Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

En manipuleret Split-TET2 enzym til kemikalie-inducerbar DNA Hydroxymethylation og epigenetiske Remodeling

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56858
Automatic Translation
1, 2, 1
1Centre for Epigenetics and Disease Prevention, Department of Molecular and Cellular Medicine, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University, 2Centre for Translational Cancer Research, Department of Medical Physiology, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University

Summary

Detaljerede protokoller for at indføre et manipuleret split-TET2 enzym (CiDER) i pattedyrceller for kemiske inducerbar DNA hydroxymethylation og epigenetiske remodeling præsenteres.

Abstract

DNA methylering er en stabil og arvelige epigenetiske ændringer i det mammale genom og er involveret i reguleringen af genekspression for at styre cellulære funktioner. Tilbageførsel af DNA methylering, eller DNA demetylering, er medieret af ti-elleve translokation (TET) protein familie af dioxygenases. Selv om det har været almindeligt rapporterede, at afvigende DNA methylering og demetylering er forbundet med udviklingsmæssige defekter og kræft, hvordan disse epigenetiske ændringer direkte bidrage til den efterfølgende ændring i genet udtryk eller sygdom progression er fortsat uklart, i vid udstrækning på grund af manglen på pålidelige værktøjer til præcist tilføje eller fjerne DNA ændringer i genomet ved definerede tidsmæssige og rumlige opløsning. For at overvinde denne forhindring, vi har designet en split-TET2 enzym til at aktiverer tidsmæssige kontrol af 5-methylcytosine (5mC) oxidation og efterfølgende remodellering af epigenetiske stater i pattedyrceller ved blot at tilføje kemikalier. Her, beskriver vi metoder til at indføre et kemikalie-inducerbar epigenome remodeling værktøj (CiDER), baseret på en manipuleret split-TET2 enzym, i pattedyrsceller og kvantificere kemiske inducerbar produktionen af 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) med immunfarvning, flowcytometri eller en dot-skamplet assay. Dette kemikalie-inducerbar epigenome remodeling værktøj vil finde bred anvendelse i spørgekriterierne cellulære systemer uden at ændre den genetiske kode, samt i sondering epigenotype−phenotype forbindelser i forskellige biologiske systemer.

Introduction

DNA methylering, for det meste henvist til tilføjelse af en methylgruppe til carbon 5 position af cytosin at danne 5-methylcytosine (5mC), er katalyseret af DNA methyl-transferaser (DNMTs). 5mC fungerer som en stor epigenetiske mark i det mammale genom, der ofte signaler for transcriptional undertrykkelse, x-kromosom Inaktiveringen og transposon silencing1. Tilbageførsel af DNA methylering er medieret af Ten-elven translokation (TET) protein familie. TET enzymer tilhører jern (II) og 2-oxoglutarate afhængigt af dioxygenases, som katalysere den successive oxidation af 5mC til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxycytosine (5caC). TET-medieret 5mC oxidation pålægger et ekstra lag af epigenetiske kontrol over det mammale genom. Opdagelsen af TET har udløste intense interesse i den epigenetiske felt hen til afsløre de biologiske funktioner af TET proteiner og deres store katalytisk produkt 5hmC. 5hmC er ikke kun et mellemprodukt under TET-medieret aktive DNA demetylering2,3,4, men også fungerer som en stabil epigenetiske mark5,6,7,8 . Selv om DNA hydroxymethylation er stærkt korreleret med gene expression og afvigende er ændringer i DNA hydroxymethylation forbundet med nogle menneskelige lidelser9,10,11, de kausale relationer mellem epigenetiske ændringer på DNA og fænotyper forbliver ofte udfordrende at være etableret, som delvist kan tilskrives manglen på pålidelige værktøj til præcist tilføje eller fjerne DNA ændringer i genomet på defineret tidsmæssige og rumlige opløsning.

Her rapporterer vi brugen af et kemikalie-inducerbar epigenome remodeling værktøj (CiDER) til at overvinde den forhindring, som står over for undersøgelser af årsagssammenhænge mellem DNA hydroxymethylation og gen transskription. Designet er baseret på antagelsen, at det katalytiske domæne af TET2 (TET2CD) kan opdeles i to inaktive fragmenter når udtrykt i pattedyrsceller og dens enzymatisk funktion kan genoprettes ved at tage en kemisk inducerbar dimerization tilgang ( Figur 1A). For at etablere en split-TET2CD system, udvalgte vi seks steder i TET2CD, sammensat af en Cys-rige region og en dobbelt-strenget β-helix (DSBH) fold, på grundlag af en rapporteret krystalstruktur af TET2-DNA-kompleks, der mangler en lav kompleksitet region12. En syntetisk gen, der koder rapamycin-inducerbar dimerization modul FK506 bindende protein 12 (FKBP12) og FKBP rapamycin bindende domæne (FRB) til pattedyr målet på rapamycin14,15, sammen med en selvstændig cleaving peptid T2A polypeptid sekvens16,17, var individuelt indsat i de valgte split websteder inden for TET2CD. Udvalg af TET2 som vores engineering mål bygger på følgende betragtninger. Første, somatiske mutationer i TET2 med samtidige reduktion i DNA hydroxymethylation er ofte observeret i menneskelige lidelser, herunder myeloide sygdomme og kræft10, som giver nyttige oplysninger om følsomme steder skal undgås for indsættelse. For det andet er en stor del af TET2 katalytiske domæne, især regionen lav kompleksitet, undværes til enzymatisk funktion12, således at vi kan udforme en minimeret split-TET2 for inducerbar epigenetiske modifikationer. Efter screening over 15 konstruktioner, blev en konstruktion, der udstillede højeste rapamycin-inducerbar restaurering af RuBisCOs enzymaktivitet i pattedyr systemet valgt og udpeget som CiDER18. Vi beskriver heri brugen af mCherry-mærkede CiDER at opnå inducerbar DNA hydroxymethylation og epigenetiske remodeling med rapamycin og præsentere tre metoder til at validere CiDER-medieret 5hmC produktion i en model cellulære system HEK293T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle kultur, Plasmid Transfektion og kemiske induktion

  1. Kultur en vedhængende cellelinje (f.eks. den menneskelige embryonale nyre HEK293T celle) i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM), suppleret med 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum, 100 U/mL penicillin og streptomycin ved 37 ° C med 5% CO2.
  2. Transfect celler med CiDER plasmid.
    1. Mindst 18 h før Transfektion frø 0,3 x 106 celler i 2,5 mL af passende DMEM pr. godt i en 6-godt plade og inkuberes celler ved 37 ° C natten over at nå 60-80% confluency.
    2. Pre varm Transfektion reagens til stuetemperatur før anvendelse.
    3. Sted 250 µL af serumfrit medium i sterile rør.
      Bemærk: Dette beløb er skræddersyet til en 6-godt plade med 80% confluency. Hvis det er nødvendigt, forholdsmæssigt justere medium beløbene i henhold til størrelsen af plader eller celle numre.
    4. Tilføje 2,5 µg af plasmid kodning CiDER18 eller den katalytiske domæne af TET2 (TET2CD som positiv kontrol)12,13 i serumfrit medium og forsigtigt mix af pipettering.
    5. Tilføje 7,5 µL Transfektion reagens til fortyndet DNA-blanding og forsigtigt mix af pipettering.
    6. Inkuber blanding ved stuetemperatur for 20-30 min.
    7. Ændre pre varmede medier og tilsæt blandingen Dråbevist brønde, og Ryst forsigtigt celle kultur plade for at jævnt distribuere Transfektion reagens og DNA blanding.
    8. Inkuber celler og blanding natten over, og derefter erstatte Transfektion reagens der indeholder medier med 2ml frisk komplet DMEM.
  3. Kemiske induktion
    1. Fortyndet 2 mM af rapamycin stock (opløst i DMSO) til en koncentration på 20 µM i passende komplet medium.
    2. Tilføj 20 µL fortyndede rapamycin til transfekteret celler, opretholdt i 2 mL medium at nå frem til en endelig koncentration på 200 nM.
      Bemærk: Efter inkubation i 48 h, celler er klar til kvantificering af 5hmC generation eller andre downstream applikationer. Hvis det er nødvendigt, kan induktion effektiviteten kontrolleres ved at tage ud celler hver 3 h for yderligere 5hmC kvantificering som beskrevet nedenfor og vist i figur 1.
    3. For bedre kvantificering af 5hmC induktion effektivitet adskille froe wells for at overvåge celler hver 3 timer.

2. kvantificering af Rapamycin-induceret 5hmC produktion af immunfarvning

  1. 5hmC immunofluorescens farvning
    Bemærk: Tilføje tilstrækkelige mængder af fiksering løsning, der består af 4% PARAFORMALDEHYD, 0,2% overfladeaktivt stof (såsom Triton X-100) i PBS med 3 N HCl, til at dække alle celler i pladen. For eksempel, ville 500 µL af løsning være nok til en brønd i en 6-godt plade. Udføre alle trinene ved stuetemperatur.
    1. Du kan løse celler, tilføje 4% PARAFORMALDEHYD i PBS til rapamycin-behandlede celler i 15 min. ved stuetemperatur. Til kontrolgruppen bruge celler, der udtrykker mCherry-CiDER uden rapamycin behandling. Ikke agitere.
      Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftigt. Bær passende beskyttelse.
    2. Kassér Fikseringsvæske løsning. Inkuber fast celler med 0,2% overfladeaktivt stof i PBS for 30 min til permeabilize cellens membran.
    3. Kassere permeabilization løsning. Tilføje 3 N HCl til de permeabilized celler og Inkuber i 15 min til at denaturere DNA.
    4. Kassér HCl. Tilføj 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8,0) til cellerne for 10 min til neutralisering af pH.
    5. Kassér alle løsning. Vaske cellerne grundigt med PBS for 3 - 5 gange. Fjerne PBS grundigt.
      Bemærk: Tilføje tilstrækkelige mængder af PBS for hver vask trin. For eksempel, er 1 mL PBS nok til en 6-godt plade.
    6. Blokere cellerne ved at tilføje den blokerende buffer bestående af 1% BSA og 0,05% af overfladeaktive stoffer (såsom Tween 20) i PBS for 1 h med blid ryster.
    7. Kassér den blokerende løsning. Tilsæt fortyndede 5hmC antistof (1:200) til cellerne og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
    8. Cellerne vaskes med PBS tre gange i 15 min.
    9. Tilføje en fortyndet fluorophore (FITC)-konjugeret sekundær antistof (1:200) til cellerne og Inkuber i 1 time.
    10. Cellerne vaskes med PBS tre gange grundigt for at fjerne resterende antistoffer.
    11. Tilføje 250 ng/mL af 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) at plette kernen i 5 min. Fjern Farvningsopløsningen.
    12. Mount diaset eller glas-bund kultur fadet med immunostained celler for Konfokal billeddannelse. Et repræsentativt resultat blev vist i figur 1B.
  2. Flowcytometri
    Bemærk: Brug en 96-brønd runde bundplade for følgende farvning procedure. Normalt, er 150 µL af reagenser tilstrækkelig til hver brønd.
    1. Resuspend transfekteret og rapamycin-induceret celler i FACS buffer (PBS med 1% BSA, 2 mM EDTA). For kontrolgruppen bruge CiDER-udtrykker celler uden rapamycin behandling.
    2. Fix og permeabilize celler som beskrevet i trin 2.1.
    3. Tilføje 2 N HCl til cellerne til at denaturere DNA i 10 min.
    4. Kassér HCl. Neutraliser og blokere cellerne som beskrevet i trin 2.1.
    5. Tilføje en fortyndet anti-5hmC antistof (1:200) til cellerne og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
    6. Cellerne vaskes med FACS buffer tre gange. Fjerne FACS buffer grundigt.
    7. Tilføje en fortyndet fluorophore (FITC)-konjugeret sekundær antistof (1: 400) for fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) analyse, og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
    8. Cellerne vaskes med FACS buffer tre gange.
    9. Prøverne er klar til FACS analyse. Et repræsentativt resultat blev vist i figur 1 c-D.

3. prik-skamplet analyse til kvantificering af 5hmC og 5-methylcytosine (5mC) beløber

  1. Isolere genomisk DNA fra transfekteret og rapamycin-induceret celler ved hjælp af en kommerciel DNA udvinding kit. Til kontrolgruppen bruge CiDER-transfekteret celler uden rapamycin behandling.
  2. Varme vakuumtørreskabet til 80 ° C og pre sættetid nitrocellulose membran i dobbeltdestilleret H2O og derefter i 6 x saltvand-natrium (SSC) citratbuffer i 10 min.
  3. Indlæse 60 µL af lige store mængder af DNA (samlede 2 µg i TE buffer) til en 96-brønd PCR plade. Tilføj 30 µL af TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) resten brønde.
  4. Gøre dobbelt serielle fortyndinger lodret på 96-brønd pladen ved at overføre 30 µL af løsning på række 1 til den samme kolonne holdning på række 2. Bland igen og overføre 30 µL af løsning til brønde i rækken efterfølgende till at nå grænsen.
Fjern de sidste 30 µL.
  • Tilsæt 20 µL 1 M NaOH og 10 mM EDTA til hver brønd, forsegle pladen og Opvarm blandingen i 10 min. ved 95 ° C til fuldstændig denaturere DNA duplex.
  • Straks køle ned prøver på is og tilsæt 50 µL af iskold 2 M ammoniumacetat (pH 7,0) og der inkuberes i isbad i 10 min.
    Bemærk: Trin 3.7-3.10 indebærer brug af vakuum.
  • Samle dot skamplet apparater med pre gennemblødt membran og fjerne resterende buffer ved hjælp af fuld vakuum.
  • Vask membranen ved at tilføje 200 µL af TE buffer til hver brønd af dot skamplet apparater. Tænde vakuum for at fjerne TE buffer.
  • Indlæse denatureret DNA (udarbejdet i forrige trin 3.1-3.6) til hvert hul i dot skamplet apparater. Tænde vakuum for at fjerne løsning.
  • Vask membranen ved at tilføje 200 µL af 2 x SSC og fjern resterende løsninger helt ved hjælp af vakuum.
  • Adskille dot skamplet apparater, tag membranen og skylle den hele membranen med 20 mL af 2 x SSC.
  • Lufttørre membran i 20 min.
  • Bage membran på 80 ° C under vakuum i 2 timer.
  • Føje de blokering løsning (5% skummetmælk i TBST) til membranen og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
  • Kassér den blokerende løsning. Tilføje en fortyndet 5hmC (1:5, 000) eller 5mC (1:1, 000) antistoffer mod membranen og der inkuberes natten over ved 4 ° C.
  • Vask membran med TBST tre gange i 10 min at fjerne resterende antistoffer. Fjerne TBST grundigt.
  • Tilføje en HRP-konjugerede sekundær antistof (1:10, 000 for anti-kanin HRP(5hmC) eller 1:3,000 for anti-mus HRP(5mC)) til membranen og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
  • Vask membran med TBST tre gange i 10 min.
  • Tilføje ECL western blotting substrat til membran for visualisering af 5hmC signaler ved hjælp af en chemiluminescence detektor. Et repræsentativt resultat blev vist i figur 1E.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Kemiske inducerbare 5mC til 5hmC konvertering kan valideres ved immunfarvning på én celle niveau, flow flowcytometri analyse på transfekteret (mCherry-positive) cellepopulationer eller en mere kvantitativ dot-skamplet assay som illustreret i figur 1. Den katalytiske domæne af TET2 eller TET2CD, blev brugt i hele undersøgelsen som positiv kontrol. Se referencer 18-20 for yderligere detaljer angående genome-wide kortlægning af rapamycin-inducerede ændringer i 5hmC og kromatin tilgængelighed.

    Figure 1
    Figur 1: CiDER-medieret inducerbar DNA hydroxymethylation i HEK293T celler. (A) Design af et kemikalie-inducerbar epigenome remodeling (CiDER) værktøj baseret på en split TET2 enzym. (B) repræsentant immunfarvning resulterer i HEK293T celler, der udtrykker CiDER-mCherry før (øverste panel) og efter (nederste panel) rapamycin behandling (200 nM). Grøn, 5hmC, røde, CiDER-mCherry, blå, DAPI farvningen af kerner. Skalalinjen = 10 µm. (C) kvantificering af CiDER-medieret 5hmC produktion af flow flowcytometri analyse. HEK293T celler transfekteret med CiDER-mCherry af TET2CD-mCherry (som positiv kontrol) var farves med en anti-5hmc primære antistof og et FITC-mærket sekundær antistof. Kun TET2 (mCherry) og 5hmC (FITC) dobbelt-positive celler var gated og angivet. (D) gang løbet af kemiske inducerbar produktion af 5hmC i HEK293T celler, der udtrykker CiDER efter administration eller tilbagetrækning af rapamycin (200 nM). n = 5, data vist som gennemsnit ± SD (E) Dot-skamplet assay at kvantificere rapamycin-inducerbar ændringer i 5hmC niveauer i HEK293T celler. HEK293T celler var transfekteret med en CiDER eller en TET2CD konstruktion. En syntetisk oligonukleotid med en kendt mængde af 5hmC blev anvendt som positiv kontrol (øverste række). Kontrolelementet lastning visualiseret af ethylen blå farvning af samlede mængder af input DNA var vist i det nederste panel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Her har vi illustreret brugen af en manipuleret split-TET2 enzym til at opnå tidsmæssige kontrol af DNA hydroxymethylation. Efter opdagelsen af TET familie af 5-methycytosine dioxygenase, mange undersøgelser er blevet udført til at dechifrere de biologiske funktioner af TET proteiner og deres store katalytisk produkt 5hmC1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11. Dog fortsætter tidsmæssige og præcis kontrol over DNA ændringer i genomet med at være en krævende udfordring for feltet. Vores CiDER system er en af de få systemer udnytter en manipuleret DNA ændre enzym at udfylde dette tekniske hul. Protokollen beskrevet heri er for det meste skræddersyet til model cellulære systemer, såsom den menneskelige embryonale nyre (HEK) 293T og HeLa cellelinjer. Rapamycin koncentrationer og behandlingstiden kan skal justeres for at opnå optimal ydeevne i forskellige celletyper. For at finde ud af den bedste 5hmC induktion tidspunkt, anbefales en tid kursus eksperiment, som vi beskrevet i afsnit 1.3.3, kraftigt. Immunfluorescens farvning af 5hmC i transfekteret celler kan bruges som den mest bekvemme udlæsning. For en mere kvantitativ analyse, en dot-skamplet assay anbefales, men det kan tage mere besværlige procedurer. Dot-skamplet assays, skal mængder af input DNA være optimeret til forskellige celletyper. En omhyggelig titrering eksperiment ved hjælp af 2-fold seriel fortynding med varierende DNA lastning beløb anbefales kraftigt.

    CiDER system kan anvendes bredt til at dissekere korrelation mellem DNA hydroxymethylation og fænotypiske forandringer i forskellige biologiske systemer. Anført nedenfor er eksemplarisk downstream applikationer eller spørgsmål, der kan behandles med CiDER system.

    Hvordan ændrer TET-medieret 5mC oxidation DNA methylering landskab i forskellige cellulære modelsystem? Dette kan nu løses nemt ved at sammenligne DNA methylome og hydroxymethylome før og efter rapamycin behandling. Hvordan bliver DNA hydroxymethylation alter kromatin tilgængelighed og Histon ændringer? En sammenligning af ATAC-FF. og ChIP-Seq resulterer i den samme celle, før og efter indgift af rapamycin vil fortælle svaret. Da TET proteiner spiller en forebyggende rolle i visse typer af kræft, det vil være interessant at afprøve hvordan kemiske inducerbar restaurering af TET protein og 5hmC produktion vil berøre tumorvækst. På grund af TET/5hmC rolle i stamceller differentiering, stadig det for at være fast besluttet hvordan timeligt kontrolleret 5hmC produktion på en defineret midlertidige stadium vil påvirke lineage specifikation af stamceller under udvikling.

    I sin nuværende konfiguration bruges CiDER system kun til at globalt fremkalde 5mc til 5hmC konvertering. Ideelt set kan være smeltet CiDER med en katalytisk inaktive Cas9 eller dens orthologues, som vil muliggøre loci-specifikke målretning og inducerbar DNA methylering redigering i genomet. Sådanne præcise kemiske-inducerbar epigenome remodeling værktøj kan anvendes bredt til at utvetydigt probe epigenotype-fænotype relationer i pattedyr uden at ændre den genetiske kode.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

    Acknowledgments

    Vi takker de finansielle støtter fra National Institutes of Health giver (R01GM112003 til YZ), Welch Foundation (BE-1913 til YZ), the American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE at YZ), forebyggelse af kræft og Research Institute of Texas (RR140053 til YH, RP170660 til YZ), the American Heart Association (16IRG27250155 til YH), og John S. Dunn Foundation forskningssamarbejde Award Program.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668027
    Rapamycin Sigma-Aldrich 37094
    Paraformaldehyde, 16% Solution VWR 100503-916
    Triton X-100 Amresco 0694-1L
    Hydrochloric Acid Amresco 0369-500ML
    Albumin, Bovine Amresco 0332-100G
    Tween 20 Amresco 0777-1L
    5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) Active Motif 39769
    Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
    4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) Biotium 40043
    SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) SHEL LAB SVAC1E
    UltraPure SSC, 20X Thermo Fisher Scientific 15557036
    Bio-Dot Apparatus BIO-RAD 1706545
    Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 Millipore MABE146
    Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S
    West-Q Pico Dura ECL Solution Gendepot W3653-100

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).
    2. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
    3. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
    4. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
    5. Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
    6. Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
    7. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
    8. Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
    9. Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
    10. Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
    11. Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
    12. Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
    13. Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
    14. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
    15. Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
    16. Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
    17. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).
    18. Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
    19. Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
    20. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).

    Tags

    Kemi spørgsmålet 130 DNA methylering Epigenetik kromatin tilgængelighed DNA demetylering kemisk biologi TET2 5-hydroxymethylcytosine transskription Gen-ekspression epigenome redigering
    En manipuleret Split-TET2 enzym til kemikalie-inducerbar DNA Hydroxymethylation og epigenetiske Remodeling
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An… More

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling. J. Vis. Exp. (130), e56858, doi:10.3791/56858 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter