Summary
Denne rapporten beskriver en protokoll for å måle de absolutte nivåene av plasma miRNA, bruker kvantitative sanntid omvendt transkripsjon PCR med eller uten pre forsterkning. Denne protokollen gir bedre forståelse av mengden av plasma miRNAs og lar kvalitativ vurdering av tilsvarende data fra forskjellige studier eller laboratorier.
Abstract
RT-qPCR er en av de vanligste metodene for å vurdere personlige mål miRNAs. MiRNAs nivåer er vanligvis målt i forhold til en referanse-prøve. Denne tilnærmingen er egnet for å undersøke fysiologiske endringer i målet gene expression nivåer. Absolutt kvantifisering bedre statistisk analyse er imidlertid å foretrekke for en helhetlig vurdering av gene expression nivåer. Absolutt kvantifisering er ikke fortsatt i vanlig bruk. Denne rapporten beskriver en protokoll for å måle de absolutte nivåene av plasma miRNA, bruker RT-qPCR med eller uten pre forsterkning.
Et fast volum (200 µL) av EDTA-plasma var forberedt fra blodet fra femur åre bevisst cynomolgus aper (n = 50). Totalt RNA ble hentet ved hjelp av kommersielt tilgjengelig system. Plasma miRNAs kvantifisert av sonden-baserte RT-qPCR analyser som inneholder miRNA-spesifikke forover/bakover PCR primer og sonde. Standard kurver for absolutt kvantifisering ble generert ved hjelp av kommersielt tilgjengelige syntetiske RNA-oligonucleotides. En syntetisk cel-miR-238 ble brukt som en ekstern kontroll for normalisering og kvalitet vurdering. MiRNAs som viste kvantifisering syklus (Cq) verdier over 35 var pre forsterket før qPCR trinnet.
Blant de 8 miRNAs undersøkt, var miR-122 og miR 133a, miR-192 synlig uten pre forsterkning, mens miR-1, miR-206 og miR-499a kreves før forsterkning på grunn av sin lave uttrykk nivåer. MiR-208a og miR-208b var ikke synlig selv etter pre forsterkning. Eksempel opparbeidningen effektiv ble evaluert av Cq verdiene til piggete cel-miR-238. I denne analysen metoden, teknisk variant var anslått til å være mindre enn 3 ganger og den laveste grensen for kvantifisering (LLOQ) var 102 kopi/µL, for det meste av det undersøkt miRNAs.
Denne protokollen gir et bedre estimat over mengden av plasma miRNAs, og tillater kvalitetsvurdering av tilsvarende data fra forskjellige studier. Vurderer det lave antallet miRNAs i kroppsvæsker, pre forsterkning er nyttig å forbedre gjenkjenning av dårlig uttrykt miRNAs.
Introduction
Et økende antall studier har vært å utforske microRNAs (miRNAs) som biomarkers for diagnose og prognose av kreft, eller overvåking og oppdage andre sykdommer i nonclinical og kliniske studier1,2,3 . Kvantitativ sanntid omvendt transkripsjon PCR (RT-qPCR) er en av de vanligste metodene brukes til å vurdere personlige mål miRNAs, fordi denne teknikken er mer følsom enn microarray4 og RNA sekvensering basert plattformer5. Generelt måles miRNA uttrykk i forhold til en referanse prøve bruker ΔCq metode6. Denne tilnærmingen er egnet for å undersøke fysiologiske endringer i målet gene expression nivåer. Relativ kvantifisering av sirkulerende miRNAs har imidlertid begrenset nytte på grunn av deres små mengder. I tillegg gjør tekniske variasjon det vanskelig å sammenligne resultatene fra forskjellige studier, fordi ulike laboratorier tilpasse RT-qPCR eksperimentelle protokollene annerledes, som fører til strid eller med motstridende resultater fra forskjellige studier7.
I lys av bekymringene nevnt, kan absolutt kvantifisering være mer egnet for vurdering av små mengder av miRNAs i kroppsvæsker. Den absolutte kvantifisering metoden bruker en standardkurve generert fra kjente konsentrasjoner av syntetiske RNA-oligonucleotides som er identisk i rekkefølge til tilsvarende målet miRNA8. Helse- og miljømessige Sciences Institute (HESI) teknisk komité for Genomics nylig gjennomført omfattende studier for å sammenligne resultatene av absolutt målinger av plasma miRNAs, på tvers av flere test nettsteder. Resultatene viste at ved hjelp av en standardprotokoll for absolutt kvantifisering av miRNAs gitt sammenlignbare resultater på tvers av flere test nettsteder9. RT-qPCR analysen metoden beskrevet studien er nesten identisk med den HESI standard-protokoll, som inkluderer multiplex analyse av flere miRNA mål og pre forsterkning å hjelpe oppdagelsen av lav uttrykket miRNAs.
I denne studien samlet et fast volum (200 µL) av EDTA-plasma forberedt fra blodet fra femur åre bevisst cynomolgus aper (n = 50) var brukte10. Følgende protokollen beskriver fremgangsmåten for utarbeidelse av plasmaprøver, utvinning av miRNA og RT-qPCR, inkludert pre forsterkning. Enda viktigere, har hvis du vil ha mer teknisk informasjon om protokollen vært inkludert, slik at antall mål miRNAs i utvalgene kan valideres i kombinasjon med en godt kvalifisert prosess. Først ble standardkurven av hver miRNA godkjent for sin personlige rekkevidde, før sin kvantifisering i biologiske prøver. Andre ble kvaliteten på den gjeldende metodikken grundig vurdert gjennom Cq verdier av en ekstern kontroll (cel-miR-238). Derfor gir denne plattformen mer informativ og pålitelige data for å sammenligne resultatene fra forskjellige studier eller laboratorier.
Profiler av 8 miRNAs er inkludert i denne rapporten som representant resultatene fra analysen metoden beskrevet her. Disse miRNAs er foreslått som mulige sikkerhet biomarkers tilknyttet vev skade leveren (miR-122 og miR-192), hjerte (miR-1, miR 208a, miR-208b og miR-499a) og skjelettlidelser muskel (miR-133a og miR-206) i gnagere og mennesker3, 11,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Daiichi Sankyo co, Ltd
1. sample forberedelse
- Samle blod (minst 0,5 mL) fra femur åre cynomolgus apekatter i EDTA 2K inneholder rør.
Merk: Citrate og heparin aksepteres ikke fordi disse antikoagulanter hemme påfølgende PCR14,15. - Plass de innsamlede eksemplene umiddelbart på isen og prosess for plasma isolasjon innen 2 timer etter samlingen.
- Sentrifuge prøvene 10.000 x g ved 4 ° C i 5 minutter.
- Overføre nedbryting til en 2 mL microtube, etterfulgt av sentrifugering 16.000 x g ved 4 ° C i 5 min fjerne celle rusk og gjenværende blodplater.
Merk: Kvantifisering av miRNAs kan påvirkes vesentlig av blodplater forurensning16. - Plasser 200 µL dele nedbryting i frisk 2 mL-microtubes, og lagre på-80 ° C før bruk.
Merk: Et fast antall hver prøve brukes for RNA utvinning; volumet av aliquot må derfor være nøyaktig.
2. RNA utvinning
- Tine frosne prøvene på is (fra trinn 1.5).
- Holde eksempel kaldt på is under RNA utvinning. Chill lysis reagens og kloroform på isen før bruk.
- Legg 5 volumer (1000 µL) av lyse reagens, som inneholder monophasic løsning av fenol og guanidine isothiocyanate, til prøven (200 µL), og bland kraftig av vortexing for 1 min.
- Legge til 5 µL av 5 nM syntetiske Caenorhabditis elegans miRNA (Syn-cel-miR-238-3 p).
- Legg 1 volum (200 µL) av kloroform, og bland kraftig ved vortexing for 1 min.
- Hold på is 2 til 3 minutter, og deretter virvel prøvene 12.000 x g på 4 ° C i 15 min.
- Overføre den vandige fasen nøye til en ny microtube.
Merk: Overfør ikke noen av organisk fase (rød) eller interphase (hvit). Volumet av den vandige fasen samlet skal uniform å unngå håndtering inkonsekvens, som resulterer i økt tekniske variasjon. Så mange vandige fasen i denne protokollen var 650 µL. - Legg 1,5 volumer (975 µL) av etanol, og bland godt pipettering opp og ned.
- Overføre prøven til en tilsvarende kolonne og adapter, etterfulgt av vakuumtørking for 3 min bruker vakuum manifolder. Hvis prøven volumet er mer enn 700 µL, Gjenta dette trinnet for å behandle de resterende løsningen.
Merk: Kolonne-baserte RNA isolasjon er kompatibel med vakuum og sentrifugering. - Legge til 200 µL av etanol kolonnen etterfulgt av vakuumtørking for 1 min.
- Legge til 800 µL RWT bufferen i kolonnen etterfulgt av vakuumtørking i 2 minutter.
- Legge til 800 µL RPE bufferen i kolonnen etterfulgt av vakuumtørking i 2 minutter.
- Gjenta trinn 2.11.
- Legge til 300 µL av etanol kolonnen etterfulgt av vakuumtørking for 1 min.
- Plasser kolonnen på en ny microtube, og sentrifuge 12.000 x g ved romtemperatur (15 til 25 ° C) for 1 min.
- Overføre kolonnen til en ny microtube, og Legg 50 µL nuclease uten vann.
- Stå ved romtemperatur (15 til 25 ° C) 3 min og sentrifuge 8000 × g ved romtemperatur (15 til 25 ° C) for 1 min.
- Å bruke eluate til kolonnen.
- Gjenta trinn 2,16 og lagre eluate på-80 ° C før bruk.
3. cDNA syntese
- Tine frosne prøvene (fra trinn 2,18).
-
Forberede kjent konsentrasjon av syntetiske RNA oligonucleotides som samsvarer med målet miRNAs.
- Bruke syntetisk RNA-oligonucleotide for å generere en standardkurve i qPCR. Lagerløsning 1 x 108 kopi/µL konsentrasjon er forberedt for lagring formål.
- Fortynne lager løsningen 10-fold for å få 1 x 107 kopi/µL (ikke pre forsterket eksempler) eller 1 x 105 kopi/µL (pre forsterket eksempler) fungerende løsning som den høyeste konsentrasjonen konstruere standardkurven. Generelt, er en foreslåtte området for standardkurve konsentrasjoner 1 x 107 til 1 x 102 kopi/µL (ikke pre forsterket eksempler) eller 1 x 105 til 1 x 100 kopi/µL (pre forsterket eksempler).
- Forberede multiplex RT primer bassenget ved å blande like volum av 20 x RT primere for målet miRNAs.
Merk: Som vist i figur 2, et basseng som inneholder opptil 4 målet miRNAs kan gjøres ved å blande 20 x RT primerne hver av miRNAs i bassenget. Cel-miR-238 (ekstern kontroll) må inkluderes som en av det mål miRNAs i hver retning. Ved mindre enn 4 målet miRNAs, legge like volum 1/10 TE bufferen i stedet for 20 x RT primer. - Forberede RT reaksjonen blanding: 3 µL av RT primer svømmebasseng (fra trinn 3.3), 0,15 µL av 100 mM dNTPs med dTTP, 1 µL revers transkriptase (50 U/µL), 1,5 µL 10 x RT buffer, 0,19 µL av RNase hemmer (20 U/µL) og 4,16 µL av nuclease uten vann.
- Bland 10 µL RT reaksjon bland med 5 µL av RNA prøve (fra trinn 3.1) eller oligonucleotides (fra trinn 3.2) av pipettering og ruge på is 5 min.
- Kjøre omvendt transkripsjon på en termisk cycler apparater: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 min, etterfulgt av en siste revers transkriptase inaktivering trinn på 85 ° C i 5 min. Store omvendt transkribert samples ved-80 ° C før bruk.
4. preamplification (valgfritt)
Merk: MiRNAs som viser Cq verdier over 35 eller mer i påfølgende qPCR er pre forsterket.
- Tine frosne prøvene (fra trinn 3.6).
- Lage 10 ganger føljetong fortynninger av RT produkt fra syntetiske RNA oligonucleotides; 1 x 105 til 1 x 100 kopi/µL for generering av standardkurve.
- Forberede multiplex analysen primer bassenget ved å blande like volum (5 µL) 20 x analysen primere målet miRNAs med siste konsentrasjonen av hver analysen primer blir fortynnet 200-fold av TE buffer i et siste volum på 1000 µL.
Merk: Analysen primerne som mål miRNAs kan være i påfølgende qPCR uten pre forsterkning og for cel-miR-238 (ekstern kontroll) er ikke inkludert i primer bassenget. - Forberede pre forsterkning reaksjonen blanding: 12.5 µL av 2 x klar-å-bruke preamplification reagens, 3.75 µL av analysen primer (fra trinn 4.3) og 6,25 µL nuclease uten vann.
- Mix 22,5 µL pre forsterkning reaksjon bland med 2,5 µL av omvendt transkribert prøve (fra trinn 4.1) eller oligonucleotides (fra trinn 4.2) av pipettering og ruge på is 5 min.
- Kjøre reaksjon på en termisk cycler apparater: 95 ° C i 10 min; etterfulgt av 12 sykluser av 95 ° C for 15 s og 60 ° C i 4 min. lagre pre forsterket prøver-80 ° c før bruk.
5. kvantitativ sanntid PCR (qPCR)
- Tine frosne prøvene (fra trinn 3.6 eller trinn 4.6).
- Fortynne prøvene 5-fold med sterilt vann.
- Forberede 10 ganger føljetong fortynninger av RT produktet avledet fra syntetiske RNA oligonucleotides; 1 x 107 til 1 x 102 kopi/µL (ikke pre forsterket eksempler) eller 1 x 105 til 1 x 100 kopi/µL (pre forsterket eksempler) for å generere standard kurver.
- Forberede qPCR reaksjonen blanding: 10 µL av 2 x klar-å-bruke forsterkning reagens, 1 µL av 20 x analysen reagens, som inneholder forover/bakover PCR primer og sonde tilsvarer målet miRNA, og 7 µL nuclease uten vann.
- Overføre 18 µL fra qPCR reaksjonen blanding til fast optisk 96-brønns reaksjon platene, og Legg 2 µL av fortynnede prøvene (fra trinn 5.2 eller trinn 5.3) i brønnene.
Merk: Utvalg og standarder for qPCR er satt opp i duplikater. - Forsegle platen med lim og sentrifuge kort.
- Kjøre reaksjon på en sanntid termisk cycler: 95 ° C for 20 s, etterfulgt av 45 sykluser av 95 ° C for 1 s og 60 ° C for 20 s.
6. dataanalyse
- Beregne rå kopien antall hvert utvalg bruker dataanalyse programvare som fungerer med tilsvarende sanntid termisk cycler.
Merk: Terskelverdi line settes manuelt til "1.0" i alle platene i studien, bekrefte reproduserbarhet sammenliknet med deres Cq vales. Cut-off angis på Cq > 40 sykluser. - Beregne gjennomsnittet av rå kopien antall hvert utvalg fra duplikater.
- Beregne korrigeringsfaktoren ved kopi flere cel-miR-238 i hvert utvalg med gjennomsnittet av antall kopier av cel-miR-238 fra alle prøvene i et tilsvarende rør.
Merk: Som vist i figur 2, hver rør inneholder opptil 4 målet miRNAs inkludert cel-miR-238 (ekstern kontroll). Derfor beregnes korrigeringsfaktoren for hver rør med tilsvarende cel-miR-238 verdi. - Beregne hvor justert kopi ved å dele gjennomsnitt rå kopien antall hver prøve (fra trinn 6.2) ved korrigeringsfaktoren (fra trinn 6.3) for hvert utvalg.
- Beregne hvor absolutt kopi ved å multiplisere justert rå kopien antall hver prøve (fra trinn 6.4) av den fortynningsfaktoren for hvert utvalg.
Merk: Fortynningsfaktoren er "5" i denne protokollen, som er avledet fra trinn 5.2. - Beregne effektiviteten av PCR forsterkning fra skråningen av tomten Cq verdiene for hver serielle fortynning mot Logg cDNA konsentrasjon.
Merk: Formelen for å beregne effektiviteten; E = (10(-1/skråningen) -1) x 100%. - Beregne tekniske variasjonen bruke Cq av cel-miR-238 fra alle prøver ved hjelp av formelen E = (2 x forsterking effekten)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
Merk: Trinn 6.5 og 6.7 brukes for kvalitetsvurdering av prosedyren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbeidsflyt miRNA analysen av RT-qPCR og kvalitet assessment
Figur 1 viser arbeidsflyten miRNA analysen fra blodprøver som bruker qPCR10. Kvaliteten av eksperimenter kan verifiseres ved å inkludere cel-miR-238 som en ekstern kontroll. Dette vil avdekke tekniske variasjoner i RNA utvinning og påfølgende RT-qPCR prosesser. I denne studien var gjennomsnittlig ± SD Cq verdiene beregnet fra 50 prøver 21.0 ± 0,4 (tabell 1). Hvis cel-miR-238 ble utvannet på grunn av det pre forsterkning trinnet, var Cq verdien 24.2 ± 0,4 (tabell 1). I analysen metoden beskrevet her, ble omfanget av tekniske variasjon anslått for å være mindre enn 3 ganger basert på forskjellen i Cq verdiene. Graden av variasjon bodde konsekvent selv når ekstra pre forsterkning trinn måtte inkluderes. Disse verdiene er kompatibel med de for andre prøver fra forskjellige dyrearter, som mus, rotter og mennesker utført i dette laboratoriet (data ikke vist).
Synlig område fra standardkurven for målet miRNA
Ingen pre forsterkning av prøvene
Omvendt transkribert (RT) produktet fra syntetiske RNA oligonucleotides i konsentrasjoner av 1 x 107 kopi/µL var serielt utvannet før påfølgende qPCR. Disse seriene ble brukt for å generere standardkurven som sikret konsekvent dekning av alle biologiske prøver som var synlig uten pre forsterkning trinn. Cq verdiene for standard prøven på 1 x 102 kopi/µL konsentrasjon var nær kuttet av nivåer for hvert mål miRNA. Derfor ble oppdagelsen grensen anslått til 1 x 102 kopi/µL (Figur 3).
Pre forsterket prøver
For å bestemme synlig dataområdet prøvene krever pre forsterkning, ble to forskjellige serier av fortynnede prøver sammenliknet, som vist i Figur 4. For å generere standardkurve A, ble seriell fortynninger av RT produktet før pre forsterkning trinn utarbeidet. Da ble en rekke pre forsterket standarder brukt for påfølgende qPCR. For å generere standardkurve B, ble den første fortynning gjort av pre forsterket prøver å en konsentrasjon av 1 x 105 kopi/µL. Disse standard kurvene viste tilsynelatende annerledes oppdagelsen grenser (figur 5). Selv om standardkurve B viste lineær rekke økning til 1 kopi/µL standardkurve A kan ikke brukes for bestemte amplicons i konsentrasjoner på mindre enn 102 eller 103 kopi/µL (figur 5). Dette resultatet foreslo at svært små mengder miRNAs ikke kan vurderes selv med pre forsterkning trinn. I tillegg pre forsterket prøvene skal fortolkes med forsiktighet når Cq verdiene er > 30, fordi oppdagelsen grensene pre forsterket prøvene var nær denne verdien. Derfor som regel ble standardkurve B brukt i metoden beskrevet her, etter at det oppdages området, bare for å unngå å bruke standard tomter antall.
Derfor var den laveste grensen for kvantifisering (LLOQ) 102 kopi/µL for de fleste av miRNAs (Figur 3 og figur 5). Bare miR-1 viste en høyere LLOQ (103 kopi/µL) (figur 5). Gjennomsnittlig forsterkning effektiviteten var ca 90%, med korrelasjonskoeffisienten (R2) av standard kurver, fra 0.998 til 1,000. Kjennetegnene av nøyaktig RT-qPCR analysen anses å være en lineær R2 lik eller større enn 0,98 og en PCR forsterkning effektivitet 90 til 110%17. Derfor ble kvaliteten på standard kurvene i analysen bekreftet.
Effekter av pre forsterkning for små mengder av miRNAs
MiRNAs som viste Cq verdier over 35 eller høyere i påfølgende qPCR var pre forsterket. Denne prosedyren forbedret påvisning av små mengder miRNAs. For eksempel var Cq verdiene (gjennomsnittlig ± SD) for ikke-pre-forsterket miR-206 37.9 ± 1.9, mens pre forsterket miR-206 redusert til 27,0 ± 2.2. Betydelige forskjeller mellom like måling par ble observert i ikke-pre-forsterket samples ved høye Cq verdier (figur 6). Derimot pre forsterket prøver viste nesten like verdier i duplikater (figur 6). Disse resultatene indikerte at pre forsterkning ville være effektive for å gi mer nøyaktige og pålitelige data i tilfeller av små mengder prøver.
Profilering av plasma miRNAs i cynomolgus aper
Ved hjelp av etablerte analysen plattformen, analysert Plasmanivåer av 8 miRNAs (miR-1, miR-122, miR 133a, miR-192, miR-206, miR 208a, miR-208b og miR-499a) fra 50 cynomolgus apene var (figur 7)10. I denne analysen var miR-122 og miR 133a, miR-192 synlig uten pre forsterkning, mens miR-1, miR-206 og miR-499a kreves før forsterkning på grunn av sin lave uttrykk nivåer. Men var miR-208a verken miR-208b synlig selv med pre forsterkning. Dataene ble ikke er normalt distribuert; Derfor ble en logaritmisk transformasjon utført for å beregne sine middelverdi og standardavvik. Blant miRNAs undersøkt, miR-122 viste mener plasma-høyeste (5,71 x 104 kopi/µL), med et lite dynamisk område (20-fold). I kontrast, store dynamiske områder ble observert for miR-1 (581-fold), miR-133a (971-fold), og miR-206 (426-fold).
Figur 1 : Skjematisk arbeidsflyt miRNA analysen av RT-qPCR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Skjematisk arbeidsflyt omvendt transkripsjon miRNA analysen. Et basseng som inneholder opptil 4 målet miRNAs kan gjøres ved å blande 20 x RT primerne hver av miRNAs i bassenget. Cel-miR-238 (ekstern kontroll) må inkluderes som en av det mål miRNAs i hver retning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| miR-238 dataanalyse | ||
| Uten Pre forsterkning |
Med Pre forsterkning |
|
| N | 50 | 50 |
| Mener | 21.0 | 24,2 |
| SD | 0,4 | 0,4 |
| Max Cq | 21.8 | 25.3 |
| Min Cq | 20,3 | 23,5 |
| Median | 21.0 | 24,2 |
| Max-Min | 1.3 | 1.8 |
| Forsterkning effekt | 89 | 89 |
| Variasjon | 2.4 | 2.8 |
Tabell 1: kvalitetsvurdering bruke kvantifisering syklus (Cq) av cel-miR-238. Teknisk varianter ble vurdert på Cq verdiene til miR-238 i hver analysen. Femti prøver ble delt i to grupper tilsvarer med (høyre) eller uten (venstre) før forsterkning trinn. Variant beregnet ved hjelp av formelen E = (2 x forsterking effekten)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). Forsterkning effekten ble beregnet fra skråningen av standardkurve. Prøvene krever pre forsterkning trinn ble utvannet under pre forsterkning trinnet (miR-238 selv var ikke pre forsterket). Dette tallet er endret fra vår rapport10.
Figur 3 : Plot standard kurver for ikke-pre-forsterket prøver. Standard kurver (N = 3, like) ble generert ved å plotte Logg konsentrasjonen versus Cq. lineær regresjonsanalyse var beregnet for å bestemme skråningen, som tilsvarer forsterkning effektiviteten. Standard kurver for miR-122 (øvre), miR-192 (midten) og miR-133a (nedre) viste lineær sammenheng mellom Cq og konsentrasjon på testet området. Standard kurvene representerer feilfelt ett standardavvik fra tre uavhengige analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Prosedyre for å generere standard kurver for pre forsterket prøver. (Standardkurve A) En representant konsentrasjon av syntetiske oligo (1 x 105 kopi/µL) var omvendt transkribert, etterfulgt av forbereder 10 ganger føljetong fortynning rekke standard prøven. Disse pre forsterket standardene ble brukt for påfølgende qPCR. (Standardkurve B) En representant konsentrasjon av syntetiske oligo (1 x 105 kopi/µL) var omvendt transkribert og pre forsterket. Deretter var en 10 ganger føljetong fortynning rekke standard prøver forberedt før påfølgende qPCR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Handlingen i standard kurver A og B for pre forsterket prøver. Standardkurve A (n = 1, dupliserte) og standardkurve B (n = 3, like) ble generert ved å plotte Logg konsentrasjonen versus Cq. lineær regresjonsanalyse var beregnet for å bestemme skråningen, som tilsvarer forsterkning effektiviteten. (Øvre) Standardkurve en (stiplet linje) viste tilsynelatende ikke-spesifikk amplicon på 1 x 102 kopi/µL, mens standardkurve B (heltrukket linje) viste lineær sammenheng mellom Cq og konsentrasjon på testet området av miR-1. (Midten og lavere) Standardkurve en (stiplet linje) viste ingen amplicon i konsentrasjoner på 1 x 102 kopi/µL eller lavere, mens standard kurve B (heltrukket linje) viste lineær sammenheng mellom Cq og konsentrasjon på testet rekke miR-499a og miR-206. I standardkurven B representerer feilfelt ett standardavvik fra tre uavhengige analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Forsterkning tomten for ikke-pre-forsterket og pre forsterket. (Øvre) forsterkning tomt miR-206 i representative utvalg (A, B, C) uten (øvre), eller med pre forsterkning (nedre). Målinger ble satt opp i duplikat. Det var forskjeller mellom de to utvalgene som duplikater i ikke-pre-forsterket prøver, spesielt i høyere Cq prøver (A og B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Absoluttverdien til plasma microRNAs (miRNAs) i cynomolgus aper. Uttrykket nivåer av miRNAs representeres av dot tomter. Gjennomsnittet, og verdien for to standard avvik nedenfor og over gjennomsnittet (vist i grå boks), var bestemt etter en logaritmisk transformasjon. Dette tallet er endret fra vår rapport10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår omfattende vurdering gitt en strengere statistisk analyse av omfanget av det dynamiske området, som klart indikerte at omfanget av variasjon mellom individuelle prøvene var svært forskjellige blant miRNAs testet. Selv om disse variasjonene kan være knyttet til deres små mengder i kroppsvæsker, bør det bemerkes at disse dataene gjenspeiler ikke bare biologiske varianter, men også teknisk varianter. De fleste av tekniske variasjonen kan vurderes ved Cq verdiene til eksterne kontrollen (cel-miR-238), som brukes i andre analysen plattformer18. Siden det har vært noen standardisert internkontroll miRNA analyse, skal informasjon om tekniske variant inkluderes i analysen, for å bestemme kvaliteten på analysen19. Teknisk variant var anslått til å være mindre enn 3 ganger i metoden beskrevet i denne rapporten. Selv om det ikke er mulig å fastslå kvalitetsnivået for denne prosedyren på grunn av sammenlignbare teknisk informasjon i annen forskning, inkludert informasjon bidrar til å forbedre påliteligheten og sikrer kompatibilitet mellom forskjellige studier.
En rekke nyere verk har rapportert at ulike pre analytisk variablene som eksempel håndtering, lagringsforhold og lagring varighet før behandling kan påvirke pålitelighet og reproduserbarhet av sirkulerende miRNA målinger20 , 21. selv om denne studien ikke ta i betraktning effekten av pre analytisk variabler, følgende ble fulgt nøye under eksempel forberedelse å minimere varianter. Først ble plasma behandlet så raskt som mulig (innen 2 timer etter samlingen) for å redusere effekten av stabiliteten i miRNAs i plasma8,22. Selv miRNAs anses å være stabile ved romtemperatur (15 til 25 ° C), er det fortsatt uklart om intervallet mellom blod samling og bearbeiding av plasma eller serum påvirker miRNA nivåer. Andre var hver plasmaprøve visuelt inspisert for å eliminere analytisk bias stammer fra forurensning med hemolyzed røde blod celler, som representerer en forvirrende faktorer som kan påvirke nivåene av sirkulerende miRNAs23.
Pre forsterkning er nyttig å forbedre gjenkjenning av svært små mengder miRNAs i biofluids uten å innføre en gjenkjenning bias24. I studien viste Cq verdiene av standard kurver bygget ved hjelp av pre forsterket syntetisk oligonucleotides høy reproduserbarhet over analyser. Dette tillot absolutt kvantifisering pre forsterket utvalg, som gjorde oppdagelsen av små mengder miRNAs. På den annen side, viser lav kopi nummer standarder (1 x 102 eller 103 kopi/µL) ikke bestemte amplicons, i kombinasjon med pre forsterkning. Mestdagh et al. 24 rapportert at måling av lav kopi nummer miRNAs viste større variasjon etter pre forsterkning, sammenlignet med moderat eller høy kopi nummer miRNAs, på grunn av lav effektiviteten av omvendt transkripsjon, som kan være et resultat av miRNA sekvensen egenskaper. Derfor må rekkevidde av standard kurver for hver miRNA valideres før kvantifisering av biologiske prøver, spesielt for pre forsterket miRNAs, eliminere falske positive resultater. Enda viktigere, må det bemerkes at de absolutte nivåene av annerledes behandlet miRNAs som pre forsterket og ikke-pre-forsterket ikke kan sammenlignes direkte fordi antallet pre forsterket prøven ikke er angitt i hver miRNA.
Denne rapporten beskriver en fremgangsmåte for fastsettelse av absolutt miRNA i plasmaprøver bruker RT-qPCR. Noen miRNAs ble ikke oppdaget selv etter pre forsterkning. For å oppdage slike lave uttrykk miRNAs, må en annen tilnærming brukes. Selv bruker et større utvalg-antall kan omgå dette problemet som en enkel løsning, er store mengder prøven ikke alltid tilgjengelig. Hittil har teknologiske fremskritt aktivert utviklingen av ulike plattformer for miRNA profilering25,26. Slippverktøy digital PCR (ddPCR) har blitt utviklet nylig og tilbyr en alternativ metode til konvensjonelle RT-qPCR for absolutt kvantifisering. Denne innovative teknologien har blitt rapportert å være en presis, reproduserbare og følsom som kan oppdage et mål miRNA på nivå 1 kopi/µL27,28. Hvis ddPCR kan gjenkjenne en lav konsentrasjon av miRNAs uten en pre forsterkning trinnet, ville det være en stor fordel fordi nivåer av flere miRNAs kan være i forhold til hverandre. Endringer i utvinning prosedyrer og påfølgende RT-qPCR, molekylær plattform og anvendte reagensene vil uunngåelig gi variable resultater. Men kan disse variasjonene løses hvis gjennomsiktig resultatene av eksterne kontroller og absolutt nivåer for individuelle miRNAs tilbys. Aktuelle kvalitetsvurdering av metoden er nøkkelen til bedre dømmekraft biologiske endringer i miRNA profilering studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har noen interessekonflikt avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen mottok ikke noen bestemt grant fra virkemiddelaktører innen offentlig, kommersielle eller ikke-for-profit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | - | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
