Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kimyasal-indüklenebilir DNA Hydroxymethylation ve epigenetik Remodeling için bir mühendislik Split-TET2 enzim

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56858
Automatic Translation
1, 2, 1
1Centre for Epigenetics and Disease Prevention, Department of Molecular and Cellular Medicine, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University, 2Centre for Translational Cancer Research, Department of Medical Physiology, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University

Summary

Memeli hücreleri kimyasal indüklenebilir DNA hydroxymethylation ve epigenetik remodeling için içine bir mühendislik Böl-TET2 enzim (elma şarabı) tanıtmak için detaylı protokolleri mevcuttur.

Abstract

DNA metilasyonu memeli genom bir istikrarlı ve kalıtsal epigenetik değişiklik ve hücresel işlevleri kontrol etmek için gen ifadesinin düzenlenmesine ilgilenmektedir. DNA metilasyonu veya DNA demethylation, ters dioxygenases on-on translocation (TET) protein ailesinde aracılık ettiği. Her ne kadar bu anormal DNA metilasyonu ve demethylation gelişimsel kusurlar ve kanser ile ilişkili olan yaygın olarak bildirilmiştir, nasıl epigenetik değişikliklerin doğrudan sonraki değişiklik gen ifade veya hastalık ilerleme katkıda büyük ölçüde doğru eklemek veya DNA genom tanımlanmış zamansal ve mekansal çözünürlükte içinde kaldırmak için güvenilir araçları eksikliği nedeniyle belirsizdir. Bu engeli aşmak için bir split-TET2 enzim 5-metilsitozin (5mC) oksidasyon zamansal kontrolünü ve sonraki memeli hücrelerinde epigenetik Birleşik sadece kimyasallar ekleyerek remodeling etkinleştirmek için tasarlanmıştır. Burada, bir kimyasal indüklenebilir epigenome tadilat araç (elma şarabı), memeli hücreleri ve ile 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC) kimyasal indüklenebilir üretim miktarının bir mühendislik Böl-TET2 enzim üzerinde dayalı tanıtmak için yöntemleri tarif immunostaining, Akış Sitometresi veya bir nokta-leke tahlil. Bu kimyasal-indüklenebilir epigenome tadilat araç geniş kullanım hücresel sistemleri genetik kodu değiştirmeden sorguya yanı sıra çeşitli biyolojik sistemlerde epigenotype−phenotype ilişkiler sondalama bulacaksınız.

Introduction

DNA metilasyonu, çoğunlukla, DNA metil-Transferazlar tarafından (DNMTs) katalize sitozin karbon 5 konumunu 5-metilsitozin (5mC) oluşturmak için bir metil grubu eklenmesi anlamına gelir. 5mC büyük bir epigenetik işareti kez transkripsiyon baskı, x kromozomu inactivation ve transposon1susturmak için sinyalleri memeli genom, görür. DNA metilasyonu iptali on-Elf translocation (TET) protein ailesi tarafından aracılık ettiği. TET enzimler ait demir (II) ve 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) ve 5-carboxycytosine (5caC) 5mC art arda gelen oksidasyon katalizler 2-oxoglutarate bağımlı dioxygenases. TET-aracılı 5mC oksidasyon ek bir memeli genom üzerinde epigenetik kontrol katmanı uygular. TET keşfi TET proteinlerin biyolojik fonksiyonları ve onların büyük katalitik ürün 5hmC açıklayacak epigenetik alanındaki yoğun ilgi yol açtı. 5hmC sadece bir ara TET-aracılı aktif DNA demethylation2sırasında,3,4, değil ama aynı zamanda kararlı bir epigenetik görevi görür5,6,7,8 işareti . DNA hydroxymethylation son derece gen ekspresyonu ile ilişkili ve anormal olmasına rağmen DNA hydroxymethylation bazı insan bozuklukları9,10,11ile nedensel ilişkileri ilişkili değişikliklerdir DNA üzerindeki epigenetik değişiklikler ve fenotipleri arasında sık sık kurulacak zorlu kalır, hangi kısmen doğru eklemek veya DNA genom içinde kaldırmak için güvenilir aracı olmadığı için atfedilen zamansal ve mekansal tanımlı Çözünürlük.

Burada aracı (çalışmaların nedensel ilişkileri karşı karşıya engel aşmak için elma şarabı) arasında DNA hydroxymethylation ve gen transkripsiyonu remodeling bir kimyasal indüklenebilir epigenome kullanımı raporu Tasarım varsayımına dayanır bu TET2 katalitik etki alanını (TET2CD) memeli hücrelerinde ifade iki etkin olmayan parçaları içine bölünmüş ve enzimatik işlevi bir kimyasal indüklenebilir dimerization yaklaşım ( alarak geri yüklenebilir Şekil 1A). Böl-TET2CD sistemi kurmak için TET2CD, Cys-zengin bölge ve düşük karmaşıklık bölge12yoksun TET2-DNA kompleks bildirilen kristal yapısı temelinde bir çift iplikli β-helix (DSBH) kat oluşan altı sitelerinin seçilmesini. Sentetik bir gen Rapamycin indüklenebilir dimerization modülü FK506 bağlayıcı protein 12 (FKBP12) kodlama ve rapamycin14,15, kendi kendine sıyırmada peptid T2A birlikte memeli hedefinin FKBP rapamycin bağlayıcı etki (FRB) polipeptid sıra16,17, tek tek TET2CD içinde seçilen split siteleri içine eklenir. TET2 seçimi mühendislik hedefimiz olarak aşağıdaki önemli noktalar üzerinde temel alır. TET2 ilk, somatik mutasyonlar DNA hydroxymethylation eşlik eden azalma ile sık sık Miyeloid bozuklukları ve kanser10için kaçınılması gereken duyarlı sitelerin yararlı bilgiler sağlar, dahil olmak üzere insan hastalıklarda gözlenir ekleme. İkinci olarak, TET2 katalitik domain, özellikle düşük karmaşıklık bölgesinde, büyük bir kısmı böylece bize bir simge durumuna küçültülmüş Böl-TET2 indüklenebilir epigenetik değişiklikler için tekne etkinleştirme enzimatik işlevi12, gereksiz. 15 yapıları eleme sonra onun enzim aktivitesinin en yüksek rapamycin indüklenebilir restorasyon memeli sistemdeki sergilenen bir yapı seçilmiş ve elma şarabı18belirlenmiş. Biz burada indüklenebilir DNA hydroxymethylation ve epigenetik rapamycin ile yeniden elde etmek için mCherry öğesini elma suyu nasıl kullanılacağını açıklar ve elma şarabı aracılı 5hmC üretim modeli hücresel sisteminde HEK293T doğrulamak için üç yöntem mevcut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hücre kültürü, plazmid Transfection ve kimyasal indüksiyon

  1. Kültür ile % 10 ısı inaktive fetal sığır serum, 100 U/mL penisilin ve streptomisin %5 CO237 ° C'de takıma bir yapisan hücre kültürünü (örneğin, insan embriyonik böbrek HEK293T hücre) (DMEM), Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal ortamda.
  2. Elma şarabı plazmid hücrelerle transfect.
    1. En az 18 h transfection önce tohum 0,3 x 106 hücre uygun DMEM 2.5 ml 6-şey tabak içinde iyi ve hücreleri 37 ° C'de % 60-80 confluency ulaşmak için gecede kuluçkaya.
    2. Kullanmadan önce oda sıcaklığına transfection reaktif önceden ısıtmak.
    3. Yer 250 µL serum-Alerjik orta steril bir tüp.
      Not: Bu miktar % 80'i confluency ile 6-şey plaka için hazırlanmıştır. Gerekirse, orantılı olarak orta miktarda plakaları veya hücre sayıları boyutları göre belirleyin.
    4. Elma şarabı18 veya TET2 katalitik domain kodlama plazmid 2,5 µg Ekle (TET2CD pozitif kontrol olarak)12,13 serum-Alerjik orta içine ve yavaşça karıştırın pipetting tarafından.
    5. Transfection reaktif 7.5 µL seyreltilmiş DNA karışıma ekleyin ve karışımı yavaşça pipetting tarafından.
    6. 20-30 dakika oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya.
    7. Önceden ısıtılmış medya değiştirmek ve karışımı drop-wise wells için ekleyin ve hafifçe DNA karışımı ve transfection reaktifi olarak dağıtabilmenizi hücre kültür plaka sallamak.
    8. Hücreleri ve karışımı bir gecede kuluçkaya ve ortamı ile taze tam DMEM 2 ml içeren transfection reaktif değiştirir.
  3. Kimyasal indüksiyon
    1. Seyreltik 2 mM (DMSO içinde çözünmüş) rapamycin stok uygun tam orta 20 µM bir konsantrasyon için.
    2. Transfected hücreleri 200 son bir konsantrasyon ulaşmak için 2 mL ortamda muhafaza seyreltilmiş rapamycin 20 µL eklemek nM.
      Not: 48 h için kuluçka sonra hücreleri 5hmC nesil miktar veya başka herhangi bir aşağı akım uygulama için hazırsınız demektir. Gerekirse, indüksiyon verimliliği hücreleri daha fazla 5hmC miktar aşağıda açıklandığı gibi her 3 h yaptırmayı tarafından izlenen ve şekil 1' de gösterilen.
    3. İçin daha iyi miktar 5hmC indüksiyon verimlilik tohum hücreleri 3 saatte izlemek için kuyu ayırın.

2. miktar Rapamycin kaynaklı 5hmC üretim Immunostaining tarafından

  1. 5hmC ayirt boyama
    Not: PBS plaka tüm hücrelerde kapsayacak şekilde 3 N HCl ile % 4 paraformaldehyde, %0.2 yüzey aktif (örneğin Triton X-100) oluşan fiksasyon çözüm yeterli miktarda ekleyin. Örneğin, 500 µL çözüm için iyi bir 6-şey plaka yeterli. Oda sıcaklığında tüm adımları gerçekleştirin.
    1. Hücreleri gidermek için 15 dakika ortam sıcaklığı, rapamycin tedavi hücrelere PBS içinde %4 paraformaldehyde ekleyin. Kontrol grubu için hücreleri mCherry-elma rapamycin tedavisi olmadan ifade kullanın. Kışkırtmak değil.
      Dikkat: Paraformaldehyde zehirlidir. Uygun koruma giymek.
    2. Sabitleştirici çözüm atın. Sabit % 0,2 yüzey aktif hücre zarının permeabilize için PBS için 30 dk içinde hücrelerle kuluçkaya.
    3. Permeabilization çözüm atın. 3 N HCl permeabilized hücrelere ekleme ve 15dk için DNA'yı denatüre kuluçkaya.
    4. HCl. ekle 100 mM Tris-HCl arabelleğe (pH 8.0) pH nötralize için 10 min için hücreleri atın.
    5. Tüm çözüm atın. Hücreler için PBS ile iyice yıkayın 3 - 5 kez. PBS iyice kaldır.
      Not: PBS her yıkama adım için yeterli miktarda ekleyebilirsiniz. Örneğin, PBS 1 mL 6-şey plaka için yeterli.
    6. Hücreleri % 1 BSA ve yüzey aktif (örneğin ara 20) PBS içinde nazik sallayarak ile 1 h için % 0.05 oluşan engelleme arabelleği ekleyerek engellemek.
    7. Engelleme çözüm atın. Seyreltilmiş 5hmC antikor (1: 200) hücrelere ekleme ve oda sıcaklığında 2 h veya gecede 4 ° C'de için kuluçkaya
    8. PBS hücrelerle 15dk için üç kez yıkayın.
    9. Seyreltilmiş fluorophore (FITC) Ekle-Birleşik hücreler için ikincil antikor (1: 200) ve 1 h için kuluçkaya.
    10. PBS hücrelerle üç kez kalan antikorlar kaldırmak için kapsamlı bir şekilde yıkayın.
    11. 250 ng/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole (çekirdek leke DAPI) 5 dk. Kaldır boyama çözüm ekleyin.
    12. Slayt veya cam-alt kültür çanak confocal görüntüleme için immunostained hücreler bağlayın. Temsil edici bir sonuç şekil 1Badımında gösterildi.
  2. Akış Sitometresi
    Not: 96-şey yuvarlak alt plaka boyama yordamını kullanın. Genellikle, 150 µL reaktifler, her şey için yeterli olur.
    1. FACS arabellek (PBS % 1 BSA, 2 mM EDTA ile) transfected ve rapamycin kaynaklı hücrelerinde resuspend. Kontrol grubu için rapamycin tedavisi olmayan hücreler elma şarabı ifade kullanın.
    2. Fix ve hücreleri adım 2.1 içinde açıklandığı gibi permeabilize.
    3. 2 N HCl 10 min için DNA denatüre hücrelere ekleyin.
    4. HCl. Nötrleştir atın ve adım 2.1 içinde açıklandığı gibi hücreleri engellemek.
    5. Seyreltilmiş anti-5hmC antikor (1: 200) hücrelere ekleme ve oda sıcaklığında veya gecede 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya
    6. FACS arabellek içeren hücreleri üç kez yıkayın. FACS arabellek iyice kaldır.
    7. Seyreltilmiş fluorophore (FITC) Ekle-Birleşik Floresans aktif hücre (FACS) analiz sıralama için ikincil antikor (1: 400) ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
    8. FACS arabellek içeren hücreleri üç kez yıkayın.
    9. Örnekleri FACS analiz için hazırsınız demektir. Temsil edici bir sonuç şekil 1 c-Dgösterildi.

3. nokta-leke tahlil 5hmC ve 5-metilsitozin (5mC) ölçmek için tutarlar

  1. Bir ticari DNA ekstraksiyon kiti kullanarak transfected ve rapamycin kaynaklı hücrelerden genomik DNA izole et. Kontrol grubu için rapamycin tedavisi olmayan hücreler elma suyu transfected kullanın.
  2. Isı 80 ° C ve öncesi emmek nitroselüloz membran çift distile H2O ve o zaman 6 x 10 min için serum sodyum sitrat (SSC) arabellek vakum fırın.
  3. 60 µL bir 96-şey PCR plakasına eşit miktarda DNA (Toplam 2 µg TE arabelleği) yükleyin. Geri kalan wells TE arabelleği (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 30 µL ekleyin.
  4. İki kat seri dilutions çözüm 30 µL satır 1 2 satırda aynı sütun konumu aktararak 96-şey plaka üzerinde dikey olarak yapmak. Tekrar karıştırın ve sınır ulaşan kadar sonraki satırda wells çözüm 30 µL aktarmak.
Son 30 µL kaldırın.
  • Her şey için 1 M NaOH ve 10 mM EDTA 20 µL eklemek, plaka mühür ve tamamen DNA çift yönlü denatüre 95 ° C de 10 dakika için karışım ısı.
  • Buz üzerinde örnekleri sakin ve buz gibi 2 M amonyum asetat (pH 7,0) 50 µL eklenir ve 10 min için buz üzerinde kuluçkaya.
    Not: Adım 3.7-3.10 vakum kullanımı içerir.
  • Nokta leke aparatı öncesi membran ile montaj ve kalan arabellek tam vakum kullanarak kaldırın.
  • Membran nokta leke aparatı her şey için 200 µL TE arabelleği ekleyerek yıkayın. TE arabellek kaldırmak için vakum açmak.
  • (Önceki adımlarda 3.1-3.6 hazır) denatüre DNA her şey nokta leke cihazları için yükleyin. Çözümü kaldırmak için vakum açmak.
  • Membran 2 tamamen vakum kullanma SSC ve Kaldır artık çözümler x 200 µL ekleyerek yıkayın.
  • Nokta leke aparatı sökmeye, membran almak ve tüm membran ile 20 mL 2 durulama x SSC.
  • Membran 20 dakika kuruması.
  • Membran vakum için 2 h altında 80 ° C'de pişirin.
  • Membran için engelleme çözüm (yağsız süt TBST % 5) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
  • Engelleme çözüm atın. Bir sulandırılmış 5hmC (1:5, 000) veya 5mC (1:1, 000) eklemek için membran antikorları ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya
  • Membran ile kalan antikorlar kaldırmak için TBST 10 dk için üç kez yıkayın. TBST iyice kaldır.
  • HRP-Birleşik bir ikincil antikor ekleyin (1:10, 000 Anti-tavşan HRP(5hmC) için veya 1:3,000 Anti-fare HRP(5mC)) membran ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
  • TBST ile membran 10 min için üç kez yıkayın.
  • ECL substrat Kemiluminesan dedektörü kullanarak 5hmC sinyalleri görselleştirme için membran için kurutma Batı ekleyin. Temsil edici bir sonuç şekil 1Eiçinde gösterildi.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Kimyasal indüklenebilir 5mC 5hmC dönüşüm immunostaining tek hücre düzeyinde, transfected (mCherry-pozitif) hücre popülasyonlarının Akış Sitometresi Analizi veya şekil 1' de gösterildiği gibi daha nicel bir nokta-leke tahlil tarafından doğrulanabilir. TET2 veya TET2CD, katalitik etki alanı çalışma pozitif bir denetim kullanılmıştır. Başvurular 18-20 rapamycin kaynaklı değişiklikler genom geniş eşleme ile ilgili daha fazla bilgi için bkz: 5hmC ve Kromatin erişilebilirlik.

    Figure 1
    Şekil 1: elma suyu-aracılı indüklenebilir DNA hydroxymethylation HEK293T hücrelerdeki. (A)tasarım (elma şarabı) remodeling kimyasal-indüklenebilir epigenome Aracı'nın üzerinde bir bölünme dayalı TET2 enzim. (B) temsilcisi immunostaining sonuçları HEK293T hücrelerdeki elma suyu-mCherry (önce üst paneli) ifade ve sonra (alt paneli) rapamycin tedavisi (200 nM). Yeşil, 5hmC, kırmızı, elma suyu-mCherry, mavi, DAPI çekirdekleri boyama. Ölçek çubuğu 10 µm. (C) elma suyu miktar-aracılı 5hmC Üretim Akış Sitometresi Analizi tarafından =. HEK293T hücreleri ile elma suyu-mCherry TET2CD-mCherry (pozitif kontrol) olarak, transfected bir anti-5hmc birincil antikor ve FITC etiketli bir ikincil antikor ile lekeli. Sadece TET2 (mCherry) ve 5hmC (FITC) çift-pozitif hücreler Geçişli ve belirtti. (D) saat ders 5hmC elma şarabı ifade HEK293T hücrelerde kimyasal indüklenebilir üretim yönetim veya rapamycin geri çekilmesi aşağıdaki (200 nM). n = 5, 5hmC düzeyleri HEK293T hücrelerdeki rapamycin indüklenebilir değişiklikleri ölçmek için ortalama ± SD (E) nokta-leke tahlil olarak gösterilen veriler. HEK293T hücreleri ile bir elma suyu veya TET2CD yapısı transfected. 5hmC bilinen bir miktarı ile sentetik Oligonükleotid olumlu bir denetimi (üst satırı) olarak kullanılmıştır. Etilen giriş DNA'ın toplam miktarda boyama mavi tarafından görüntülenmiştir yükleme Denetim Masası'ndaki alt gösterildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Burada DNA hydroxymethylation zamansal kontrolünü elde etmek için bir mühendislik Böl-TET2 enzim kullanımı resimli. 5-methycytosine dioxygenase ailesinin TET keşfi, TET proteinler ve onların büyük katalitik ürün 5hmC1,2,3biyolojik fonksiyonları deşifre etmek için birçok çalışma gerçekleştirilmiş, 4,5,6,7,8,9,10,11. Ancak, genom olarak DNA değişiklikleri üzerinde geçici ve kesin kontrol alanı için zorlu bir sorun olmaya devam etmektedir. Elma suyu sistemimiz teknik bu boşluğu doldurmak için enzim değiştirme mühendislik bir DNA kullanan birkaç sistemlerinden biridir. Burada açıklanan protokol çoğunlukla insan embriyonik böbrek (HEK) 293T ve HeLa hücre hatları gibi hücresel sistemleri modellemek için hazırlanmıştır. Rapamycin konsantrasyonları ve tedavi süresi farklı hücre türleri içinde en iyi performansı sağlamak için ayarlanması gerekebilir. En iyi 5hmC indüksiyon zaman nokta dışarı bulmak için bir saat ders deneme 1.3.3, bölümünde açıklandığı gibi kesinlikle önerilir. 5hmC transfected hücrelerde, ayirt boyama en uygun okuma kullanılabilir. Daha fazla nicel analiz için bir nokta-leke tahlil tavsiye edilir ama o-ebilmek almak daha zahmetli yordamlar. Nokta-leke deneyleri için giriş DNA miktarda farklı hücre türleri için optimize edilmiş olması gerekir. Logosuna 2 kat seri dilüsyonu kullanılarak DNA yükleme tutarları farklı bir dikkatli titrasyon deney önerilir.

    Elma suyu sistemi genel olarak farklı biyolojik sistemlerde DNA hydroxymethylation ve fenotipik değişiklikler arasındaki ilişkiyi incelemek için kullanılabilir. Aşağıda örnek aşağı akım uygulamaları veya elma suyu sistemi ile ele alınması sorular vardır.

    Nasıl TET-aracılı 5mC oksidasyon DNA metilasyonu manzara çeşitli model hücresel sistemi değiştirecek? Bu şimdi kolayca rapamycin işlemden önce ve sonra DNA methylome ve hydroxymethylome karşılaştırarak saptanabilir. DNA hydroxymethylation Kromatin erişilebilirlik ve Histon değişiklikleri nasıl değiştirecek? ATAÇ-seq ve ChIP-Seq karşılaştırma aynı hücrede önce ve sonra rapamycin yönetiminin cevap söyleyecektir sonuçlanır. TET proteinler belli kanser türlerini baskılayıcı bir rol TET protein nasıl kimyasal indüklenebilir restorasyon test etmek ilginç olacak ve 5hmC üretim tümör büyüme vurmak. TET/5hmC rolünü kök hücre farklılaşması içinde göz önüne alındığında, tanımlanmış bir transitionary aşamada kararlı nasıl geçici kontrollü 5hmC üretim geliştirme sırasında kök hücrelerin lineage belirtimi üzerinde etkisi olacaktır olmak kalır.

    Geçerli yapılandırmasıyla, elma suyu sistemi sadece genel olarak 5mc 5hmC dönüşüm ikna etmek için kullanılabilir. İdeal olarak, elma suyu catalytically etkin olmayan bir Cas9 veya loci özel hedefleme ve indüklenebilir DNA metilasyonu genom düzenleme sağlayacaktır onun orthologues ile erimiş. Böyle hassas kimyasal-indüklenebilir epigenome aracı remodeling belirsizliğe yer bırakmadan memeliler epigenotype fenotip ilişkilerde genetik kodu değiştirmeden soruşturma için yaygın olarak uygulanabilir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

    Acknowledgments

    Biz mali teşekkür çekmek--dan ulusal sağlık Enstitüleri (YZ R01GM112003), hibe Welch Vakfı (YZ için BE-1913), Amerikan Kanser Derneği (RSG-16-215-01 TBE YZ için), kanser önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü (RR140053 YH için RP170660 YZ için), Amerikan Kalp Derneği (YH 16IRG27250155) ve John S. Dunn Vakfı ortak araştırma ödülü programı.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668027
    Rapamycin Sigma-Aldrich 37094
    Paraformaldehyde, 16% Solution VWR 100503-916
    Triton X-100 Amresco 0694-1L
    Hydrochloric Acid Amresco 0369-500ML
    Albumin, Bovine Amresco 0332-100G
    Tween 20 Amresco 0777-1L
    5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) Active Motif 39769
    Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
    4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) Biotium 40043
    SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) SHEL LAB SVAC1E
    UltraPure SSC, 20X Thermo Fisher Scientific 15557036
    Bio-Dot Apparatus BIO-RAD 1706545
    Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 Millipore MABE146
    Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S
    West-Q Pico Dura ECL Solution Gendepot W3653-100

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).
    2. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
    3. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
    4. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
    5. Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
    6. Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
    7. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
    8. Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
    9. Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
    10. Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
    11. Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
    12. Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
    13. Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
    14. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
    15. Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
    16. Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
    17. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).
    18. Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
    19. Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
    20. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).

    Tags

    Kimya sayı: 130 DNA metilasyonu epigenetik Kromatin erişilebilirlik DNA demethylation Kimya Biyoloji TET2 5 arasında bakterilerde görülen transkripsiyon gen ekspresyonu epigenome düzenleme
    Kimyasal-indüklenebilir DNA Hydroxymethylation ve epigenetik Remodeling için bir mühendislik Split-TET2 enzim
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An… More

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling. J. Vis. Exp. (130), e56858, doi:10.3791/56858 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter