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Chemistry

Uma enzima de Split-TET2 projetado para Hydroxymethylation de DNA químico-inducible e remodelação epigenéticas

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56858
Automatic Translation
1, 2, 1
1Centre for Epigenetics and Disease Prevention, Department of Molecular and Cellular Medicine, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University, 2Centre for Translational Cancer Research, Department of Medical Physiology, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University

Summary

Protocolos detalhados para a introdução de uma enzima de divisão de engenharia-TET2 (cidra) em células de mamíferos para química inducible DNA hydroxymethylation e remodelação epigenéticas são apresentados.

Abstract

Metilação do DNA é uma modificação epigenética estável e hereditária no genoma dos mamíferos e está envolvida na regulação da expressão gênica para controlar funções celulares. A reversão da metilação do DNA, ou demetilação do ADN, é mediada por dez-onze translocação (TET) da proteína da família dos dioxygenases. Embora tem sido amplamente relatado que aberrante a metilação do DNA e a desmetilação estão associadas com câncer e defeitos do desenvolvimento, como estas mudanças epigenéticas contribuem directamente para a subsequente alteração na progressão de doença ou de expressão do gene Ainda não está claro, em grande parte devido à falta de ferramentas confiáveis com precisão, adicionar ou remover modificações do DNA no genoma em resolução espacial e temporal definido. Para superar este obstáculo, nós projetamos uma enzima split-TET2 para permitir o controle temporal de oxidação 5-metilcitosina (5mC) e subsequentes a remodelação dos Estados epigenéticos em células de mamíferos simplesmente adicionando produtos químicos. Aqui, descrevemos os métodos para a introdução de uma ferramenta de remodelação químico-inducible Epigenoma (cidra), com base em uma divisão de engenharia-TET2 enzima, em células de mamíferos e quantificar a produção química inducible do 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) com immunostaining, citometria de fluxo ou um ensaio de dot-blot. Esta ferramenta de remodelação Epigenoma químico-inducible encontrará ampla utilização em sistemas celulares a interrogar sem alterar o código genético, bem como na investigação das relações epigenotype−phenotype em diferentes sistemas biológicos.

Introduction

Metilação do DNA, principalmente refere-se a adição de um grupo metil na posição do carbono 5 da citosina para formar 5-metilcitosina (5mC), é catalisada por DNA metil-transferases (DNMTs). 5mC atua como uma marca importante epigenética no genoma de mamíferos que geralmente sinaliza para repressão transcriptional, inativação do cromossomo x e transposon silenciar1. A reversão da metilação do DNA é mediada pela família de proteínas de dez-elven translocação (TET). Enzimas de TET pertencem ao ferro (II) e 2-do oxoglutarate dioxygenases dependente que catalisam a oxidação sucessiva de 5mC 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxycytosine (5caC). Oxidação mediada por TET 5mC impõe uma camada adicional de controle epigenético do genoma dos mamíferos. A descoberta do TET provocou intenso interesse no campo epigenético para desvendar as funções biológicas das proteínas TET e 5hmC seu produto principal catalítico. 5hmC não é apenas um intermediário durante o TET-mediado ativo DNA desmetilação2,3,4, mas também atua como um estábulo epigenética marca5,6,7,8 . Apesar de hydroxymethylation de DNA é altamente correlacionada com a expressão de gene e aberrante mudanças no DNA hydroxymethylation estão associadas a algumas doenças humanas9,10,11, as relações causais entre as modificações epigenéticas no DNA e os fenótipos frequentemente permanecem um desafio a ser estabelecida, que pode ser parcialmente atribuída à falta de uma ferramenta confiável com precisão, adicionar ou remover modificações do DNA no genoma em definido pelo temporal e espacial resolução.

Aqui nós relatamos o uso de um produto químico-inducible Epigenoma remodelar ferramenta (cidra) para superar o obstáculo que enfrentam os estudos de relações causais entre transcrição hydroxymethylation e gene de DNA. O design é baseado no pressuposto de que o domínio catalítico de TET2 (TET2CD) pode ser dividido em dois fragmentos inativos quando expressa em células de mamíferos e sua função enzimática pode ser restaurada por uma abordagem de dimerização quimicamente inducible ( Figura 1A). Para estabelecer um sistema de separação-TET2CD, nós selecionamos seis locais em TET2CD, composto por uma região rica em Cys e uma dobra dupla-hélice β-hélice (DSBH), com base em uma estrutura de cristal relatado do ADN TET2-complexo que carece de uma região de baixa complexidade12. Um sintético gene que codifica a proteína dimerização rapamicina-inducible módulo FK506 12 (FKBP12) e domínio de ligação FKBP rapamicina (FRB) de mamíferos alvo de14,rapamicina15, juntamente com um peptídeo Self chicotado T2A polipeptídeo sequência16,17, individualmente foi inserido em sites selecionados dividido dentro de TET2CD. A seleção de TET2 como nosso alvo engenharia baseia-se as seguintes considerações. Mutações somáticas, primeiras no TET2 com concomitante redução de hydroxymethylation de DNA são frequentemente observadas em doenças humanas incluindo distúrbios mieloides e câncer10, que fornece informações úteis em locais sensíveis deve ser evitada para inserção. Em segundo lugar, uma grande fração do domínio catalítico TET2, particularmente a região de baixa complexidade, é dispensável para a função enzimática12, permitindo assim que um split-TET2 minimizado para modificações epigenéticas inducible do ofício. Após a triagem de mais de 15 construções, uma construção que exibiu maior restauração rapamicina-inducible da sua actividade enzimática no sistema dos mamíferos foi escolhida e designada como cidra18. Neste documento descrevemos o uso de mCherry-tag cidra para alcançar hydroxymethylation de DNA inducible e epigenéticas remodelação com rapamicina e apresentar três métodos para validar a produção 5hmC mediada por cidra em um sistema celular modelo HEK293T.

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Protocol

1. cultura, transfeccao Plasmideo e indução química da pilha

  1. Cultura de uma linhagem de células aderentes (por exemplo, o embrionário rim humano HEK293T célula) no meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM), suplementada com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino, 100 U/mL penicilina e estreptomicina a 37 ° C com 5% de CO2.
  2. Transfect células com o plasmídeo de cidra.
    1. Pelo menos 18 h antes de transfeccao, semente 0.3 x 106 células 2,5 mL de DMEM apropriado por bem em uma placa de 6 e incubam as células a 37 ° C durante a noite para chegar a confluência de 60-80%.
    2. Pré-aquecer o reagente de transfeccao à temperatura ambiente antes do uso.
    3. Lugar de 250 µ l de meio livre de soro em um tubo estéril.
      Nota: Este montante é adaptado para uma placa de 6 com a confluência de 80%. Se necessário, ajuste proporcionalmente as quantidades médias de acordo com os tamanhos de placas ou números de telemóvel.
    4. Adicionar 2,5 µ g do plasmídeo codificação cidra18 ou o domínio catalítico de TET2 (TET2CD como controle positivo)12,13 entram no meio livre de soro e delicadamente misture por pipetagem.
    5. Adicionar 7,5 µ l de reagente de Transfeccao para a mistura de DNA diluída e misture suavemente pipetando.
    6. Incube a mistura à temperatura ambiente por 20-30 min.
    7. Mudar de mídia previamente aquecida e adicione a mistura de drop-wise aos poços e agite suavemente a placa de cultura de células para distribuir uniformemente o reagente de transfeccao e mistura de DNA.
    8. Incubar as células e mistura durante a noite e em seguida, substitua o reagente de transfeccao contendo mídia com 2ml de DMEM completa fresco.
  3. Indução química
    1. Diluído a 2 mM do estoque de rapamicina (dissolvido em DMSO) a uma concentração de 20 µM em meio apropriado completo.
    2. Adicionar 20 µ l de rapamicina diluída para células transfectadas mantidas em 2 mL de meio para atingir uma concentração final de 200 nM.
      Nota: Após a incubação por 48 h, as células estão prontas para quantificação da geração de 5hmC ou quaisquer outras aplicações a jusante. Se necessário, a eficiência de indução pode ser monitorizada por tirar células cada 3h para mais 5hmC quantificação conforme descrito abaixo e mostrada na Figura 1.
    3. Para melhor quantificação da eficiência de indução 5hmC, semente separadas poços para monitorar as células a cada 3 horas.

2. quantificação da produção de 5hmC induzida por rapamicina por imunocoloração

  1. mancha de 5hmC da imunofluorescência
    Nota: Adicione quantidades suficientes da solução de fixação, composto por paraformaldeído 4%, 0,2% de tensoativo (tais como o Triton X-100) em PBS com 3 N HCl, para cobrir todas as células na placa. Por exemplo, 500 µ l de solução seria suficiente para um poço em uma placa de 6. Execute todas as etapas, à temperatura ambiente.
    1. Para corrigir as células, adicione paraformaldeído 4% em PBS a rapamicina-tratados células durante 15 minutos à temperatura ambiente. Para o grupo de controle, use células expressando mCherry-cidra sem tratamento de rapamicina. Não agite.
      Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico. Use proteção adequada.
    2. Descarte a solução fixador. Incube células fixas com surfactante de 0,2% em PBS durante 30 min para permeabilize membrana celular.
    3. Descarte a solução de permeabilização. Adicionar 3 N HCl para as células permeabilized e incube por 15 min desnaturar o DNA.
    4. Descarte a 100 mM de HCl. Add tampão Tris-HCl (pH 8.0) às células por 10 min para a neutralização do pH.
    5. Descarte toda a solução. Lavar as células completamente com PBS para 3 - 5 vezes. Remova completamente o PBS.
      Nota: Adicione quantidades suficientes de PBS para cada etapa de lavagem. Por exemplo, 1 mL de PBS é o suficiente para uma placa de 6.
    6. Bloquear células adicionando o tampão de bloqueio, composto por 1% de BSA e 0,05% de surfactante (tais como Tween 20) em PBS para 1 h com agitação suave.
    7. Descarte a solução de bloqueio. Adicione o anticorpo 5hmC diluído (1: 200) para as células e incubar durante 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
    8. Lave as células com PBS, três vezes por 15 min.
    9. Adicionar um fluoróforo diluído (FITC)-conjugado anticorpo secundário (1: 200) para as células e incubar durante 1 h.
    10. Lave as células com PBS três vezes extensivamente para remover anticorpos residuais.
    11. Adicionar 250 ng/mL de 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para manchar o núcleo 5 min. remover a coloração da solução.
    12. Monte o prato de cultura slide ou vidro baixo com células immunostained para a imagem latente confocal. Um resultado representativo foi mostrado na figura 1B.
  2. Citometria de fluxo
    Nota: Use uma placa de fundo redondo de 96 poços para o seguinte procedimento de coloração. Geralmente, 150 µ l de reagentes é suficiente para cada poço.
    1. Ressuspender as células transfectadas e induzida a rapamicina no buffer de FACS (PBS com 1% de BSA, 2 mM EDTA). Para o grupo de controle, use cidra-expressando células sem tratamento de rapamicina.
    2. Corrigir e permeabilize as células conforme descrito no passo 2.1.
    3. Adicione 2 N HCl para as células para desnaturar o DNA por 10 min.
    4. Descartar o HCl. neutralizar e bloquear as células conforme descrito no passo 2.1.
    5. Adicionar um anticorpo anti-5hmC diluído (1: 200) para as células e incube por 1h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
    6. Lave as células com buffer de FACS três vezes. Buffer de FACS remova completamente.
    7. Adicionar um fluoróforo diluído (FITC)-conjugado anticorpo secundário (1: 400) por fluorescência-ativado da pilha classificação análise (FACS) e incube por 1h à temperatura ambiente.
    8. Lave as células com buffer de FACS três vezes.
    9. As amostras estão prontas para análise de FACS. Um resultado representativo foi mostrado na Figura 1-D.

3. dot-blot ensaio para quantificar 5hmC e 5-metilcitosina (5mC) eleva-se

  1. Isole o DNA genômico de células transfectadas induzida por rapamicina usando um kit de extração de DNA comercial. Para o grupo de controle, use células transfectadas de cidra sem tratamento de rapamicina.
  2. Aqueça o forno a vácuo para 80 ° C e pré-embebição membrana de nitrocelulose em bidestilada H2O e, depois, em 6 x tampão citrato de sódio-solução salina (SSC) por 10 min.
  3. Carrega 60 µ l de quantidades iguais de DNA (total 2 µ g/ml tampão TE) em uma chapa de PCR de 96 poços. Adicione 30 µ l de tampão TE (Tris-HCl de 10 mM, 1 mM EDTA, pH 8.0) nos poços do resto.
  4. Fazer diluições em série dupla verticalmente na placa de 96 poços através da transferência de 30 µ l de solução na linha 1 para a mesma posição da coluna na linha 2. Misture novamente e 30 µ l de solução de transferência aos poços na linha subsequente até atingir o limite.
Remova os últimos 30 µ l.
  • Adicionar 20 µ l de 1m NaOH e 10 mM de EDTA para cada poço, selar a placa e aquecer a mistura durante 10 minutos a 95 ° C para desnaturar completamente do duplex de DNA.
  • Imediatamente arrefecer as amostras no gelo e adicionar 50 µ l de acetato de amônio 2m gelada (pH 7.0) e incubar no gelo por 10 min.
    Nota: Passos 3.7-3.10 envolve o uso de vácuo.
  • Montar o aparelho de borrão ponto com membrana previamente embebido e remover residual buffer usando vácuo total.
  • Lave a membrana adicionando-se 200 µ l de tampão TE a cada poço do aparato de dot blot. Ligue o aspirador para remover o tampão TE.
  • Carrega o DNA desnaturado (preparado nas etapas anteriores 3.1-3.6) a cada poço do aparato de dot blot. Ligue o aspirador para remover a solução.
  • Lave a membrana adicionando-se 200 µ l de 2 x SSC e remover soluções residuais completamente usando o vácuo.
  • Desmontar o aparelho de borrão do ponto, retire a membrana e lavar a membrana inteira com 20 mL de 2 x SSC.
  • Secar ao ar livre da membrana por 20 min.
  • Asse a membrana a 80 ° C sob vácuo por 2 h.
  • Adicionar a solução de bloqueio (5% leite desnatado em TBST) para a membrana e incube por 1h à temperatura ambiente.
  • Descarte a solução de bloqueio. Adicionar um 5hmC diluído (1:5, 000) ou 5mC (1:1, 000) anticorpos à membrana e incubar durante a noite a 4 ° C.
  • Lave a membrana com TBST três vezes para 10 min para remover anticorpos residuais. TBST remova completamente.
  • Adicionar um anticorpo secundário conjugado HRP (01:10, 000 de anti-coelho HRP(5hmC) ou 1:3,000 para anti-mouse HRP(5mC)) para a membrana e incube por 1h à temperatura ambiente.
  • Lave a membrana com TBST três vezes por 10 min.
  • Adicione ECL mancha o substrato para a membrana para visualização de sinais de 5hmC usando um detector de quimioluminescência ocidental. Um resultado representativo foi mostrado na Figura 1E.

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    Representative Results

    Conversão de 5mC-para-5hmC inducible química pode ser validado pelo immunostaining em nível de célula única, análise de citometria de fluxo em populações de células transfectadas de (mCherry-positivo) ou um ensaio de dot-blot mais quantitativo, conforme ilustrado na Figura 1. O domínio catalítico de TET2, ou TET2CD, foram utilizados ao longo do estudo como um controle positivo. Consulte referências 18-20 para maiores detalhes sobre o mapeamento de todo o genoma de alterações induzidas pelo rapamicina em acessibilidade 5hmC e cromatina.

    Figure 1
    Figura 1: mediada por cidra hydroxymethylation inducible do DNA nas células HEK293T. (A) projeto de uma ferramenta de remodelação (cidra) química-inducible Epigenoma baseado em uma divisão TET2 enzima. (B) representante immunostaining resulta em células HEK293T expressando cidra-mCherry antes (painel superior) e depois (painel inferior) tratamento de rapamicina (200 nM). Verde, 5hmC, vermelho, cidra-mCherry, azul, DAPI coloração de núcleos. Barra de escala = 10 µm. (C) produção 5hmC mediada por quantificação da cidra por análise de citometria de fluxo. HEK293T células transfectadas com cidra-mCherry de TET2CD-mCherry (como controle positivo) foram coradas com um anticorpo primário anti-5hmc e um anticorpo secundário FITC-rotulados. Só TET2 (mCherry) e 5hmC (FITC) duplo-positivo células foram bloqueadas e indicadas. (D) curso de tempo de produção inducible química de 5hmC nas células HEK293T expressando cidra após administração ou retirada de rapamicina (200 nM). n = 5, dados apresentados como média ± D.P. (E) Dot-blot ensaio para quantificar a rapamicina-inducible alterações nos níveis de 5hmC em células HEK293T. HEK293T células foram transfectadas com Construa uma cidra ou TET2CD. Um oligonucleotide sintético com uma quantidade conhecida de 5hmC foi usado como um controle positivo (linha superior). O controle de carregamento visualizado por etileno azul coloração dos montantes totais de entrada DNA foi mostrado no painel inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Discussion

    Aqui nós ilustraram o uso de uma enzima de split-TET2 projetado para conseguir o controle temporal de DNA hydroxymethylation. Após a descoberta da família de TET de dioxigenase 5-methycytosine, muitos estudos foram realizados para decifrar as funções biológicas das proteínas de TET e seu principal produto catalítico 5hmC1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11. No entanto, o controle temporal e preciso sobre as modificações do DNA no genoma continua a ser um desafio exigente para o campo. Nosso sistema de cidra é um dos poucos sistemas utilizando um DNA engenharia modificando a enzima para preencher esta lacuna técnica. O protocolo descrito neste documento é adaptado principalmente para sistemas celulares de modelo, como o rim embrionário humano (HEK) 293T e as linhas de célula HeLa. Concentrações de rapamicina e o tempo de tratamento podem precisar de ser ajustados para atingir o desempenho ideal em diferentes tipos de células. Para encontrar o melhor ponto de tempo de indução de 5hmC, uma experiência de curso do tempo, como descrevemos na seção 1.3.3, é altamente recomendável. Mancha da imunofluorescência de 5hmC em células transfectadas pode ser usado como a leitura mais conveniente. Para uma análise quantitativa mais, recomenda-se um ensaio de dot-blot, mas pode levar os procedimentos mais trabalhosos. Para ensaios de dot-blot, as quantidades de DNA de entrada devem ser otimizadas para diferentes tipos de células. Um experimento de titulação cuidadosa usando 2 vezes diluição serial com diferentes quantidades de carga de DNA é altamente recomendável.

    O sistema de sidra pode ser amplamente usado para dissecar a correlação entre DNA hydroxymethylation e alterações fenotípicas em diferentes sistemas biológicos. Listados abaixo são aplicações a jusante exemplares ou perguntas que podem ser tratadas com o sistema de cidra.

    Como a oxidação mediada por TET 5mC irá alterar a paisagem de metilação do DNA em vários sistema de celular de modelo? Isto agora pode ser facilmente resolvido, comparando o DNA methylome e hydroxymethylome antes e após o tratamento de rapamicina. Como o DNA hydroxymethylation alterará a cromatina acessibilidade e histona modificações? Uma comparação de ATAC-seq e ChIP-Seq resulta na mesma cela, antes e após administração de rapamicina dirá a resposta. Desde que as proteínas TET um papel supressiva em certos tipos de câncer, será interessante testar a restauração inducible como química de proteína de TET e 5hmC produção irá prejudicar o crescimento do tumor. Dado o papel de TET/5hmC na diferenciação de células-tronco, permanece ser determinado como temporalmente controlada 5hmC produção numa fase transitória definido terá impacto na especificação da linhagem de células-tronco durante o desenvolvimento.

    Em sua configuração atual, o sistema de cidra só pode ser usado para induzir globalmente conversão 5mc-para-5hmC. Idealmente, a cidra pode ser fundida com um Cas9 cataliticamente inactiva ou seus orthologues, que permitirá o direcionamento de loci específicos e inducible metilação de DNA edição no genoma. Tal Epigenoma químico-inducible precisa remodelar ferramenta pode ser amplamente aplicada para sonda inequivocamente as relações epigenotype-fenótipo em mamíferos sem alterar o código genético.

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    Disclosures

    Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

    Acknowledgments

    Agradecemos a financeira das sustentações do National Institutes of Health concedem (R01GM112003 para YZ), Fundação Welch (BE-1913 a YZ), a American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE para YZ), a prevenção do câncer e Instituto de pesquisa de Texas (RR140053 a YH, RP170660 para YZ), a associação americana do coração (16IRG27250155 a YH) e o programa de prêmio de pesquisa colaborativa de fundação de John S. Dunn.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668027
    Rapamycin Sigma-Aldrich 37094
    Paraformaldehyde, 16% Solution VWR 100503-916
    Triton X-100 Amresco 0694-1L
    Hydrochloric Acid Amresco 0369-500ML
    Albumin, Bovine Amresco 0332-100G
    Tween 20 Amresco 0777-1L
    5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) Active Motif 39769
    Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
    4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) Biotium 40043
    SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) SHEL LAB SVAC1E
    UltraPure SSC, 20X Thermo Fisher Scientific 15557036
    Bio-Dot Apparatus BIO-RAD 1706545
    Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 Millipore MABE146
    Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S
    West-Q Pico Dura ECL Solution Gendepot W3653-100

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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