Summary
הדו ח מתאר פרוטוקול למדידת ברמות המוחלטות miRNA פלזמה, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי עם או בלי הגברה מראש. פרוטוקול זה מאפשר הבנה טובה יותר של כמות פלזמה miRNAs ומאפשר הערכה איכותית של נתונים התואמים מחקרים שונים או מעבדות.
Abstract
RT-qPCR היא אחת השיטות הנפוצות להערכת miRNAs היעד בודדים. רמות MiRNAs בדרך כלל נמדדים ביחס דגימת. גישה זו מתאימה לבחינת שינויים פיסיולוגיים רמות הביטוי של גנים היעד. עם זאת, כימות מוחלט באמצעות ניתוח סטטיסטי יותר עדיפה עבור הערכה מקיפה של רמות ביטוי גנים. כימות המוחלט הוא עדיין לא במשותף להשתמש. הדו ח מתאר פרוטוקול למדידת ברמות המוחלטות miRNA פלזמה, באמצעות RT-qPCR עם או בלי הגברה מראש.
נפח קבוע (200 µL) של EDTA-פלזמה הוכן מהדם שנאסף וריד הירך cynomolgus בהכרה קופים (n = 50). סה כ RNA שהופק באמצעות מערכת זמינים מסחרית. פלזמה miRNAs היו לכמת על ידי המבוסס על בדיקה RT-qPCR מבחני אשר מכיל miRNA ספציפי לפנים/הפוכה PCR פריימר בדיקה. עקומות רגיל על כימות מוחלטת נוצרו תוך שימוש זמינים מסחרית oligonucleotides RNA סינתטי. סינתטי צ'ל-מיר-238 שימש פקד חיצוני להערכה נורמליזציה ואיכות. MiRNAs הראה כימות מחזור (סי) ערכים מעל 35 היו מראש מוגבר לפני השלב qPCR.
בין 8 miRNAs בחן, מיר-122, מיר-133a ומיר-192 היו לזיהוי ללא הגברה מראש, ואילו מיר-1, מיר-206 ו miR-499a הנדרש הגברה מראש בגלל רמות נמוכות הביטוי שלהם. MiR-208a מיר-208b היו לא לזיהוי גם לאחר הגברה מראש. הדגימה יעילות העיבוד הוערך על ידי ערכי סי מחודדים צ'ל-מיר-238. בשיטה זו assay, וריאציה טכני היה מוערך להיות פחות 3-fold, הגבול התחתון של כימות (LLOQ) היה העתק2 10/µL, עבור רוב miRNAs בחן.
פרוטוקול זה מספקת אומדן טוב יותר כמות פלזמה miRNAs, ומאפשרת הערכת איכות הנתונים המתאימים ממחקרים שונים. בהתחשב שהמספר הנמוך של miRNAs בנוזלי גוף, קדם הגברה שימושית לשפר זיהוי של גרוע הביע miRNAs.
Introduction
מספר גדל והולך של מחקרים יש כבר חקר מיקרו Rna (miRNAs) כמו סמנים ביולוגיים עבור האבחון, הפרוגנוזה של סרטן, או ניטור וכן זיהוי מחלות אחרות מחקרים קליניים nonclinical1,2,3 . כמותיים שעתוק במהופך בזמן אמת PCR (RT-qPCR) היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לשימוש לצורך הערכת miRNAs היעד בודדים, כי טכניקה זו הוא יותר רגיש ממה microarray4 ו- RNA רצף המבוסס על פלטפורמות5. באופן כללי, miRNA ביטוי נמדד ביחס דוגמה הפניה באמצעות שיטת ΔCq6. גישה זו מתאימה עבור חוקרים שינויים פיסיולוגיים רמות הביטוי של גנים היעד. עם זאת, כימות היחסי של מחזורי miRNAs מוגבל השירות בגלל כמויות קטנות שלהם. בנוסף, וריאציה טכני עושה את זה קשה להשוות את התוצאות ממחקרים שונים, כי מעבדות שונות להתאים הפרוטוקולים ניסיוני RT-qPCR אחרת, מה שמוביל לא עקבי או אפילו סותרות נובעת מחקרים שונים7.
על רקע חששות שהוזכרו לעיל, כימות מוחלט עשוי להיות מתאים יותר ההערכה כמויות קטנות של miRNAs בנוזלי גוף. השיטה כימות המוחלטת משתמש עיקול רגיל המופקים ידוע ריכוזי oligonucleotides RNA סינתטי זהים ברצף המתאים למטרה miRNA8. בריאותם של המכון למדעי הסביבה (HESI) הוועדה הטכנית גנומיקה שנערך לאחרונה מחקרים מקיפים כדי להשוות את התוצאות של המידות המוחלט של פלזמה miRNAs, באתרים מרובים של הבדיקה. התוצאות הראו כי באמצעות פרוטוקול תקשורת עבור כימות מוחלטת של miRNAs הניבו תוצאות דומות על פני אתרי מבחן מספר9. RT-qPCR assay השיטה המתוארת במחקר הנוכחי הוא כמעט זהה לזה של HESI ההליך הרגיל, הכולל ניתוח מרובבת של miRNA מטרות מרובות, ושל הגברה מראש כדי לסייע זיהוי miRNAs ביטוי נמוך.
במחקר זה, נפח קבוע (200 µL) של EDTA-פלזמה מוכן מהדם שנאסף וריד הירך cynomolgus בהכרה קופים (n = 50) היה בשימוש10. הפרוטוקול הבא מתאר את ההליך עבור הכנת דגימות פלסמה, החילוץ של miRNA, ו- RT-qPCR, כולל הגברה מראש. חשוב מכך, פרטים טכניים נוספים אודות הפרוטוקול כבר כלול, כך כמות היעד miRNAs הדגימות הניתנים לאימות בשילוב עם תהליך מוסמך מאוד. ראשית, העקומה סטנדרטי של כל miRNA אומתה עבור טווח זיהוי הפרט שלו, לפני שלה כימות בדגימות ביולוגיות. שנית, האיכות של המתודולוגיה הנוכחית באופן מקיף הוערך על-ידי סי ערכים של פקד חיצוני (cel-מיר-238). לכן, פלטפורמה זו מניבה נתונים מקיף ואמין יותר לצורך השוואת תוצאות של מחקרים שונים או מעבדות.
הפרופילים של 8 miRNAs נכללו בדו ח זה כתוצאות נציג מן השיטה assay המתוארים כאן. אלה miRNAs הוצעו כפי פוטנציאליים בטיחות סמנים ביולוגיים הקשורים עם פציעה של רקמות הכבד (122-מיר ומיר-192), הלב (מיר-1, מיר-208a, מיר-208b ומיר-499a), ואת שרירי השלד (מיר-133a ומיר-206) מכרסמים ובני אדם3, 11,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של תחנת Sankyo ושות', בע מ
1. הכנת הדוגמא
- לאסוף דם (לפחות 0.5 מ"ל) וריד הירך קופים cynomolgus לתוך צינורות 2K המכילה EDTA.
הערה: ציטראט הפארין אינם מקובלים כי אלה תרופות נגד קרישת דם לעכב PCR עוקבות14,15. - במקום הדגימות שנאספו באופן מיידי על הקרח ותהליך לבידוד פלזמה תוך שעתיים של אוסף.
- Centrifuge את הדגימות ב g x 10,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- להעביר את תגובת שיקוע microtube 2 מ"ל, ואחריו צנטריפוגה ב g 16,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות להסיר שאריות תאים שיורית טסיות.
הערה: כימות miRNAs עשויה להיות מושפעת באופן משמעותי טסיות זיהום16. - למקם את aliquots µL 200 של תגובת שיקוע טרי 2 מ ל- microtubes, לאחסן ב- 80 ° C עד השימוש.
הערה: נפח קבוע של כל מדגם משמש לחילוץ RNA; לכן, כמות aliquot חייב להיות מדויק.
2. RNA החילוץ
- הפשרת דגימות קפוא בקרח (מתוך שלב 1.5).
- לשמור על מדגם קר על קרח במהלך החילוץ-RNA. . תירגע ריאגנט פירוק, כלורופורם על הקרח לפני השימוש.
- מוסיפים 5 כרכים (1000 µL) של ריאגנט פירוק, המכיל תמיסת monophasic פנול, guanidine isothiocyanate, כדי המדגם (200 µL), ומערבבים נמרצות על ידי vortexing עבור 1 דקות.
- להוסיף 5 µL של 5 nM סינתטיים Caenorhabditis elegans miRNA (Syn-צ'ל-מיר-238-3 p).
- הוסף נפח 1 (200 µL) של כלורופורם, מערבבים היטב על ידי vortexing עבור 1 דקות.
- לשמור בקירור למשך 2-3 דקות ולאחר מכן centrifuge את הדגימות ב g x 12,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- העברה השלב מימית בזהירות microtube החדש.
הערה: אל תעביר שלב אורגני (אדום) או לאטמוספרה (לבן). הנפח של השלב מימית שנאסף צריך להיות אחיד כדי למנוע טיפול עקביות, כשהתוצאה היא וריאציה טכני מוגברת. הכמות הרגילה של פאזה מימית מועברים ב פרוטוקול זה היה 650 µL. - להוסיף 1.5 כרכים (975 µL) של אתנול, ולערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- להעביר את הדגימה לתוך העמודה המתאימה מתאם, ואחריו ואקום ייבוש למשך 3 דקות באמצעות יריעות ואקום. אם אמצעי האחסון מדגם µL יותר מ-700, חזור על שלב זה כדי לעבד את הפתרון הנותרים.
הערה: בידוד מבוססי עמודה RNA הוא תואם עם שיטת ואקום צנטריפוגה. - להוסיף 200 µL של אתנול העמודה, ואחריו ואקום ייבוש עבור 1 דקות.
- להוסיף µL 800 RWT מאגר העמודה, ואחריו ואקום ייבוש למשך 2 דקות.
- להוסיף 800 µL RPE מאגר העמודה, ואחריו ואקום ייבוש למשך 2 דקות.
- חזור על שלב 2.11.
- להוסיף 300 µL של אתנול העמודה, ואחריו ואקום ייבוש עבור 1 דקות.
- מקם את העמודה אל microtube חדש ולאחר צנטריפוגה ב g x 12,000 בטמפרטורת החדר (15-25 ° C) במשך 1 דקה.
- להעביר את העמודה microtube חדש, ולהוסיף 50 µL של נוקלאז ללא מים.
- לעמוד בטמפרטורת החדר (15-25 ° C) במשך 3 דקות, צנטריפוגה ב 8000 g × בטמפרטורת החדר (15-25 ° C) במשך 1 דקה.
- החל מחדש את eluate על העמודה.
- חזור על שלב 2.16 ואחסן eluate ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
3. cDNA סינתזה
- הפשרת דגימות קפואים (מתוך שלב 2.18).
-
הכנת ריכוז ידוע של oligonucleotides RNA סינתטי התואמים miRNAs היעד.
- השתמש oligonucleotide RNA סינתטי ליצירת עיקול רגיל ב- qPCR. פתרון מניות ריכוז העתק/µL8 עונה 1 פרק 10 מוכן למטרות אחסון.
- לדלל את הפתרון מניות 10-fold להשיג עותק7 עונה 1 פרק 10/µL (לא מוגבר מראש דוגמיות) או עונה 1 פרק 105 העתק/µL (דוגמאות מוגבר מראש) הפתרון עובד כמו הריכוז הגבוה ביותר עבור בניית העקומה סטנדרטי. באופן כללי, מגוון הצעות עבור הריכוזים עיקול רגיל הוא עונה 1 פרק 107 עונה 1 פרק 102 העתק/µL (לא מוגבר מראש דוגמיות) או עונה 1 פרק 105 ל 1 x 100 העתק/µL (דוגמאות מוגבר מראש).
- להכין מולטיפלקס RT פריימר הבריכה על ידי ערבוב נפחים שווים של 20 x RT צבעי יסוד miRNAs היעד.
הערה: כפי שמוצג באיור2, מאגר המכיל עד 4 miRNAs היעד יכול להתבצע על ידי ערבוב של תחל RT 20 x של כל אחד miRNAs בבריכה. צ'ל-מיר-238 (פקד חיצוני) חייב להיות כלול כאחד היעד miRNAs בהתפתחות של כל שפופרת. במקרה של פחות מ- 4 miRNAs היעד, הוסף נפחים שווים של 1/10 מאגר טה במקום 20 x RT פריימר. - להכין תערובת התגובה RT: 3 µL של RT פריימר מאגר (מתוך שלב 3.3), µL 0.15 של 100 מ מ dNTPs עם dTTP, 1 µL רוורס טרנסקריפטאז (U 50/µL), µL 1.5 10 x RT מאגר, 0.19 µL של RNase מעכב (20 U µL), µL 4.16 של נוקלאז ללא מים.
- מיקס 10 µL של תגובה RT לערבב עם µL 5 של RNA דוגמה (מתוך שלב 3.1) או oligonucleotides (מתוך שלב 3.2) על ידי pipetting, דגירה על קרח למשך 5 דקות.
- לרוץ שעתוק במהופך על מנגנון הצנטרפוגה תרמי: 16 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואחריו צעד איון הסופי רוורס טרנסקריפטאז ב 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דק מאגר דגימות משועתקים הפוכה ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
4. preamplification (אופציונלי)
הערה: miRNAs המציגים סי ערכים מעל 35 ומעלה qPCR הבאים הם מראש מוגבר.
- הפשרת דגימות קפואים (מתוך שלב 3.6).
- להפוך 10-fold דילולים טורי של RT מוצר מ- RNA oligonucleotides סינתטי; עונה 1 פרק 105 ל 1 x 100 העתק/µL ליצירת עיקול רגיל.
- להכין assay מולטיפלקס פריימר הבריכה על ידי ערבוב נפחים שווים (5 µL) של 20 x assay תחל miRNAs היעד עם הריכוז הסופי של כל פריימר assay להיות מדולל 200-fold על-ידי מאגר טה בנפח סופי של 1,000 µL.
הערה: תחל assay miRNAs יעד אשר ניתן לזיהוי ב qPCR הבאים ללא הגברה מראש, ואלה עבור צ'ל-מיר-238 (פקד חיצוני) אינם נכללים במאגר פריימר. - להכין תערובת התגובה קדם הגברה: 12.5 µL של 2 x ריאגנט preamplification מוכן לשימוש, 3.75 µL assay ביליארד פריימר (מתוך שלב 4.3) ו- µL 6.25 נוקלאז ללא מים.
- מיקס 22.5 µL של תגובה קדם הגברה לערבב עם µL 2.5 מדגם משועתקים הפוכה (מתוך שלב 4.1) או oligonucleotides (מתוך שלב 4.2) על ידי pipetting, דגירה על קרח למשך 5 דקות.
- להפעיל תגובה על מנגנון הצנטרפוגה תרמי: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; ואחריו 12 מחזורי 95 ° C עבור 15 s ו- 60 ° C עבור 4 דק לאחסן דגימות מראש מוגבר ב- 80 ° C עד השימוש.
5. PCR כמותי בזמן אמת (qPCR)
- הפשרת דגימות קפואים (מתוך שלב 3.6 או שלב 4.6).
- לדלל את הדגימות 5 פי במים סטריליים.
- להכין 10-fold דילולים טורי של המוצר RT נגזר oligonucleotides RNA סינתטי; עונה 1 פרק 107 עונה 1 פרק 102 העתק/µL (לא מוגבר מראש דוגמיות) או עונה 1 פרק 105 ל 1 x 100 העתק/µL (דוגמאות מוגבר מראש) ליצירת עקומות סטנדרטי.
- להכין תערובת התגובה qPCR: 10 µL של ריאגנט הגברה מוכן לשימוש, µL 1 של 20 x ריאגנט assay, המכיל PCR פריימר לפנים/הפוכה המכשיר המתאים למטרה miRNA, ו- 7 µL של נוקלאז ללא מים.
- העברת 18 µL מהתערובת התגובה qPCR אל צלחות אופטי מהיר תגובה 96-ובכן, ולהוסיף 2 µL של הדגימות מדולל (מתוך שלב 5.2 או שלב 5.3) לתוך הבארות.
הערה: תקנים עבור qPCR ודוגמאות מוגדרים למצב שבו כפילויות. - לאטום את הצלחת עם סרט דביק, צנטריפוגה בקצרה.
- להפעיל תגובה הצנטרפוגה תרמי בזמן אמת: 95 ° C עבור 20 s, ואחריו 45 מחזורי 95 ° C עבור 1 s ו- 60 ° C עבור 20 s.
6. ניתוח נתונים
- לחשב את המספר raw עותק של כל דגימה באמצעות ניתוח נתונים תוכנה שעובדת עם המקביל הצנטרפוגה תרמי בזמן אמת.
הערה: קו סף מוגדר באופן ידני "1.0" על כל הצלחות במחקר, כדי לאשר את הפארמצבטית by comparison with שלהם vales סי. ניתוק רמת מוגדרת בסי > 40 מחזורי. - לחשב את הממוצע של מספר raw עותק של כל דגימה של כפילויות.
- לחשב פקטור התיקון על-ידי חלוקת מספר עותק של צ'ל-מיר-238 בכל מדגם לפי הממוצע של עותק מספר צ'ל-מיר-238 מ כל הדגימות צינור המקביל.
הערה: כפי שמוצג באיור2, כל שפופרת מכילה עד 4 miRNAs היעד כולל צ'ל-מיר-238 (פקד חיצוני). לכן, פקטור התיקון מחושבת עבור כל שפופרת באמצעות ערך צ'ל-מיר-238 המתאים. - לחשב את המספר מנוכי עונתיות העתקה על-ידי חלוקת מספר עותק raw בממוצע כל דגימה (מתוך שלב 6.2) על ידי פקטור התיקון (מתוך שלב 6.3) עבור כל דגימה.
- לחשב את המספר המוחלט עותק על-ידי הכפלת המספר עותק raw מנוכי עונתיות של כל דגימה (מתוך שלב 6.4) על ידי הגורם דילול עבור כל דגימה.
הערה: הגורם דילול הוא "5" של פרוטוקול זה, שהוא נגזרת של 5.2 שלב. - לחשב את היעילות של PCR הגברה מן המדרון של העלילה של הערכים סי עבור כל דילול טורי כנגד ריכוז cDNA יומן.
הערה: נוסחה לחישוב את היעילות; E = (10(-1/שיפוע) -1) x 100%. - לחשב את הווריאציה טכנית באמצעות הערכים סי של צ'ל-מיר-238 מ כל דוגמאות באמצעות הנוסחה E = (2 x הגברה היעילות)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
הערה: השלבים 6.5 ו- 6.7 משמשים להערכת איכות של ההליך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זרימת העבודה של miRNA assay מאת RT-qPCR ו- assessmen איכותt
איור 1 מציג את זרימת העבודה של miRNA assay מדגימות דם באמצעות qPCR10. האיכות של הניסויים ניתנת לאימות כמקורית על-ידי הכללת צ'ל-מיר-238 כמו שליטה חיצונית. זה יחשוף טכני בווריאציות החילוץ-RNA ומעבד עוקבות RT-qPCR. במחקר זה, זאת אומרת ± SD מערכי סי שחושב מתוך 50 דגימות היה ± 21.0 0.4 (טבלה 1). אם צ'ל-מיר-238 היה מדולל בגלל השלב קדם הגברה, הערך סי היה ± 24.2 0.4 (טבלה 1). בשיטה assay המתוארים כאן, היקף וריאציה טכני היה מוערך פחות מ 3-fold המבוסס על ההבדל בערכים סי. מידת וריאציה נשאר עקבי גם כאשר שלב קדם הגברה נוספת חייב להיות כלול. ערכים אלה הן תואמות את דוגמאות אחרות של מיני בעלי חיים שונים, כגון עכברים, חולדות, ובני אדם שבוצעה במעבדה (נתונים לא מוצג).
לזיהוי נע בין עקומת סטנדרטי לכל יעד miRNA
אין הגברה מראש של הדגימות
המוצר הפוכה (RT) משועתקים מ oligonucleotides סינתטי RNA בריכוזים של עותק7 עונה 1 פרק 10/µL היה מדולל באופן סדרתי לפני qPCR הבאים. סדרות אלה שימשו ליצירת עיקול רגיל אשר הבטיחו עקבי סיקור כל דגימות ביולוגיות שהיו לזיהוי ללא שלב קדם הגברה. הערכים סי המדגם סטנדרטי-עונה 1 פרק 102 העתק/µL ריכוז היו בדרך כלל קרוב החתך את רמות עבור כל miRNA היעד. לכן, המגבלה זיהוי הוערך יהיה עותק2 עונה 1 פרק 10/µL (איור 3).
דוגמאות מוגבר מראש
כדי לקבוע את טווח לזיהוי של דגימות דרישת קדם הגברה, הושוו שתי סדרות שונות של דגימות מדולל, כמודגם באיור4. ליצירת עקומה סטנדרטי A, הוכנו דילולים טורי של המוצר RT לפני שלב קדם הגברה. אז הסדרה של סטנדרטים מוגבר מראש שימשו qPCR הבאים. ליצירת עיקול רגיל B, בוצע דילול הראשון של דגימות מוגבר מראש ריכוז עונה 1 פרק 105 העתק/µL.... עקומות סטנדרטיים אלה הראו מגבלות הזיהוי מסתבר שונים (איור 5). למרות עיקול רגיל B הראה טווח ליניארי של עלייה עד עותק 1/µL, עיקול רגיל A לא יכול לשמש לייצור amplicons ספציפיים בריכוזים פחות מ- 102 או3 10 העתק/µL (איור 5). תוצאה זו הציע כי כמויות קטנות מאוד של miRNAs לא יכול להיות מוערך אפילו עם שלב קדם הגברה. בנוסף, הדגימות מוגבר מראש יש לפרש בזהירות כאשר הערכים סי > 30, כי היו גבולות זיהוי הדגימות מוגבר מראש לסגור ערך זה. לכן, ככלל, עיקול רגיל B היה בשימוש השיטה המתוארת כאן, לאחר קביעת הטווח לזיהוי, רק על מנת להימנע משימוש מספר מספיק של חלקות סטנדרטי.
כתוצאה מכך, הגבול התחתון של כימות (LLOQ) היה 102 העתק/µL עבור רוב miRNAs (איור 3 ואיור 5). רק מיר-1 הראו LLOQ גבוהה יותר (103 העתק/µL) (איור 5). היעילות הגברה הממוצע היה כ-90%, עם מקדם המתאם (R2) של עקומות סטנדרטי החל 0.998 וכלה 1.000. גולת הכותרת של assay מדויק RT-qPCR נחשבים ליניארי R2 שווה או גדול מ- 0.98 ויעילות הגברה PCR של 90-110%17. לכן, האיכות של עקומות רגיל ב וזמינותו אומתה.
ההשפעות של קדם הגברה עבור כמויות קטנות של miRNAs
MiRNAs הראה סי ערכים מעל 35 ומעלה ב- qPCR הבאים היו מראש מוגבר. הליך זה משופר הגילוי של כמויות קטנות של miRNAs. לדוגמה, הערכים סי (זאת אומרת ± SD) של מיר-206-מוגבר pre היה 37.9 ± 1.9, ואילו אלה של מיר מוגבר מראש-206 ירד עד 27.0 ± 2.2. הבדלים משמעותיים בין זוגות מדידה כפולים נצפו בדגימות מוגבר טרום-ערכים גבוהים סי (איור 6). לעומת זאת, דגימות מוגבר מראש הראו ערכים שווים כמעט כפילויות (איור 6). התוצאות הצביעו על שהגברה קדם הזה יהיה יעיל למתן נתונים מדויק ואמין יותר במקרים של כמויות קטנות של דגימות.
בניית פרופיל של פלזמה miRNAs בקופים cynomolgus
באמצעות פלטפורמת assay הוקמה, פלזמה רמות של miRNAs 8 (מיר-1, מיר-122, מיר-133a, מיר-192, מיר-206, מיר-208a, מיר-208b ומיר-499a) מ 50 cynomolgus שקופי ניתח (איור 7)10. זה assay, מיר-122, מיר-133a ומיר-192 היו לזיהוי ללא הגברה מראש, ואילו מיר-1, מיר-206 ו miR-499a הנדרש הגברה מראש בגלל רמות נמוכות הביטוי שלהם. אולם, לא מיר-208a ולא מיר-208b היה לזיהוי אפילו עם הגברה מראש. הנתונים לא הופצו בדרך כלל; לכן, שינוי לוגריתמי בוצעה כדי לחשב את ממוצע סטיות תקן. בין miRNAs שנבדקו, 122-מיר הראה ברמה הגבוהה ביותר פלזמה רשע (5.71 x עותק4 10/µL), עם טווח דינמי קטן (20-fold). לעומת זאת, טווחים דינמיים גדולים נצפו על מיר-1 (581-fold), מיר-133a (971-fold), ומיר-206 (426-fold).
איור 1 : זרימת סכמטי של miRNA assay מאת RT-qPCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : זרימת סכמטי של שעתוק במהופך של miRNA assay. מאגר המכיל עד 4 miRNAs היעד יכול להתבצע על ידי ערבוב של תחל RT 20 x של כל אחד miRNAs בבריכה. צ'ל-מיר-238 (פקד חיצוני) חייב להיות כלול כאחד היעד miRNAs בהתפתחות של כל שפופרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| ניתוח נתונים מיר-238 | ||
| בלי קדם הגברה |
עם קדם הגברה |
|
| N | 50 | 50 |
| זאת אומרת | 21.0 | 24.2 |
| SD | 0.4 | 0.4 |
| סי מקס | 21.8 | 25.3 |
| סי min | 20.3 | 23.5 |
| חציון | 21.0 | 24.2 |
| מקס-מין | 1.3 | 1.8 |
| הגברה יעילות | 89 | 89 |
| וריאציה | 2.4 | 2.8 |
טבלה 1: הערכת איכות באמצעות ערכי מחזור (סי) כימות צ'ל-מיר-238. וריאציות טכני הוערכו לפי הערכים סי של מיר-238 ב כל וזמינותו. חמישים דוגמאות חולקו לשתי קבוצות המתאים עם (מימין) או בלי (משמאל) שלב קדם ההגברה. וריאציה מחושב באמצעות הנוסחה E = (2 x הגברה היעילות)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). היעילות הגברה מחושב מן המדרון של העקומה סטנדרטי. הדגימות דרישת קדם הגברה צעד היו מדולל במהלך השלב קדם הגברה (מיר-238 עצמו לא היה מוגבר מראש). איור זה השתנה מ שלנו דוח10.
איור 3 : מגרש של עקומות סטנדרטי עבור דגימות מוגבר טרום- עקומות סטנדרטי (N = 3, כפולים) נוצרו על ידי התוויית הריכוז יומן נגד סי. לינארית ניתוח רגרסיה היה מחושב כדי לקבוע המדרון, המתאים היעילות הגברה. רגיל ' עקומות ' עבור מיר-122 (העליון), מיר-192 (באמצע), מיר-133a (התחתון) הראה הקשר הליניארי בין סי וריכוז במטווח שנבדקו. בפניות סטנדרטי, קווי שגיאה לייצג סטיית תקן אחת בין שלושת מבחני עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : הליך כדי ליצור עקומות סטנדרטי עבור דגימות מוגבר מראש. (עיקול רגיל A) ריכוז נציג של oligo סינתטי (עותק 1 x 10 5/µL) היה הפוך עיבד, ואחריו הכנת דילול טורי 10-fold, סדרת המדגם סטנדרטי. סטנדרטים מוגבר מראש אלה שימשו qPCR הבאים. (עיקול רגיל B) ריכוז נציג של oligo סינתטי (העתק5 עונה 1 פרק 10/µL) היה הפוך עיבד ו מראש מוגבר. לאחר מכן, סדרת טורי דילול 10-fold דגימות סטנדרטי הוכנו לפני qPCR הבאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : מגרש של עקומות סטנדרטי A ו- B עבור דגימות מוגבר מראש. עיקול רגיל A (n = 1, כפולים), תקן עקומה B (n = 3, כפולים) נוצרו על ידי התוויית הריכוז יומן נגד סי. לינארית ניתוח רגרסיה היה מחושב כדי לקבוע המדרון, המתאים היעילות הגברה. (העליון) עיקול רגיל (קו מנוקד) הראה אמפליקון מסתבר שאינם ספציפיים-עונה 1 פרק 102 העתק/µL, ואילו עיקול רגיל B (קו רציף) הראה הקשר הליניארי בין סי וריכוז שנבדקו טווח מיר-1. (האמצעי , התחתונה) עיקול רגיל (קו מנוקד) הראה אמפליקון אין בריכוזים של עונה 1 פרק 102 העתק/µL או נמוך יותר, ואילו תקן עקומת B (קו רציף) הראה הקשר הליניארי בין סי וריכוז שנבדקו טווח מיר-499a, miR-206. בעקומת רגיל B, קווי שגיאה לייצג סטיית תקן אחת בין שלושת מבחני עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : העלילה הגברה דגימות מוגבר מראש ללא-pre-מוגבר. (העליון) עלילה הגברה של מיר-206 בדגימות נציג (A, B, C) ללא (העליון), או עם קדם הגברה (התחתון). מדידות הוקמו בתוך כפילויות. היו הבדלים בין בשתי הדגימות להגדיר ככפילויות בדגימות הלא-pre-מוגבר, ובמיוחד דוגמאות סי גבוה יותר (A ו- B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : הערך המוחלט של פלזמה מיקרו Rna (miRNAs) בקופים cynomolgus. רמות הביטוי miRNAs מיוצגים על ידי נקודה חלקות. הממוצע ואת הערך עבור שתי סטיות תקן מתחת ומעל הממוצע (המוצג בתיבה אפורה), נקבעו לאחר שינוי לוגריתמי. איור זה השתנה מ שלנו דוח10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
להערכתנו, מקיף מספק ניתוח סטטיסטי קפדנית יותר של היקף הטווח הדינמי, אשר לציין בבירור סדר הגודל של וריאציה בין דוגמאות בודדות היה שונה מאוד בין miRNAs נבדק. למרות לווריאציות אלה ניתן לייחס שלהם כמויות קטנות של נוזלי הגוף, יצוין כי נתונים אלו משקפים לא רק הווריאציות ביולוגי, אלא גם וריאציות טכני. רוב וריאציית טכני ניתן לבדיקה באמצעות סי הערכים בפקד חיצוני (cel-מיר-238), אשר משמש פלטפורמות אחרות assay18. מאז היו ללא בקרה פנימית מתוקננת בניתוח miRNA, יש לכלול את המידע על וריאציה טכני בניתוח, לקביעת איכות assay19. וריאציה טכני היה מוערך להיות פחות 3-fold בשיטה שתוארו בדו ח זה. למרות שלא ניתן לקבוע את רמת איכות עבור הליך זה בגלל חוסר מידע טכני דומות במחקרים אחרים, כולל מידע כגון תורמת לשיפור האמינות ואני מבטיח תאימות בין מחקרים שונים.
מספר מאמרים אחרונים דיווחו כי שונים מראש אנליטי משתנים כגון טיפול לדוגמה, תנאי אחסון ומשך אחסון לפני עיבוד יכולים להשפיע את המהימנות ואת הפארמצבטית לאומיים miRNA מידות20 , 21. למרות מחקר זה לא לקחו בחשבון את השפעת משתני מראש אנליטית, השלבים הבאים עקבו בזהירות במהלך הכנת הדוגמא למזער וריאציות. ראשית, פלזמה עיבוד במהירות האפשרית (במרחק של 2 שעות פוסט אוסף) כדי לצמצם את ההשפעה של תפקוד miRNAs פלזמה8,22. למרות miRNAs נחשבים יציב בטמפרטורת החדר (15-25 ° C), זה עדיין לא ברור אם המרווח בין דם איסוף ועיבוד של פלזמה או סרום משפיעה על רמות miRNA. שנית, כל מדגם פלזמה היה נבדק באופן חזותי כדי למנוע הטיה אנליטי הנובעות זיהום, עם תאי דם אדומים hemolyzed, אשר מייצג את אחד הגורמים מבלבלים העלולות להשפיע על רמות ומגבלותיהם miRNAs23.
קדם הגברה שימושית לשפר את הגילוי של כמויות קטנות מאוד של miRNAs ב biofluids ללא היכרות עם הסטייה של זיהוי24. במחקר הנוכחי, הערכים סי של עקומות סטנדרטי שימוש מוגבר מראש oligonucleotides סינתטי הראה הפארמצבטית גבוהה מעבר מבחני. פעולה זו מותרת באמצעות דגימות מראש מוגבר, שאיפשר את הגילוי של כמויות קטנות של miRNAs כימות מוחלטת. מצד שני, העתק נמוך מספר תקנים (1 x 102 או העתק3 10/µL...) לא מראים amplicons ספציפיים, בשילוב עם הגברה מראש. Mestdagh et al. 24 דיווחו כי מדידה של miRNAs מספר נמוך עותק הראו וריאציה גבוהה יותר לאחר הליך קדם הגברה, לעומת העתקה בינונית או גבוהה miRNAs מספר, בשל יעילות נמוכה של שעתוק במהופך, אשר יכולים להיות התוצאה של miRNA רצף המאפיינים. לכן, זיהוי טווח עקומות סטנדרטי עבור כל miRNA יש לאמת לפני כימות של דגימות ביולוגיות, במיוחד עבור miRNAs מוגבר מראש, כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות. יותר חשוב, יש לציין כי ברמות המוחלטות miRNAs באופן שונה מעובד כגון דגימות מוגבר מראש-מוגבר מראש שלא להתפלא ישירות בגלל כמות הדגימה מוגבר מראש לא צוין בכל miRNA.
הדו ח מתאר הליך לקביעת רמות miRNA מוחלטת בדגימות הפלסמה באמצעות RT-qPCR. כמה miRNAs לא אותרו גם לאחר הגברה מראש. כדי לזהות miRNAs ביטוי נמוך כזה, גישה שונה ייתכן שיהיה עליך להשתמש. למרות באמצעות כמות הדגימה גדולה יותר ייתכן לעקוף בעיה זו בתור פתרון פשוט, כמויות גדולות של מדגם אינם זמינים תמיד. עד כה, ההתקדמות הטכנולוגית אפשרו הפיתוח של פלטפורמות שונות עבור miRNA פרופיל25,26. Droplet PCR דיגיטלי (ddPCR) פותחה לאחרונה והוא מציע שיטה חלופית RT-qPCR המקובלת על כימות מוחלטת. טכנולוגיה חדשנית זו דווחה להיות שיטה מדויקת, הדירים רגיש שיכול לזהות miRNA היעד ברמות של העתקה/µL 127,28. אם ddPCR יכול להבחין בו ריכוז נמוך של miRNAs ללא צעד קדם הגברה, זה יהיה יתרון גדול כי ניתן להשוות את רמות מרובות miRNAs אחד את השני. שינויים במיצוי הליכים, עוקבות RT-qPCR, פלטפורמה מולקולרית ו ריאגנטים בשימוש באופן בלתי נמנע תניב תוצאות משתנה. עם זאת, וריאציות אלה ניתן יהיה לפתור אם התוצאות שקוף של פקדים חיצוניים ורמות מוחלטת עבור miRNAs בודדים הינם מסופקים. הערכת איכות המתאים של השיטה היא המפתח לשיפור הבחנה של שינויים ביולוגיים miRNA פרופיל מחקרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר יש אין ניגוד אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
המחקר הזה לא קיבל כל מענק ספציפי מהארגונים במגזר הציבורי, מסחריים, או שלא למטרות רווח.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | - | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
