Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

En konstruert Split-TET2 enzymet for kjemisk-induserbart DNA Hydroxymethylation og Epigenetic Remodeling

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56858
Automatic Translation
1, 2, 1
1Centre for Epigenetics and Disease Prevention, Department of Molecular and Cellular Medicine, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University, 2Centre for Translational Cancer Research, Department of Medical Physiology, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University

Summary

Detaljert protokoller for å innføre et konstruert split-TET2 enzym (CiDER) i pattedyrceller for kjemiske induserbart DNA hydroxymethylation og epigenetic remodeling presenteres.

Abstract

DNA metylering er en stabil og arvelige epigenetic endring i pattedyr genomet og er involvert i å regulere genuttrykk å kontrollere cellulære funksjoner. Reversering av DNA metylering eller DNA demethylation, er formidlet av ti-elleve translokasjon (TET) protein familien dioxygenases. Selv om det har blitt mye rapportert at avvikende DNA metylering og demethylation er forbundet med utviklingsmessige defekter og kreft, hvordan disse epigenetic endringer direkte bidra til påfølgende endring i genet uttrykk eller sykdom progresjon fortsatt uklart, hovedsakelig på grunn av mangel på pålitelig verktøy nøyaktig legge til eller fjerne DNA endringer i genomet definerte timelige og romlig oppløsning. For å overvinne dette hinderet, utviklet vi en split-TET2 enzym aktivere timelige kontroll av 5-methylcytosine (5mC) oksidering og påfølgende ombygging av epigenetic stater i pattedyrceller ved å legge kjemikalier. Her beskriver vi metoder for å introdusere en kjemisk-induserbart epigenome remodeling verktøyet (CiDER), basert på et konstruert split-TET2 enzym, i pattedyrceller og kvantifisere kjemiske induserbart produksjonen av 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) med immunostai-flowcytometri eller en prikk-blot analysen. Kjemisk-induserbart epigenome remodeling verktøyet finner bred bruk i avhør cellulær systemer uten å endre den genetiske koden og utprøvende epigenotype−phenotype forholdet i ulike biologiske systemer.

Introduction

DNA metylering, hovedsakelig refererer til tillegg av en metylgruppe på karbon 5 plasseringen av cytosine til 5-methylcytosine (5mC), er katalysert av DNA metyl-transferases (DNMTs). 5mC fungerer som en stor epigenetic hake i pattedyr genomet som ofte signaler for transcriptional undertrykkelse, X-chromosome inaktivering og transposon stanse1. Reversering av DNA metylering er formidlet av ti-alvenes translokasjon (TET) protein familien. TET enzymer tilhører jern (II) og 2-oxoglutarate avhengig av dioxygenases som katalysere påfølgende oksidasjon av 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxycytosine (5caC). 5mC TET-mediert oksidasjon legger et ekstra lag av epigenetic kontroll over pattedyr genomet. Oppdagelsen av TET har skapt intens interesse i feltet epigenetic å avsløre den biologiske funksjoner av TET proteiner og deres viktigste katalytisk produktet 5hmC. 5hmC er ikke bare et mellomledd i TET-mediert aktive DNA demethylation2,3,4, men også fungerer som en stabil epigenetic merke5,6,7,8 . Selv om DNA hydroxymethylation er sterkt korrelert med genuttrykk og avvikende er endringer i DNA hydroxymethylation forbundet med noen menneskelige lidelser9,10,11, årsakssammenhengen mellom epigenetic endringer på DNA og av fenotyper forblir ofte utfordrende etableres, som kan delvis tilskrives mangel på pålitelig verktøy nøyaktig legge til eller fjerne DNA endringer i genomet på definert timelige og romlig oppløsning.

Her rapporterer vi bruk av en kjemisk-induserbart epigenome remodeling verktøyet (CiDER) å overvinne hinder overfor studier av årsaksforhold mellom DNA hydroxymethylation og gene transkripsjon. Designen er basert på antagelsen om at katalytisk domenet til TET2 (TET2CD) kan deles inn i to inaktive fragmenter når uttrykt i pattedyrceller og enzymatiske funksjonen kan gjenopprettes ved å ta en kjemisk induserbart dimerization tilnærming ( Figur 1A). For å etablere en split-TET2CD systemet, valgte vi seks steder i TET2CD, består av en Cys-rik region og en dobbel-strandet β-helix (DSBH)-fold, basert på en rapportert krystallstruktur av TET2-DNA kompleks som mangler en lav kompleksitet regionen12. Et syntetisk gen koding rapamycin-induserbart dimerization modul FK506 binding protein 12 (FKBP12) og FKBP rapamycin bindende domene (FRB) av pattedyr målet på rapamycin14,15, med et selvstendig cleaving peptid T2A polypeptid sekvens16,17, ble individuelt satt inn i de valgte delte områdene innenfor TET2CD. Valg av TET2 som våre ingeniører mål er basert på følgende betraktninger. Første, somatiske mutasjoner i TET2 med samtidig reduksjon i DNA hydroxymethylation er ofte observert i menneskelige lidelser inkludert myelogen lidelser og kreft10, som gir nyttig informasjon om sensitive områder som må unngås for innsetting. Andre er en stor andel av TET2 katalytisk domenet, spesielt regionen lav kompleksitet, unnværlig for enzymatisk funksjonen12, dermed slik at vi kan lage en minimert split-TET2 for induserbart epigenetic endringer. Etter screening over 15 konstruksjoner, ble en konstruksjon som utstilt høyeste rapamycin-induserbart restaurering av den enzymatiske aktiviteten i pattedyr systemet valgt og angitt som CiDER18. Vi beskriver her bruken av mCherry-merket CiDER induserbart DNA hydroxymethylation og epigenetic remodeling med rapamycin og presentere tre metoder for validering CiDER-mediert 5hmC produksjon i en mobilnettet modellsystem HEK293T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle kultur, plasmider Transfection og kjemiske induksjon

  1. Kultur en tilhenger cellen linje (f.eks menneskelige embryonale nyre HEK293T celle) i Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM), supplert med 10% inaktivert fosterets bovin serum, 100 U/mL penicillin og streptomycin på 37 ° C med 5% CO2.
  2. Transfect celler med CiDER plasmider.
    1. Minst 18 h før transfection, frø 0.3 x 106 celler i 2,5 mL av aktuelle DMEM per godt i en 6-vel plate og ruge cellene på 37 ° C over natten å nå 60-80% confluency.
    2. Forvarm transfection reagensen til romtemperatur før bruk.
    3. Sted 250 µL av serum-free medium i et sterilt rør.
      Merk: Dette beløpet er skreddersydd for en 6-vel plate med 80% confluency. Hvis nødvendig, Juster proporsjonalt middels mengder ifølge størrelsene plater eller cellen tallene.
    4. Legge til 2,5 µg av plasmider koding CiDER18 eller katalytisk domenet TET2 (TET2CD som positive kontroll)12,13 til serum-free medium og forsiktig blanding av pipettering.
    5. Legge til 7,5 µL av transfection reagensen utvannet DNA blandingen og bland forsiktig av pipettering.
    6. Inkuber blandingen ved romtemperatur for 20-30 min.
    7. Endre forvarmes media og legg blandingen drop-wise fordelt, og forsiktig risting celle kultur plate for å jevnt distribuere transfection reagens og DNA blanding.
    8. Inkuber celler og blandingen over natten, og erstatt deretter transfection reagensen som inneholder medier med 2ml frisk fullstendig DMEM.
  3. Kjemisk induksjon
    1. Fortynne 2 mM rapamycin aksjer (oppløst i DMSO) til en konsentrasjon på 20 µM i riktig fullstendig medium.
    2. Legge til 20 µL av utvannet rapamycin i transfekterte celler vedlikeholdes i 2 mL medium for å nå en siste konsentrasjon av 200 nM.
      Merk: Etter inkubasjon 48 h celler er klar for kvantifisering av 5hmC generasjon eller andre programmer som nedstrøms. Eventuelt induksjon effektiviteten kan overvåkes ved å ta ut celler hver 3t for ytterligere 5hmC kvantifisering som beskrevet nedenfor og vist i figur 1.
    3. For bedre kvantifisering av 5hmC induksjon effektivitet skille frø brønner for å overvåke celler hver 3 timer.

2. kvantifisering av Rapamycin-indusert 5hmC produksjonen av immunostai-

  1. 5hmC immunofluorescence flekker
    Merk: Legg tilstrekkelig mengder fiksering løsningen, består av 4% paraformaldehyde, 0,2% surfactant (for eksempel Triton X-100) i PBS med 3 N HCl, å dekke alle cellene i platen. For eksempel ville 500 µL løsning være nok for et godt i en 6-vel plate. Alle trinnene i romtemperatur.
    1. For å fikse celler, legger du til 4% paraformaldehyde i PBS rapamycin-behandlet celler i 15 min ved omgivelsestemperatur. Kontrollgruppen, bruke celler som uttrykker mCherry-CiDER uten rapamycin behandling. Ikke røre.
      Forsiktig: Paraformaldehyde er giftige. Bruk passende beskyttelse.
    2. Kast etappe, den stabiliserende løsning. Inkuber fast celler med 0,2% surfactant i PBS i 30 min å permeabilize celle membran.
    3. Kast permeabilization løsning. Legge til 3 N HCl permeabilized cellene og ruge i 15 min til denature DNA.
    4. Kast HCl. Legg til 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) celler for 10 min for nøytralisering av pH.
    5. Forkaste alle løsningen. Vask celler grundig med PBS for 3 - 5 ganger. Fjerne PBS grundig.
      Merk: Legg tilstrekkelig mengder PBS for hver vask trinn. For eksempel er 1 mL av PBS nok for en 6-vel plate.
    6. Blokkere celler ved å legge blokkerer bufferen bestående av 1% BSA og 0,05% av surfactant (for eksempel mellom 20) i PBS 1t med mild risting.
    7. Kast blokkerer løsningen. Legg utvannet 5hmC antistoffer (1:200) til cellene og ruge for 2 timer ved romtemperatur eller overnatting på 4 ° C.
    8. Vask cellene med PBS tre ganger i 15 min.
    9. Legge til en utvannet fluorophore (FITC)-konjugert sekundære antistoff (1:200) til cellene og Inkuber 1t.
    10. Vask cellene med PBS tre ganger mye for å fjerne gjenværende antistoffer.
    11. Legg til 250 ng/mL av 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stain kjernen i 5 min. Fjern flekker løsningen.
    12. Montere lysbilde eller glass bunn kultur parabol med immunostained celler for AC confocal bildebehandling. En representant resultatet ble vist i figur 1B.
  2. Flowcytometri
    Merk: Bruk en 96-brønns runde bunnplaten for følgende flekker. 150 µL av reagenser er vanligvis tilstrekkelig for hver brønn.
    1. Resuspend transfekterte og rapamycin-indusert celler i FACS buffer (PBS med 1% BSA, 2 mM EDTA). Kontrollgruppen, bruke CiDER-uttrykke celler uten rapamycin behandling.
    2. Fastsette og permeabilize cellene som beskrevet i trinn 2.1.
    3. Legge til 2 N HCl cellene til denature DNA for 10 min.
    4. Forkaste HCl. nøytralisere og blokkere cellene som beskrevet i trinn 2.1.
    5. Legge til en utvannet anti-5hmC antistoff (1:200) i cellene og Inkuber 1t ved romtemperatur eller over natten på 4 ° C.
    6. Vask cellene med FACS buffer tre ganger. Fjerne FACS buffer grundig.
    7. Legge til en utvannet fluorophore (FITC)-konjugert sekundære antistoff (1:400) for fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) analyse og ruge 1t ved romtemperatur.
    8. Vask cellene med FACS buffer tre ganger.
    9. Eksempler er klar for FACS analyse. En representant resultatet ble vist i figur 1 c-D.

3. dot-blot analysen å kvantifisere 5hmC og 5-methylcytosine (5mC) beløp

  1. Isolere genomisk DNA fra transfekterte og rapamycin-indusert celler ved hjelp av en kommersiell DNA utvinning kit. Kontrollgruppen, bruke CiDER-transfekterte celler uten rapamycin behandling.
  2. Varme vakuum ovnen til 80 ° C og pre suge nitrocellulose membranen dobbel-destillert H2O og deretter 6 x saltholdig-natriumsitrat (SSC) bufferen for 10 min.
  3. Legg 60 µL av lik mengde DNA (totalt 2 µg TE buffer) til en 96-brønns PCR plate. Legge til 30 µL av TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) resten brønnene.
  4. Gjør todelt føljetong fortynninger vertikalt på 96-brønns platen ved å overføre 30 µL av løsningen på rad 1 til samme kolonne posisjon på rad 2. Bland igjen og overføre 30 µL av løsning til brønnene i den etterfølgende rad til å nå grensen.
Fjerne de siste 30 µL.
  • Legge til 20 µL av 1 M NaOH og 10 mM EDTA i hver brønn, forsegle platen og varm blandingen i 10 min på 95 ° C til helt denature DNA duplex.
  • Umiddelbart avkjølt prøvene på is og legge til 50 µL av iskalde 2 M ammonium acetate (pH 7.0) for å ruge på is 10 min.
    Merk: Trinn 3.7-3.10 innebærer bruk av vakuum.
  • Montere dot blot apparatet med pre-gjennomvåt membran og fjerne gjenværende buffer ved hjelp av fullt tomrom.
  • Vask membranen legger til 200 µL TE bufferen i hver brønn av dot blot apparater. Slå på vakuum fjerne TE buffer.
  • Last denaturert DNA (forberedt i trinnene 3.1-3.6) hver brønn av dot blot apparater. Slå på vakuum fjerne løsningen.
  • Vask membranen ved å legge til 200 µL av 2 x SSC og fjern gjenværende løsninger fullstendig ved hjelp av vakuum.
  • Demontere dot blot apparatet, ta ut membranen og skyll hele membranen med 20 mL av 2 x SSC.
  • Air-Dry membranen for 20 min.
  • Stek membranen på 80 ° C vakuum for 2T.
  • Legge til blokkering løsningen (5% skummet melk i TBST) i membranen og ruge 1t ved romtemperatur.
  • Kast blokkerer løsningen. Legge til en utvannet 5hmC (1:5, 000) eller 5mC (1:1, 000) antistoffer mot membranen og ruge over natten på 4 ° C.
  • Vask membranen med TBST tre ganger i 10 min å fjerne gjenværende antistoffer. Fjern TBST grundig.
  • Legge til en sekundær HRP-konjugerte antistoffer (1:10, 000 for anti-kanin HRP(5hmC) eller 1:3,000 for anti-mus HRP(5mC)) til membranen og Inkuber 1t ved romtemperatur.
  • Vask membranen med TBST tre ganger i 10 min.
  • Legg ECL vestlige blotting substrat å membranen for visualisering av 5hmC signaler ved hjelp av en chemiluminescence detektor. En representant resultatet ble vist i figur 1E.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Kjemisk induserbart 5mC-til-5hmC konvertering kan valideres av immunostaining på encellede nivå, flyt cytometri analyse av transfekterte (mCherry-positive) celle populasjoner eller en mer kvantitativ dot-blot analysen som vist i figur 1. Katalytisk domenet TET2, eller TET2CD, ble brukt gjennom hele studiet som en positiv. Se referanser 18-20 for ytterligere detaljer angående genomet hele tilordningen av rapamycin-induserte endringer i 5hmC og chromatin tilgjengelighet.

    Figure 1
    Figur 1: CiDER-mediert induserbart DNA hydroxymethylation i HEK293T celler. (A) Design av en kjemisk-induserbart epigenome remodeling (CiDER) verktøy basert på en delt TET2 enzym. (B) representant immunostai-resultater i HEK293T celler uttrykke CiDER-mCherry før (øvre panel) og etter (nedre panel) rapamycin behandling (200 nM). Green, 5hmC, rød, CiDER-mCherry, blå, DAPI farging av kjerner. Skala bar = 10 µm. (C) kvantifisering av CiDER-mediert 5hmC produksjon av flyt cytometri analyse. HEK293T celler transfekterte med CiDER-mCherry av TET2CD-mCherry (som positive kontroll) var farget med et anti-5hmc primære antistoff og en sekundær antistoff-FITC-merket. Bare TET2 (mCherry) og 5hmC (FITC) dobbel-positive celler var gated og angitt. (D) gang løpet av kjemiske induserbart produksjon av 5hmC i HEK293T celler uttrykke CiDER etter administrasjon eller tilbaketrekking av rapamycin (200 nM). n = 5, dataene som gjennomsnittlig ± SD (E) Dot-blot analysen å kvantifisere rapamycin-induserbart endringer i 5hmC nivåer i HEK293T celler. HEK293T celler ble transfekterte med en CiDER eller TET2CD konstruere. En syntetisk oligonucleotide med en kjent 5hmC ble brukt som en positiv (øverste rad). Kontrollen laster visualisert ved etylen blå flekker totalbeløpet av input DNA ble vist i det nedre panelet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Her har vi illustrert bruken av et konstruert split-TET2 enzym å oppnå verdslige kontroll av DNA hydroxymethylation. Etter oppdagelsen av TET familie av 5-methycytosine dioxygenase, har mange studier utført for å dechiffrere de biologiske funksjonene TET proteiner og deres store katalytisk produkt 5hmC1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11. Timelige og presis kontroll over DNA endringer i genomet fortsetter imidlertid å være en krevende utfordring for feltet. Våre CiDER system er en av de få systemene bruker en konstruert DNA endring av enzymet for å fylle denne teknisk gap. Protokollen beskrevet her er det meste skreddersydd for modell cellulær systemer, som menneskelige embryonale nyrene (HEK) 293T og HeLa cellelinjer. Rapamycin konsentrasjoner og behandling tid må justeres for å oppnå optimal ytelse i forskjellige celletyper. For å finne ut det beste 5hmC induksjon punktet, anbefales en gang kurs eksperimentet, som vi beskrevet i delen 1.3.3. Immunofluorescence farging av 5hmC i transfekterte celler kan brukes som er mest praktisk avlesning. For en mer kvantitativ analyse, en prikk-blot analysen anbefales, men det kan ta mer arbeidskrevende prosedyrer. For punkt-blot analyser, må mengder inn DNA optimaliseres for forskjellige celletyper. En forsiktig titrering eksperimentere med 2-fold føljetong fortynning med varierende DNA laste beløp anbefales.

    CiDER systemet kan grovt brukes til å analysere sammenhengen mellom DNA hydroxymethylation og fenotypiske endringer i ulike biologiske systemer. Listet nedenfor er eksemplarisk nedstrøms programmer eller spørsmål som kan løses med CiDER systemet.

    Hvordan vil 5mC TET-mediert oksidasjon endre DNA metylering landskapet i ulike mobilnettet modellsystem? Dette kan nå lett rettes ved å sammenligne DNA methylome og hydroxymethylome før og etter rapamycin behandling. Hvordan vil DNA hydroxymethylation endre chromatin tilgjengelighet og histone modifikasjoner? En sammenligning av ATAC-seq og ChIP-Seq resulterer i samme celle før og etter administrasjon av rapamycin vil fortelle svaret. Siden TET proteiner spiller en undertrykkende rolle i visse typer kreft, det vil være interessant å teste hvordan kjemiske induserbart restaurering av TET protein og 5hmC produksjon vil impinge på tumor vekst. Gitt rollen TET/5hmC i stamcelleforskningen differensiering, gjenstår det for å være bestemt hvordan timelig kontrollert 5hmC produksjon på et definert transitionary stadium vil påvirke avstamning spesifikasjon av stamceller under utvikling.

    I sin nåværende konfigurasjon, kan CiDER systemet bare brukes til globalt indusere 5mc-til-5hmC konvertering. Ideelt sett CiDER kan være smeltet sammen med en katalytisk inaktive Cas9 eller dens orthologues, som gjør loci-spesifikk målgruppe og induserbart DNA metylering redigering i genomet. Slik presis kjemisk-induserbart epigenome remodeling verktøyet kan bli mye brukt å entydig undersøke epigenotype-fenotypen forholdet i pattedyr uten å endre den genetiske koden.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

    Acknowledgments

    Vi takker finans støtter fra National Institutes of Health gir (R01GM112003 til YZ), Welch grunnlaget (BE-1913 til YZ), American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE til YZ), Cancer Prevention og Research Institute of Texas (RR140053 til YH, RP170660 til YZ), the American Heart Association (16IRG27250155 til YH), og John S. Dunn Foundation forskningssamarbeid Award programmet.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668027
    Rapamycin Sigma-Aldrich 37094
    Paraformaldehyde, 16% Solution VWR 100503-916
    Triton X-100 Amresco 0694-1L
    Hydrochloric Acid Amresco 0369-500ML
    Albumin, Bovine Amresco 0332-100G
    Tween 20 Amresco 0777-1L
    5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) Active Motif 39769
    Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
    4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) Biotium 40043
    SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) SHEL LAB SVAC1E
    UltraPure SSC, 20X Thermo Fisher Scientific 15557036
    Bio-Dot Apparatus BIO-RAD 1706545
    Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 Millipore MABE146
    Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S
    West-Q Pico Dura ECL Solution Gendepot W3653-100

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).
    2. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
    3. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
    4. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
    5. Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
    6. Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
    7. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
    8. Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
    9. Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
    10. Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
    11. Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
    12. Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
    13. Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
    14. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
    15. Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
    16. Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
    17. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).
    18. Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
    19. Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
    20. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).

    Tags

    Kjemi problemet 130 DNA metylering epigenetics chromatin tilgjengelighet DNA demethylation kjemiske biologi TET2 5-hydroxymethylcytosine transkripsjon genekspresjon epigenome redigering
    En konstruert Split-TET2 enzymet for kjemisk-induserbart DNA Hydroxymethylation og Epigenetic Remodeling
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An… More

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling. J. Vis. Exp. (130), e56858, doi:10.3791/56858 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter