado durante a preparação da amostra para minimizar variações. Primeiro, o plasma foi processada mais rapidamente possível (dentro de pós-coleção 2 horas) para minimizar o efeito da estabilidade de miRNAs em plasma8,22. Embora os miRNAs são considerados para ser estável à temperatura ambiente (15 a 25 ° C), ainda não está claro se o intervalo entre a coleta de sangue e processamento de plasma ou soro afeta os níveis de miRNA. Em segundo lugar, cada amostra de plasma foi visualmente inspeccionada para eliminar o viés analítico, decorrentes da contaminação com hemácias hemolisadas, que representa um dos fatores que podem afetar os níveis circulantes de miRNAs23confundimento.
Pré-amplificação é útil para melhorar a detecção de quantidades extremamente pequenas de miRNAs em biofluids sem introduzir um viés de deteção24. No presente estudo, os valores de Cq das curvas padrão construídos usando oligonucleotídeos sintéticos pré-amplificados mostraram grande reprodutibilidade através de ensaios. Isto permitiu a quantificação absoluta usando amostras pre-amplificadas, o que permitiu a detecção de pequenas quantidades de miRNAs. Por outro lado, padrões de número de cópia baixa (1 x 102 ou3 10 cópia / µ l) não mostram amplicons específico, em combinação com pré-amplificação. Mestdagh et al. 24 relatou que medição de cópia baixo números miRNAs mostrou maior variação após procedimento pré-amplificação, em comparação com moderada ou alta cópia números miRNAs, devido a baixa eficiência da transcrição reversa, que poderia ser o resultado de miRNA características de sequência. Portanto, o intervalo de detecção do curvas padrão para cada miRNA deve ser validado antes da quantificação de amostras biológicas, especialmente para os miRNAs pre-amplificados, eliminar resultados falso-positivos. Mais importante, deve-se notar que os níveis absolutos de miRNAs diferentemente transformados como amostras pre-amplificados e não pre-amplificados não podem ser comparados diretamente porque a quantidade de amostra pré-amplificada não é especificada em cada miRNA.
Este relatório descreve um procedimento para a determinação dos níveis de miRNA absoluto em amostras de plasma utilizando RT-qPCR. Alguns miRNAs não foram detectados mesmo após pré-amplificação. Para detectar tais miRNAs de pouca expressão, uma abordagem diferente poderão ter de ser utilizados. Embora utilizando uma maior quantidade de amostra pode contornar este problema como uma solução simples, grandes quantidades de amostra não estão sempre disponíveis. Até à data, os avanços tecnológicos permitiram o desenvolvimento de várias plataformas para miRNA perfilação de25,26. Gotícula PCR digital (ddPCR) foi desenvolvido recentemente e oferece um método alternativo para RT-qPCR convencional para quantificação absoluta. Esta tecnologia inovadora foi relatada para ser um método preciso, reprodutível e sensível que pode detectar um alvo miRNA em níveis de 1 cópia / µ l27,28. Se ddPCR pode detectar uma baixa concentração de miRNAs sem uma etapa de pré amplificação, seria uma grande vantagem porque os níveis de vários miRNAs podem ser comparados ao outro. Mudanças em procedimentos de extração e subsequente RT-qPCR, plataforma molecular e os reagentes utilizados inevitavelmente produzirá resultados variáveis. No entanto, essas variações podem ser resolvidas se transparente resultados de controles externos e níveis absolutos para miRNAs individuais são fornecidos. Avaliação da qualidade apropriada do método é a chave para melhorar o discernimento das mudanças biológicas em miRNA estudos de criação de perfil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
O autor não tem nenhum conflito de interesses para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa não recebeu qualquer subsídio específico de agências de financiamento no setor público, comercial ou não-lucrativa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | - | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
