Denne rapporten beskriver en protokoll for å måle de absolutte nivåene av plasma miRNA, bruker kvantitative sanntid omvendt transkripsjon PCR med eller uten pre forsterkning. Denne protokollen gir bedre forståelse av mengden av plasma miRNAs og lar kvalitativ vurdering av tilsvarende data fra forskjellige studier eller laboratorier.
RT-qPCR er en av de vanligste metodene for å vurdere personlige mål miRNAs. MiRNAs nivåer er vanligvis målt i forhold til en referanse-prøve. Denne tilnærmingen er egnet for å undersøke fysiologiske endringer i målet gene expression nivåer. Absolutt kvantifisering bedre statistisk analyse er imidlertid å foretrekke for en helhetlig vurdering av gene expression nivåer. Absolutt kvantifisering er ikke fortsatt i vanlig bruk. Denne rapporten beskriver en protokoll for å måle de absolutte nivåene av plasma miRNA, bruker RT-qPCR med eller uten pre forsterkning.
Et fast volum (200 µL) av EDTA-plasma var forberedt fra blodet fra femur åre bevisst cynomolgus aper (n = 50). Totalt RNA ble hentet ved hjelp av kommersielt tilgjengelig system. Plasma miRNAs kvantifisert av sonden-baserte RT-qPCR analyser som inneholder miRNA-spesifikke forover/bakover PCR primer og sonde. Standard kurver for absolutt kvantifisering ble generert ved hjelp av kommersielt tilgjengelige syntetiske RNA-oligonucleotides. En syntetisk cel-miR-238 ble brukt som en ekstern kontroll for normalisering og kvalitet vurdering. MiRNAs som viste kvantifisering syklus (Cq) verdier over 35 var pre forsterket før qPCR trinnet.
Blant de 8 miRNAs undersøkt, var miR-122 og miR 133a, miR-192 synlig uten pre forsterkning, mens miR-1, miR-206 og miR-499a kreves før forsterkning på grunn av sin lave uttrykk nivåer. MiR-208a og miR-208b var ikke synlig selv etter pre forsterkning. Eksempel opparbeidningen effektiv ble evaluert av Cq verdiene til piggete cel-miR-238. I denne analysen metoden, teknisk variant var anslått til å være mindre enn 3 ganger og den laveste grensen for kvantifisering (LLOQ) var 102 kopi/µL, for det meste av det undersøkt miRNAs.
Denne protokollen gir et bedre estimat over mengden av plasma miRNAs, og tillater kvalitetsvurdering av tilsvarende data fra forskjellige studier. Vurderer det lave antallet miRNAs i kroppsvæsker, pre forsterkning er nyttig å forbedre gjenkjenning av dårlig uttrykt miRNAs.
Et økende antall studier har vært å utforske microRNAs (miRNAs) som biomarkers for diagnose og prognose av kreft, eller overvåking og oppdage andre sykdommer i nonclinical og kliniske studier1,2,3 . Kvantitativ sanntid omvendt transkripsjon PCR (RT-qPCR) er en av de vanligste metodene brukes til å vurdere personlige mål miRNAs, fordi denne teknikken er mer følsom enn microarray4 og RNA sekvensering basert plattformer5. Generelt måles miRNA uttrykk i forhold til en referanse prøve bruker ΔCq metode6. Denne tilnærmingen er egnet for å undersøke fysiologiske endringer i målet gene expression nivåer. Relativ kvantifisering av sirkulerende miRNAs har imidlertid begrenset nytte på grunn av deres små mengder. I tillegg gjør tekniske variasjon det vanskelig å sammenligne resultatene fra forskjellige studier, fordi ulike laboratorier tilpasse RT-qPCR eksperimentelle protokollene annerledes, som fører til strid eller med motstridende resultater fra forskjellige studier7.
I lys av bekymringene nevnt, kan absolutt kvantifisering være mer egnet for vurdering av små mengder av miRNAs i kroppsvæsker. Den absolutte kvantifisering metoden bruker en standardkurve generert fra kjente konsentrasjoner av syntetiske RNA-oligonucleotides som er identisk i rekkefølge til tilsvarende målet miRNA8. Helse- og miljømessige Sciences Institute (HESI) teknisk komité for Genomics nylig gjennomført omfattende studier for å sammenligne resultatene av absolutt målinger av plasma miRNAs, på tvers av flere test nettsteder. Resultatene viste at ved hjelp av en standardprotokoll for absolutt kvantifisering av miRNAs gitt sammenlignbare resultater på tvers av flere test nettsteder9. RT-qPCR analysen metoden beskrevet studien er nesten identisk med den HESI standard-protokoll, som inkluderer multiplex analyse av flere miRNA mål og pre forsterkning å hjelpe oppdagelsen av lav uttrykket miRNAs.
I denne studien samlet et fast volum (200 µL) av EDTA-plasma forberedt fra blodet fra femur åre bevisst cynomolgus aper (n = 50) var brukte10. Følgende protokollen beskriver fremgangsmåten for utarbeidelse av plasmaprøver, utvinning av miRNA og RT-qPCR, inkludert pre forsterkning. Enda viktigere, har hvis du vil ha mer teknisk informasjon om protokollen vært inkludert, slik at antall mål miRNAs i utvalgene kan valideres i kombinasjon med en godt kvalifisert prosess. Først ble standardkurven av hver miRNA godkjent for sin personlige rekkevidde, før sin kvantifisering i biologiske prøver. Andre ble kvaliteten på den gjeldende metodikken grundig vurdert gjennom Cq verdier av en ekstern kontroll (cel-miR-238). Derfor gir denne plattformen mer informativ og pålitelige data for å sammenligne resultatene fra forskjellige studier eller laboratorier.
Profiler av 8 miRNAs er inkludert i denne rapporten som representant resultatene fra analysen metoden beskrevet her. Disse miRNAs er foreslått som mulige sikkerhet biomarkers tilknyttet vev skade leveren (miR-122 og miR-192), hjerte (miR-1, miR 208a, miR-208b og miR-499a) og skjelettlidelser muskel (miR-133a og miR-206) i gnagere og mennesker3, 11,12,13.
Vår omfattende vurdering gitt en strengere statistisk analyse av omfanget av det dynamiske området, som klart indikerte at omfanget av variasjon mellom individuelle prøvene var svært forskjellige blant miRNAs testet. Selv om disse variasjonene kan være knyttet til deres små mengder i kroppsvæsker, bør det bemerkes at disse dataene gjenspeiler ikke bare biologiske varianter, men også teknisk varianter. De fleste av tekniske variasjonen kan vurderes ved Cq verdiene til eksterne kontrollen (cel-miR-238), som brukes…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen mottok ikke noen bestemt grant fra virkemiddelaktører innen offentlig, kommersielle eller ikke-for-profit.
BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | – | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
Buffer RPE | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
Buffer RWT | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |