Summary
자세한 프로토콜 설계 분할-TET2 효소 (사이 다) 화학 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 및 후 리 모델링 포유류 세포에 도입 되 게 됩니다.
Abstract
DNA 메 틸 화 포유류 게놈에 안정적이 고 상속 후 성적인 수정 이며, 세포 기능 제어 유전자 발현 조절에 관여. DNA 메 틸 화, 또는 DNA demethylation의 반전은 dioxygenases의 10-11 전 (TET) 단백질 가족에 의해 중재 됩니다. 그것은 널리 알려졌다 탈 DNA 메 틸 화와 demethylation 발달 결함과 암와 관련 된, 있지만 어떻게 이러한 후 성적인 변경을 직접 기여할 진 식 또는 질병 진행에 후속 변경 신뢰할 수 있는 도구를 정확 하 게 추가 또는 정의 된 시간적, 공간적 해상도에서 게놈에 있는 DNA 수정 제거의 부족 때문에 크게 불분명 남아 있습니다. 이 장애물을 극복 하기 위해 우리는 분할 TET2 효소를 5-methylcytosine (5mC) 산화의 일시적인 제어 및 후속 개장 하는 포유류 세포에 있는 후 성적인 국가의 단순히 화학 물질을 추가 하 여 사용할 수 있도록 설계 되었습니다. 여기, 우리 화학을 유도할 수 있는 epigenome 개장 도구 (사이 다), 포유류 세포와 함께 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)의 화학 유도할 수 있는 생산 측정 조작된 분할-TET2 효소에 따라 도입 방법 설명 immunostaining, cytometry 또는 점 오 점 분석 결과. 이 화학을 유도할 수 있는 epigenome 개장 도구 유전자 코드를 변경 하지 않고 셀룰러 시스템 질문 뿐만 아니라 다양 한 생물 학적 시스템에서 epigenotype−phenotype 관계를 프로 빙에 광범위 한 사용을 찾을 것입니다.
Introduction
DNA 메 틸 화, 주로 5-methylcytosine (5mC) 형성 시 토 신의 탄소 5 위치에 메 틸 그룹의 추가를 나타냅니다, 그리고 DNA 메 틸-transferases (DNMTs)에 의해 촉매. 5mC transcriptional 억제, x 염색체 비활성화와 transposon 입을1에 대 한 신호를 종종 포유류 게놈에 있는 주요 epigenetic 마크 역할을 합니다. DNA 메 틸 화의 반전 10-엘 프 전 (TET) 단백질 가족에 의해 중재 됩니다. TET 효소 철 (II)에 속하는 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) 및 5-carboxycytosine (5caC)의 연속 산화 촉매는 종속 dioxygenases 2 oxoglutarate. TET 중재 5mC 산화 epigenetic 제어할 포유류 게놈의 추가 계층을 부과 한다. TET의 발견 TET 단백질의 생물 학적 기능 및 그들의 주요 촉매 제품 5hmC 공개 후 필드에 강렬한 관심을 촉발 했다. 5hmC 하지만 중간 TET 중재 활성 DNA demethylation2,,34일 동안 이지만 또한 epigenetic 안정 역할 표시5,6,7,8 . DNA hydroxymethylation에서 변경 일부 인간의 장애9,,1011, 인과 관계와 연결 된 DNA hydroxymethylation은 높은 유전자 발현과 관련 된 탈 선 후 성적인 수정 DNA에는 고기 사이 종종 남아 설립 도전, 시간적 및 공간적 정의 신뢰할 수 있는 도구를 정확 하 게 추가 또는에서 게놈에 있는 DNA 수정 제거의 부족에 부분적으로 관찰 될 수 있습니다. 해상도입니다.
여기 우리는 화학을 유도할 수 있는 epigenome 도구 (사과주) 인과 관계의 연구를 직면 하는 장애물을 극복 하기 위해 DNA hydroxymethylation와 유전자 전사 사이 개장의 사용을 보고 합니다. 가정에는 디자인을 기반으로 하는 TET2의 촉매 도메인 (TET2CD) 2 개의 비활성 파편 포유류 세포에서 표현 하는 때로 분할할 수 있습니다 및 화학적으로 유도할 수 있는 이합체 화 접근법 ( 여 효소 기능을 복원할 수 있습니다 그림 1A). 분할-TET2CD 시스템을 설정 하기 위해 우리는 TET2CD, Cys 풍부한 지역 및 더블-좌초 β 나선 (DSBH) 배, TET2 DNA 복잡 한 낮은 복잡성 지역12부족의 보고 된 결정 구조 기초의 구성에서 6 사이트를 선택. 합성 유전자 인코딩 rapamycin 유도할 수 있는 이합체 화 모듈 FK506 바인딩 단백질 12 (FKBP12)와 FKBP rapamycin 바인딩 도메인 (FRB) rapamycin14,15, 자체 cleaving 펩타이드 T2A 함께 포유류 대상의 polypeptide 시퀀스16,17, TET2CD 내의 선택한 분할 사이트에 개별적으로 삽입 되었다. 우리의 엔지니어링 대상으로 TET2의 선택 다음과 같은 고려 사항을 기반으로 합니다. 수 반하는 감소 된 DNA hydroxymethylation TET2에서 첫 번째, 체세포 돌연변이 골수성 질환 등 암10, 대 피할 수 민감한 사이트에 유용한 정보를 제공 하는 인간의 장애에서 자주 관찰 된다 삽입입니다. 둘째, TET2 촉매 도메인, 특히 낮은 복잡성 지역의 큰 분수는 효소 기능12, 유도할 수 있는 후 성적인 수정에 대 한 최소화 된 분할 TET2 공예를 활성화를 위해 불가결 이다. 15 구조, 심사 후 포유류 시스템에서 그것의 효소 활동의 가장 높은 rapamycin 유도할 수 있는 복원 전시 하는 구문 선택 되었고 사과 쥬 스18로 지정. 우리는 여기 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 및 rapamycin와 리 모델링 후 사과 mCherry 태그를 사용 하 여 설명 하 고 사과 중재 5hmC 생산 모델 셀룰러 시스템 HEK293T에서에서 유효성 검사에 세 가지 방법 제시.
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Protocol
1. 세포 문화, 플라스 미드 Transfection 및 화학 유도
- 문화는 부착 셀 라인 (예, 인간 미 발달 신장 HEK293T 셀) Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)에 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 100 U/mL 페니실린, 5% CO2와 37 ° C에서 스 보완.
- 사과 쥬 스 플라스 미드와 셀 transfect
- Transfection 전에 적어도 18 h, 2.5 ml 당 적절 한 DMEM의 씨앗 0.3 x 106 셀 6 잘 플레이트에 고 37 ° C 하룻밤 60-80 %confluency 도달에서 세포를 품 어.
- 미리 사용 하기 전에 실내 온도에 transfection 시 따뜻한.
- 무 균 튜브에 혈 청 자유로운 매체의 장소 250 µ L.
참고:이 금액은 80 %confluency 6 잘 플레이트에 대 한 맞춤형. 필요한 경우, 비례 또는 셀 숫자의 크기에 따라 중간 금액을 조정 합니다. - 사과 쥬 스18 또는 TET2의 촉매 도메인 인코딩 플라스 미드의 2.5 µ g 추가 (긍정적인 제어 TET2CD)12,13 혈 청 무료 매체와 부드럽게 pipetting으로 혼합.
- 7.5 µ L transfection 시 약의 희석된 DNA 혼합물에 추가 하 고 부드럽게 pipetting으로 혼합.
- 20-30 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.
- 미리 데워 진된 미디어 변경 우물에 drop-wise 혼합물을 추가 하 고 부드럽게 흔들어 균일 하 게 배포 transfection 시 약 및 DNA 혼합물 셀 문화 접시.
- 하룻밤 사이, 세포와 혼합 incubate 고 transfection 시 약 2 ml 신선한 완전 한 DMEM 미디어를 포함 하를 바꿉니다.
- 화학 유도
- Rapamycin 재고 (DMSO에 용 해) 적절 한 완전 한 매체에서 20 µ M의 농도의 희석 2 mM.
- 20 µ L 희석된 rapamycin의 200의 최종 농도 도달 2 mL 매체에 유지 하는 transfected 세포에 추가 nM.
참고: 48 h에 대 한 보육, 후 셀은 5hmC 세대의 정량화 또는 다른 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 준비. 필요한 경우, 유도 효율은 셀 아래 설명 된 대로 추가 5hmC 부 량에 대 한 모든 3 h를 취 함으로써 모니터링 고 그림 1에 표시 된 수 있습니다. - 5hmC 유도 효율성의 더 나은 정량화에 대 한 시드 웰 스 모니터 셀 3 시간 마다 구분 합니다.
2. Immunostaining에 의해 Rapamycin 유도 5hmC 생산의 정량화
- 5hmC 면역 형광 염색
참고: 접시의 모든 세포를 충당 하기 위해 3 N HCl와 PBS에서 충분 한 양의 4 %paraformaldehyde, 0.2% 계면 활성 제 (Triton X-100) 등으로 구성 된 고정 솔루션을 추가 합니다. 예를 들어 솔루션의 500 µ L 6-잘 접시에 잘에 대 한 충분 한 것입니다. 실 온에서 모든 단계를 수행 합니다.- 셀을 수정, 추가 4% paraformaldehyde PBS에 rapamycin 치료 셀 주위 온도에 15 분 동안에. 컨트롤 그룹에 대 한 mCherry-사과주 rapamycin 치료 없이 표현 하는 셀을 사용 합니다. 교 반 하십시오 하지 않습니다.
주의: Paraformaldehyde 독성이 있다. 적절 한 보호를 착용 하십시오. - 통 솔루션을 삭제 합니다. 세포 막 permeabilize를 30 분 PBS에 0.2% 계면 활성 제와 고정된 셀을 품 어.
- Permeabilization 솔루션을 삭제 합니다. Permeabilized 셀에 3 N HCl를 추가 하 고 DNA를 변성을 15 분 동안 품 어.
- HCl 추가 100 mM Tris HCl 버퍼 (pH 8.0) pH의 중성화에 대 일 분에 대 한 셀을 삭제 합니다.
- 모든 솔루션을 삭제 합니다. 셀에 대 한 PBS와 철저 하 게 씻어 3-5 시간. PBS를 철저 하 게 제거 합니다.
참고: 모든 세척 단계에 대 한 PBS의 충분 한 양을 추가 합니다. 예를 들어 1 mL의 PBS 6 잘 플레이트에 대 한 충분 하다. - 1 %BSA 및 0.05%의 계면 활성 제 (예: 트윈 20) PBS에 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 블로킹 버퍼를 추가 하 여 셀을 차단 합니다.
- 삭제 차단 솔루션. 셀에 희석된 5hmC 항 체 (1: 200)을 추가 하 고 실 온에서 2 시간 또는 하룻밤 4 ° c.에 품 어
- 3 시간 15 분 대 한 PBS 가진 세포를 씻어.
- 추가 희석된 fluorophore (FITC)-셀에 이차 항 체 (1: 200)을 활용 하 고 1 시간에 품 어.
- 워시 PBS 가진 셀 세 번 광범위 하 게 잔여 항 체를 제거 하.
- 4'의 250 ng/mL을 추가, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 5 분에 대 한 핵 얼룩 제거 얼룩 솔루션.
- Immunostained 셀 confocal 영상에 대 한 슬라이드 또는 유리 하단 문화 접시를 탑재 합니다. 대표 결과 그림 1B에 보였다.
- 셀을 수정, 추가 4% paraformaldehyde PBS에 rapamycin 치료 셀 주위 온도에 15 분 동안에. 컨트롤 그룹에 대 한 mCherry-사과주 rapamycin 치료 없이 표현 하는 셀을 사용 합니다. 교 반 하십시오 하지 않습니다.
- Cytometry
참고: 다음 얼룩 절차에 대 한 96-잘 라운드 바닥판을 사용 합니다. 일반적으로, 150 µ L의 시 약은 각 잘 충분 합니다.- FACS 버퍼 (1 %BSA, 2 mM EDTA와 PBS)에 rapamycin 유도 transfected 세포 resuspend Rapamycin 치료 없이 사과 표현 셀을 사용 하 여 컨트롤 그룹에 대 한 있습니다.
- 수정 하 고 단계 2.1에 설명 된 대로 세포를 permeabilize.
- 10 분 동안 DNA를 변성 하 셀 2 N HCl를 추가 합니다.
- HCl 중화를 취소 하 고 단계 2.1에 설명 된 대로 세포를 차단 합니다.
- 셀에 희석된 안티-5hmC 항 체 (1: 200)을 추가 하 고 1 시간 실내 온도에 또는 하룻밤 4 ° c.에 대 한 품 어
- FACS 버퍼 셀 세 번 씻어. FACS 버퍼를 철저 하 게 제거 합니다.
- 추가 희석된 fluorophore (FITC)-형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 분석, 이차 항 체 (1:400)를 활용 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.
- FACS 버퍼 셀 세 번 씻어.
- 샘플은 FACS 분석에 대 한 준비가 되었습니다. 대표 결과 그림 1 c-D에 표시 했다.
3. 점 오 점 분석 결과 5hmC 및 5-methylcytosine (5mC) 척도를 도달
- 상업적인 DNA 추출 키트를 사용 하 여 transfected 및 rapamycin 유도 세포에서 게놈 DNA를 격리 합니다. Rapamycin 치료 없이 사과 쥬 스 페 셀을 사용 하 여 컨트롤 그룹에 대 한 있습니다.
- 80 ° C와 사전 담가 니트로 막 이중 증 류 H2O 그리고 염 분 나트륨 시트르산 (SSC) 버퍼 10 분 x 6에서에 진공 오븐이 열.
- 96-잘 PCR 접시에 같은 양의 DNA (TE 버퍼에 총 µ 2 g)의 60 µ L을 로드 합니다. 나머지 우물에 테 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)의 30 µ L를 추가 합니다.
- 확인 두 배 직렬 희석 세로 96 잘 접시에 2 행에 동일한 열 위치를 30 µ L 솔루션의 행 1에 전송 하 여 합니다. 다시 혼합 하 고 경계를 도달까지 후속 행에서 웰 스 솔루션의 30 µ L를 전송.
참고: 단계 3.7-3.10 진공의 사용을 포함.
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Representative Results
유도할 수 있는 화학 5mC-5hmC 변환 단일 셀 수준, 교류 cytometry 분석, transfected (mCherry 양성) 세포 인구에 또는 더 양적 점 오 점 분석 결과 그림 1에서 볼 수 있듯이 immunostaining에 의해 유효성 수 있습니다. TET2, 또는 TET2CD의 촉매 도메인 긍정적인 통제로 연구에 걸쳐 사용 되었다. 5hmC 및 chromatin 접근성에 rapamycin 유도 변경의 게놈 넓은 매핑에 대 한 자세한 내용은 참조 18-20 참조.
그림 1: HEK293T 셀에서 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 중재 하는 사이 다. 화학을 유도할 수 있는 epigenome (사과주)를 리 모델링 도구 (A) 디자인 분할에 따라 TET2 효소. (B) 대표 immunostaining (위 패널) 전에 사이 다-mCherry을 표현 하는 HEK293T 셀에 결과 (하단 패널) 후 rapamycin 치료 (200 nM). 녹색, mCherry-5hmC, 빨간색, 사과 쥬 스, 블루, DAPI 얼룩 핵의. 눈금 막대 = 10 µ m. (C) 흐름 cytometry 분석 하 여 정량화의 사과주 중재 5hmC 생산. 사과 쥬 스-mCherry TET2CD-mCherry (긍정적인 컨트롤로)의 페 HEK293T 셀 안티-5hmc 주 항 체와 FITC 표시 하는 이차 항 체 얼룩이 했다. TET2만 (mCherry) 및 5hmC (FITC) 두 배 긍정적인 세포 문이 되었고 표시. (D) 사과 표현 하는 HEK293T 세포에서 5hmC의 화학 유도할 수 있는 생산의 시간 과정 관리 또는 rapamycin의 철수 다음 (200 nM). n = 5, HEK293T 세포에서 5hmC 수준에 rapamycin을 유도할 수 있는 변화 척도를 평균 ± 사 우 스 다코타 (E) 점-오 점 분석 결과로 표시 되는 데이터. HEK293T 셀 사이 다 또는 TET2CD 구조와 페 했다. 알려진 양의 5hmC 합성 oligonucleotide 긍정적인 제어 (맨 위 행)로 사용 되었다. 로드 제어 입력된 DNA의 총 금액의 얼룩 블루 에틸렌에 의해 시각 하단 패널에 표시 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기 우리 DNA hydroxymethylation의 일시적인 제어를 달성 하기 위해 설계 된 분할-TET2 효소를 사용 하 여를 일러스트 있다. TET 가족 5-methycytosine dioxygenase의의 발견, 많은 연구 해독 TET 단백질과 그들의 주요 촉매 제품 5hmC,12,3,의 생물 학적 기능 수행 되었습니다. 4,5,6,7,,89,10,11. 그러나, 게놈에 있는 DNA 수정 일시 및 정밀 제어 분야에 대 한 까다로운 도전 되 고 있습니다. 우리의 사과 쥬 스 시스템 활용이 기술 격차를 채우기 위해 설계 된 DNA 효소를 수정 하는 몇 가지 시스템 중 하나입니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 주로 인간 미 발달 신장 (HEK) 293T HeLa 세포 선 등 모델 셀룰러 시스템에 맞게 됩니다. Rapamycin 농도 및 처리 시간 다른 세포 유형에서 최적의 성능을 달성 하기 위해 조정 해야 합니다. 최고의 5hmC 유도 시간 포인트를 찾으려면, 시간 과정 실험 우리가 1.3.3, 섹션에 설명 된 대로 좋습니다. 면역 형광 염색 transfected 세포에 5hmC의 가장 편리한 판독으로 사용할 수 있습니다. 더 많은 정량 분석에 대 한 점 오 점 분석 결과 좋지만 더 힘 드는 절차를 걸릴 수 있습니다. 점 오 점 분석에 대 한 입력된 DNA 양의 다른 세포 유형 대 한 낙관 되어야 한다. 2-fold 직렬 희석을 사용 하 여 DNA 로드 금액 변화 주의 적정 실험 하는 것이 좋습니다.
사과 쥬 스 시스템 다른 생물 학적 시스템에서 DNA hydroxymethylation 및 phenotypic 변화 간의 상관 관계를 해 부를 광범위 하 게 사용할 수 있습니다. 다음은 모범적인 다운스트림 응용 프로그램 또는 질문 사과 쥬 스 시스템으로 해결 될 수 있습니다.
TET 중재 5mC 산화는 어떻게 다양 한 모델 셀룰러 시스템에서 DNA 메 틸 화 풍경을 바꿀 것 이다? 이 지금 수 쉽게 해결할 있습니다 rapamycin 치료 전후 DNA methylome와 hydroxymethylome를 비교 하 여. 어떻게 chromatin 접근성 및 히스톤 수정 DNA hydroxymethylation 변경? Rapamycin의 대답을 말할 것 이다 전후 ATAC seq와 칩 Seq의 비교 같은 셀에 발생 합니다. TET 단백질 특정 유형의 암에 진압 역할을 하 고, 이후 TET 단백질의 화학 어떻게 유도할 수 있는 복원 테스트 하는 것이 흥미로울 것 이다 그리고 5hmC 생산 종양 성장에 범 하다 것 이다. 줄기 세포 분화에 TET/5hmC의 역할을 감안할 때, 그것은 어떻게 일시적으로 제어 하는 결정된 5hmC 생산 정의 transitionary 단계에서 줄기 세포의 개발 계보 사양에 영향을 수 있다.
현재 구성에서 사과 쥬 스 시스템 5mc-5hmC 변환 세계적으로 유도 하는 것만 사용할 수 있습니다. 이상적으로, 사이 다 촉매로 비활성 Cas9 또는 loci 특정 대상 및 유도할 수 있는 DNA 메 틸 화 게놈에서 편집 하면 그 orthologues 융합 될 수 있다. 개장 하는 도구 등 정밀 화학을 유도할 수 있는 epigenome 유전자 코드를 변경 하지 않고 포유류에서 epigenotype 표현 형 관계를 명확 하 게 조사에 광범위 하 게 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
우리 금융 감사 지원 건강의 국가 학회에서 부여 (R01GM112003 YZ), 웰 치 재단 (YZ에 될-1913 년), 미국 암 협회 (YZ에 RSG-16-215-01 TBE), 암 예방 및 연구 연구소의 텍사스 (YH에 RR140053 YZ RP170660), 미국 심장 협회 (YH에 16IRG27250155), 그리고 존 S. 던 재단 공동 연구 보너스 프로그램.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
References
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