Summary
介绍了将工程化的 split-TET2 酶 (苹果酒) 引入哺乳动物细胞中用于化学诱导 DNA 化和后生重塑的详细协议。
Abstract
DNA 甲基化是哺乳动物基因组中一种稳定且可遗传的表观遗传修饰, 参与调控基因表达以控制细胞功能。dna 甲基化的逆转, 或 dna 甲基, 是介导的十-十一易位 (春节) 蛋白家族的 dioxygenases。尽管人们广泛报道, 异常 DNA 甲基化和甲基与发育缺陷和癌症有关, 但这些表观遗传变化如何直接导致基因表达或疾病进展的改变仍然不清楚, 主要是由于缺乏可靠的工具来精确地在定义的时间和空间分辨率下在基因组中添加或删除 DNA 修饰。为了克服这一障碍, 我们设计了一种 split-TET2 酶, 使时间控制 5-嘧啶 (5mC) 氧化, 并随后重塑哺乳动物细胞中后生状态的简单添加化学物质。在这里, 我们介绍了引进一种化学诱导基因重塑工具 (苹果酒) 的方法, 基于工程化的 split-TET2 酶, 进入哺乳动物细胞和量化的化学诱导生产的 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) 与免疫, 流式细胞仪或斑点杂交法。这种化学诱导基因重塑工具将发现广泛使用在审讯蜂窝系统不改变遗传密码, 以及在探索 epigenotype−phenotype 关系的各种生物系统。
Introduction
dna 甲基化, 主要是指添加一个甲基组的碳5位胞嘧啶形成 5-嘧啶 (5mC), 是由 dna 甲基转移 (DNMTs) 催化。5mC 作为哺乳动物基因组中的主要后生标记, 通常信号为转录抑制, X 染色体失活和转沉默1。DNA 甲基化的逆转是由十-精灵易位 (春节) 蛋白家族介导的。春节酶属于铁 (II) 和 2-二依赖性 dioxygenases, 催化连续氧化5mC 至 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) 和 5-carboxycytosine (5caC)。由春节介导的5mC 氧化对哺乳动物的基因组施加了额外的后生控制层。春节的发现激发了人们对表观遗传学领域的浓厚兴趣, 揭示了春节蛋白质及其主要催化产品5hmC 的生物学功能。5hmC不仅是在春节介导的活性 DNA 甲基2,3,4, 但也作为一个稳定的后生标记5,6,7,,8.尽管 dna 化与基因表达和 dna 化的异常变化密切相关, 但与一些人类疾病有关9,10,11, 因果关系在 dna 的后生修饰和表型之间往往仍然具有挑战性的建立, 这可以部分归因于缺乏可靠的工具, 以准确添加或删除 dna 修改在定义的时间和空间基因组决议.
在这里, 我们报告了使用化学诱导的基因重塑工具 (苹果酒) 克服的障碍, 研究的因果关系 DNA 化和基因转录。该设计的假设是, TET2 (TET2CD) 的催化领域可以分为两个非活性片段时, 表达的哺乳动物细胞和它的酶功能可以恢复通过采取化学诱导二方法 (图 1A)。为了建立一个 split-TET2CD 系统, 我们选择了六个 TET2CD, 由一个胱氨酸丰富的地区和双β螺旋 (DSBH) 褶皱组成, 根据报告的 TET2-DNA 复杂的晶体结构, 缺乏低复杂度区域12。一种合成的基因编码雷帕霉素诱导的二模块 FK506 结合蛋白 12 (FKBP12) 和 FKBP 雷帕霉素结合域 (FRB) 的哺乳动物目标的雷帕霉素14,15, 连同 self-cleaving 肽 T2A多肽序列16,17, 分别插入到 TET2CD 中的选定拆分站点中。选择 TET2 作为我们的工程目标是基于以下考虑。首先, TET2 的体细胞突变与伴随减少的 DNA 化在人类疾病中经常被观察到, 包括髓系疾病和癌症10, 它提供了有关敏感站点的有用信息, 以避免插入.第二, TET2 催化域的很大一部分, 特别是低复杂度区域, 对于酶函数12是可有可无的, 从而使我们能够为诱导的后生修饰创造一个最小的 split-TET2。在筛查超过15构造后, 在哺乳动物系统中选择了一种最高的雷帕霉素诱导还原酶活性的结构, 并被指定为苹果酒18。我们在此描述的使用 mCherry 标签苹果酒, 以实现诱导 DNA 化和表观遗传重塑与雷帕霉素, 并提出三方法验证苹果酒介导的5hmC 生产在一个模型蜂窝系统 HEK293T。
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Protocol
1. 细胞培养、质粒转染和化学诱导
- 培养一个黏附细胞线 (例如, 人的胚胎肾脏 HEK293T 细胞) 在 Dulbecco 的修改过的老鹰的媒介 (DMEM), 补充与10% 热失活胎牛血清, 100 U/毫升青霉素和链霉素在37° c 与 5% CO2。
- 染细胞与苹果酒质粒。
- 至少18小时前转染, 种子 0.3 x 106细胞在2.5 毫升适当 DMEM 每井在 6-井板和孵育细胞在37° c 过夜达到 60-80% 70-100。
- 在使用前将转染试剂预热到室温下。
- 在无菌管中放置250µL 无血清培养基。
注: 这一数额是为一个 6-井板 80% 70-100。如果需要, 按比例调整中等数量根据板材或细胞数字的大小。 - 添加2.5 µg 的质粒编码苹果酒18或 TET2 的催化领域 (TET2CD 为阳性对照)12,13进入无血清培养基, 并由移轻轻混合。
- 在稀释的 DNA 混合物中加入7.5 µL 转染试剂, 并由移轻轻混合。
- 室温下孵育混合物20-30 分钟。
- 改变5ml 介质, 将混合物 drop-wise 到井中, 轻轻摇动细胞培养板, 均匀地分配转染试剂和 DNA 混合物。
- 在一夜之间孵育细胞和混合物, 然后用2ml 的新鲜完整的 DMEM 取代含有培养基的转染试剂。
- 化学诱导
- 稀释2毫米的雷帕霉素库存 (在亚甲基亚砜中溶解) 到20µM 在适当的完整培养基中的浓度。
- 在2毫升培养基中加入20µL 稀释的雷帕霉素, 以达到 200 nM 的最终浓度。
注: 在孵育48小时后, 细胞可用于量化5hmC 代或任何其他下游应用。如果需要, 可以通过取出每3小时的细胞来监测感应效率, 如下所述, 并显示在图 1中。 - 为了更好地量化5hmC 感应效率, 种子分离井每3小时监测细胞。
2. 免疫对雷帕霉素诱导的5hmC 产量的定量
- 5hmC 免疫荧光染色
注: 添加足够数量的固定液, 由4% 甲醛, 0.2% 表面活性剂 (如海卫 X-100) 在 PBS 与 3 N HCl, 以覆盖所有的细胞在板块。例如, 500 µL 的溶液对一个6井板的井来说就足够了。在室温下执行所有步骤。- 为了修复细胞, 在室温下, 在 PBS 中添加4% 甲醛到雷帕霉素治疗的细胞15分钟。对于对照组, 使用无雷帕霉素治疗的 mCherry 苹果酒的细胞。不要鼓动。
警告: 甲醛是有毒的。穿戴适当的保护。 - 丢弃定影液。在 PBS 中孵育0.2% 表面活性剂的固定细胞30分钟 permeabilize 细胞膜。
- 丢弃性的解决方案。在化细胞中加入3的 HCl, 孵育15分钟以变性 DNA。
- 丢弃 hcl. 将100毫米的三盐酸缓冲液 (ph 8.0) 添加到细胞中, 10 分钟用于中和 ph 值。
- 丢弃所有解决方案。用 PBS 彻底冲洗细胞3-5 次。彻底删除 PBS。
注: 为每个洗涤步骤添加足够数量的 PBS。例如, 1 毫升的 PBS 是足够的6井板。 - 通过在 PBS 中添加包含 1% BSA 和0.05% 的表面活性剂 (如吐温 20) 的阻塞缓冲单元, 在 1 h 中进行温和晃动。
- 丢弃阻塞解决方案。将稀释的5hmC 抗体 (1:200) 添加到细胞中, 在室温或夜间在4° c 下孵育2小时。
- 用 PBS 三次洗涤细胞15分钟。
- 在细胞中加入稀释的荧光 (FITC)-共轭二级抗体 (1:200), 孵育1小时。
- 用 PBS 三次清洗细胞, 去除残留的抗体。
- 添加 250 ng/毫升 4, 6-diamidino-2-吲 (DAPI), 以染色核为5分钟. 去除染色液。
- 安装幻灯片或玻璃底培养皿与 immunostained 细胞共焦成像。有代表性的结果显示在图 1B中。
- 为了修复细胞, 在室温下, 在 PBS 中添加4% 甲醛到雷帕霉素治疗的细胞15分钟。对于对照组, 使用无雷帕霉素治疗的 mCherry 苹果酒的细胞。不要鼓动。
- 流式细胞仪
注: 使用96井圆底板进行以下染色程序。通常, 150 µL 的试剂对每一个井都足够。- 重转染和雷帕霉素诱导的细胞在外地资产管制署缓冲区 (PBS 与 1% BSA, 2 毫米 EDTA)。对于对照组, 使用无雷帕霉素治疗的苹果酒表达细胞。
- 按照步骤2.1 中的说明修复和 permeabilize 单元格。
- 将2的 HCl 添加到细胞中, 以变性10分钟的 DNA。
- 放弃 HCl. 中和并阻止如步骤2.1 中所述的单元格。
- 将稀释的 anti-5hmC 抗体 (1:200) 添加到细胞中, 在室温或夜间在4° c 下孵育1小时。
- 用三倍的缓冲液清洗细胞。彻底删除外地资产管制的缓冲区。
- 添加稀释的荧光 (FITC)-共轭二级抗体 (1:400) 用于荧光活化细胞分类 (磁场) 分析, 并在室温下孵育1小时。
- 用三倍的缓冲液清洗细胞。
- 样品已准备好进行外地资产管制分析。有代表性的结果显示在图 1C-d中。
3. 斑点杂交法定量分析5hmC 和 5-嘧啶 (5mC) 量
- 使用商业 dna 提取试剂盒将基因组 dna 从转染和雷帕霉素诱导的细胞中分离出来。对于对照组, 使用无雷帕霉素治疗的苹果酒转染细胞。
- 将真空烘箱加热至80° c, pre-soak 硝化纤维素膜在双 H2O, 然后在6x 盐水-柠檬酸钠 (SSC) 缓冲中10分钟。
- 负载60µL 等量的 DNA (总共2µg 在 TE 缓冲) 的 96-井 PCR 板。添加30µL 的 TE 缓冲器 (10 毫米三盐酸, 1 毫米 EDTA, pH 8.0) 到其余的井。
- 通过将1行上30µL 的解决方案转移到2行的同一列位置, 使两个折叠串行稀释垂直于96井板。再次混合, 并转移30µL 的解决方案, 以井在随后的行, 直到到达边界。
注: 步骤 3.7-3.10 涉及使用真空。
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Representative Results
化学诱导 5 mc 到-5 hmc 转换可以通过免疫在单细胞水平, 流式细胞仪分析转染 (mCherry 阳性) 细胞的数量, 或更定量斑点杂交检测, 如图 1所示。TET2 的催化领域, 或 TET2CD, 在整个研究中作为一个积极的控制使用。参见参考资料 18-20, 进一步详细说明雷帕霉素诱导的5hmC 和染色质可达性变化的全基因组图谱。
图 1: 苹果酒介导的诱导 DNA 化在 HEK293T 细胞中的作用。(a) 设计一种基于分裂 TET2 酶的化学诱导基因重构 (苹果酒) 工具。(B) 代表免疫结果在 HEK293T 细胞表达苹果酒-mCherry 前 (上部板) 和后 (下面板) 雷帕霉素治疗 (200 nM)。绿色, 5hmC, 红色, 苹果酒-mCherry, 蓝色, DAPI 染色的核。缩放条 = 10 µm. (C) 通过流式细胞仪分析对苹果酒介导的5hmC 生产进行定量化。HEK293T 细胞转染苹果酒-mCherry TET2CD-mCherry (阳性对照) 染色的 anti-5hmc 主要抗体和 FITC 标记的二级抗体。只有 TET2 (mCherry) 和 5hmC (FITC) double-positive 细胞是封闭和指示。(D) 化学诱导生产5hmC 的时间过程, 在 HEK293T 细胞中, 在雷帕霉素 (200 nM) 的管理或提取后表达苹果酒。n = 5, 数据显示为平均±法令 (E) 斑点杂交法, 以量化雷帕霉素诱导的变化在5hmC 水平的 HEK293T 细胞。HEK293T 细胞被转染为苹果酒或 TET2CD 结构。一个已知量为5hmC 的合成寡核苷酸被用作阳性对照 (顶行)。底部板上显示了用乙烯蓝染色法对输入 DNA 总量进行可视化的加载控制。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们已经说明了使用的工程 split-TET2 酶, 以实现时间控制的 DNA 化。在发现了 5-methycytosine 酶的春节系列后, 许多研究已经进行了破译的生物功能的春节蛋白及其主要催化产品 5hmC1,2,3, 4,5,6,78,9,10,11。然而, 对基因组 DNA 修饰的时间和精确控制仍然是该领域的一项艰巨挑战。我们的苹果酒系统是少数利用基因工程 DNA 修饰酶来填补这一技术空白的系统之一。本文所描述的协议主要是针对模型蜂窝系统, 如人类胚胎肾脏 (HEK) 293T 和 HeLa 细胞系。雷帕霉素浓度和治疗时间可能需要调整, 以达到最佳的性能, 在不同的细胞类型。为了找出最佳的5hmC 感应时间点, 我们强烈推荐在1.3.3 节中描述的时间课程实验。5hmC 在转染细胞中的免疫荧光染色可作为最方便的读出方法。为了进行更定量分析, 建议采用斑点杂交法, 但可能需要更费力的方法。对于斑点印迹化验, 输入 DNA 的数量必须针对不同的细胞类型进行优化。强烈建议使用2倍的连续稀释法和不同的 DNA 加载量进行仔细的滴定实验。
苹果酒系统可以广泛用于解剖不同生物系统中 DNA 化与表型变化的相关性。下面列出的是典型的下游应用程序或可以与苹果酒系统解决的问题。
在不同的模型细胞系统中, 春节介导的5mC 氧化将如何改变 DNA 甲基化的环境？现在可以通过比较雷帕霉素治疗前后的 DNA methylome 和 hydroxymethylome 来方便地解决这一问题。DNA 化如何改变染色质的可及性和组蛋白修饰？在雷帕霉素用药前后同一个细胞内的 ATAC 和芯片序列的结果比较, 将会给出答案。由于春节蛋白在某些类型的癌症中起着抑制作用, 所以测试化学诱导的蛋白质和5hmC 生产的恢复将会对肿瘤的生长产生影响是很有趣的。考虑到 TET/5hmC 在干细胞分化中的作用, 还有待确定在一个确定的过渡阶段, 时间控制的5hmC 生产将如何影响干细胞在发育过程中的谱系规范。
在目前的配置, 苹果酒系统只能用于全球诱导 5 mc 到 5 hmc 转换。理想情况下, 苹果酒可以与催化的非活性 Cas9 或其 orthologues, 这将使基因座特定的靶向和诱导 DNA 甲基化编辑在染色体。这种精确的化学诱导基因重塑工具可以广泛应用于明确地探测哺乳动物的 epigenotype 表型关系而不改变遗传密码。
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Disclosures
作者声明没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
我们感谢国家卫生研究院 (R01GM112003 YZ)、韦尔奇基金会 (BE-1913 YZ)、美国癌症学会 (RSG-16-215-01)、德克萨斯癌症预防和研究所 (YZ 至 RR140053) 提供的财政支持,RP170660 至 YZ), 美国心脏协会 (16IRG27250155 YH), 和约翰·邓恩基金会合作研究奖计划。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
References
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