Summary
本研究介绍一种自由运动大鼠脑、心电图、electromyograms 和呼吸信号中局部场电位同时记录的方法。这种技术降低了实验成本, 简化了数据分析, 有助于理解大脑和周围器官之间的相互作用。
Abstract
监测大脑和周围组织的生理动态是解决一些问题, 关于大脑如何控制身体功能和内部器官节律当动物暴露在情绪挑战和变化的生活环境。在一般实验中, 来自不同器官的信号, 如大脑和心脏, 是由独立的记录系统记录的, 需要多个记录设备和处理数据文件的不同程序。本研究描述了一种新的方法, 可以同时监测电 biosignals, 包括在多个脑区的局部场电位, 代表心脏节律的心电图, electromyograms 代表清醒/睡眠相关的肌肉收缩, 呼吸信号, 在一个自由移动的老鼠。这种方法的记录配置是基于一个传统的微驱动器阵列, 用于皮层局部场电位记录, 其中有数以万计的电极, 并且从这些电极获得的信号被集成到单个电板安装在动物的头上。在这里, 这个录音系统得到了改进, 使外围器官的信号也被转移到一个电子接口板上。在单个手术中, 电极首先分别植入适当的身体部位和靶脑区。所有这些电极的开端, 然后焊接到在动物的头部以上的电气板的个别通道, 以便所有的信号可以集成到单一的电路板。将此主板连接到记录设备, 可以将所有信号收集到单个设备中, 从而降低了实验成本, 简化了数据处理, 因为所有数据都可以在同一数据文件中处理。这项技术将有助于了解中央和外围器官之间的神经关联。
Introduction
中枢神经系统控制身体状态以应对各种环境变化, 这种控制通常表现为心率、呼吸率和肌肉收缩的变化。然而, 很少有研究证实了这种外围生理因素与皮质活动有什么关联。为解决这一问题, 有必要从中央和外围组织监测电 biosignals 的大规模记录方法。在大脑皮层 , 局部场电位 ( LFP ) 信号入到皮质组织中的电极记录 extracellularly1,2,3。为了同时记录来自小哺乳动物 (如大鼠和小鼠) 皮质区域的多个 LFP 信号, 许多研究开发出了各种类型的定制电极组件, 称为微驱动器。传统的微驱动器由连接到电极中间部分的金属螺钉 (通常是 tetrodes), 一个容纳螺钉和电极的核心机构, 以及一个可容纳金属孔的电子接口板 (EIB) 来连接电极的打开端 (图 1、图 2和图 3)。这种电极组件使操作者能够控制在数天到数周内插入大脑的许多电极的深度, 并允许进行长期的神经元活动记录, 因为动物受到各种行为任务。在外围器官中, 心跳信号被植入在心脏区域或周围的一对电极上 (心电图), 在4,5,6, 和骨骼肌肉信号被记录作为 electromyograms (EMGs) 与插入到肌肉组织的电极7,8,9。用单单位录制10、11, 研究了嗅球电信号与呼吸 (BR) 节律之间的关系。在传统的记录系统中, 来自不同组织的这些信号被独立的记录装置捕获, 这意味着需要额外的实验系统来精确同步这些多台设备, 同时脑体信号的录音。这一制度是为了克服这一问题而制定的。在该系统中, 所有从外围器官记录的电信号, 包括心电图、EMGs 和反映呼吸节律的嗅球发出的电信号, 都集成到单个微驱动器阵列1,2 ,3, 这里称为一个集成的微驱动器阵列。该系统只需要一个多通道记录设备, 适用于任何常规的微驱动器阵列。这种技术的优点是它不需要任何特殊的设备或触发信号来匹配多个设备的记录时间, 而且它允许更方便的数据处理, 因为所有的信号都被记录为类似的数据类型。这项技术将有助于了解中央和外围器官之间的神经关联。本文介绍了与该技术相关的程序, 并给出了从大鼠获得的代表性数据集。
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Protocol
所有涉及动物的程序都是根据 NIH 的动物保护和使用指南进行的。
1. 集成微驱动器阵列的研制
- 为皮质 LFP 录制创建微驱动器阵列, 如其他地方所述1,2,3。在电极接口板 (EIB) 上留出至少6个金属孔, 用于心电图/肌电图/BR 通道, 如1.2 所述, 连接到 bioflex 线。
- 将 bioflex 线切成6片, 长度为5.0 厘米. 剥去聚四氟乙烯 (PTFE) 涂布两端的所有金属丝件, 长度为5.0 毫米. 将每个金属丝件的一端连接到一个打开的金属孔 (ECG/肌电信号/BR 通道) 上。 有金别针的欧洲投资银行。
- 将搪瓷线切成两5.0 厘米的碎片。焊锡每根导线的一端到欧洲投资银行的地面/参考 (g/r) 通道上 (图 3, 另请参阅以前的论文12,13)。
- 为制备心电图电极, 将 bioflex 线切成两个16厘米的片。将这些金属丝片两端的聚四氟乙烯涂层剥离在一端 (短端) 的长度为5.0 毫米, 另一端为15毫米 (长尾)。
- 形成一个直径为2.0 毫米的钢丝圈, 弯曲长尾线, 并通过焊接固定环的形状。
- 为制备肌电图电极, 将 bioflex 线切成2片, 长度为8厘米. 从这些金属丝件两端剥离聚四氟乙烯涂层, 长度为5.0 毫米。
- 为制备 BR 电极, 将 bioflex 线切割成2件, 长度为6.0 厘米. 剥离这些金属丝件两端的搪瓷涂层, 长度为5.0 毫米. 每根焊丝的一端焊在不锈钢螺钉的头上 (阀杆直径米: 1.0 毫米, 茎长: 4.0 毫米)。
- 为制备接地/参考 (gr) 电极, 将搪瓷丝切成2片, 长度为6.0 厘米. 剥去这些金属丝件两端的搪瓷涂层, 长度为5.0 毫米. 焊料的每一个一端的这些电线件的头一个不锈钢 st鳗鱼螺杆 (茎直径: 1.4 毫米, 茎长: 3.0 毫米)。
- 气体杀菌所有电极和不锈钢螺丝, 并保持在一个干净的空间。
2. 心电图/肌电图电极植入术
注: 使用灭菌手套和蒸压器具进行无菌技术的所有手术步骤。对于所有的步骤涉及创建切口, 消毒皮肤与70% 乙醇之前, 并覆盖切口与手术窗帘。
- 固定在一个扁平的热垫上的麻醉 (1.0-3.0% 异氟烷气体) 鼠背部。给丁丙诺啡止痛。将兽医软膏放在老鼠的眼睛上, 防止干燥。使用 betadine 清洁皮肤表面。
- 在内侧胸区切开2.0 厘米。通过分离胸肌来暴露肋间肌肉。将心电图电极的环缝合至肋间肌。
- 把动物的胃固定在热垫上。在背颈区域做一个1.0 厘米的切口。
- 插入心电图电极皮下通过胸部切口。将两端滑动到背颈区域, 从颈部切口拉出。缝合胸部切口。
- 将每一个肌电图电极的一端插入到长度为2.0 厘米的颈部切口。通过缝合将肌电信号电极固定在颈部肌肉上。
3. 集成微驱动器阵列和 BR 电极的植入
- 把老鼠固定在一个立体定位装置上。沿着中线从眼睛到颈部区域, 在头上做一个3.0 厘米的切口。揭露头骨
- 使两个圆形开颅直径 0.7-1.0 毫米以上的嗅球11.0 毫米前和1毫米双边 bregma 与高速演习。在头骨中植入两个 BR 电极, 直到螺钉茎的尖端附着在脑表面。
- 使两个圆形开颅直径 0.7-1.0 毫米以上的额叶2.7 毫米前和2.7 毫米双边到 bregma。将两个克/r 电极植入头骨, 直到螺钉茎尖端附着在脑表面。
- 使六到八孔直径1.0 毫米的区域周围的大开颅手术。植入锚螺钉 (茎直径: 1.4 毫米, 茎长: 3.0 毫米) 在头骨。
- 做一个大圆形开颅手术, 直径为2.0 毫米以上的海马3.8 毫米后, 2.5 毫米双边到 bregma。放置集成的微驱动器阵列, 使驱动器阵列的套管尖端位于大型开颅手术上方。
- 用100µL 两种溶液, 即 0.5% (按质量) 海藻酸钠和 10% (按质量) 氯化钙, 填补套管尖端与脑表面之间的间隙空间.
注: 这一过程形成一个透明凝胶在〜5分钟后, 两个解决方案是混合在头骨上。 - 覆盖套管, BR 电极, g-/r 电极, 和锚螺钉与牙科水泥的厚度为0.5 厘米. 小心不要在这个步骤中用水泥覆盖 BR 和 g-/r 电极的开端。
- 将心电图、肌电图、BR 和 g-/r 电极的开端焊接到以前连接到欧洲投资银行的个别导线提示上 (见步骤1.2 和 1.3)。
- 覆盖底部的集成微驱动器阵列, 和所有电极线, 与牙科水泥。确保所有电极线均为完全覆盖, 以便大鼠在植入后无法将其刮出。
- 在恢复足够的意识, 以保持胸骨卧床, 返回的动物到其透明的有机玻璃家庭 cag, 并保持它自己的自由获得水和食物。手术后, 用抗生素 (庆大霉素) 治疗动物。
- 手术后, 每天观察动物。检查它们是否正常行走, 当实验者接触到微驱动器阵列时, 它们不会吱吱响。
4.体内记录
注: 所有信号都放大, 采样在2赫, 带通滤波 (0.1-500 Hz), 除了单位活动 (取样在30赫和带通过滤 (500-6 赫))。
- 将集成的微驱动器阵列的 EIB 连接到记录设备的 headstage。
- 在手术后的几周内拧紧螺钉, 以提高 tetrodes。一旦 tetrodes 与目标大脑区域相邻, 在数天的时间内将 tetrodes 固定在区域内, 以便稳定记录。
- 当动物在录音室中自由移动时, 监控电信号。
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Representative Results
这种方法可以同时捕获来自多个器官的生物电信号, 这些信号代表大脑的神经元活动, 心率, 呼吸节律和骨骼肌收缩(图 1)。图 4提供了可自由移动的大鼠在矩形框 (25 x 40 厘米2) 中自由觅食的具有代表性的记录数据。示例数据集包括移动和静止状态之间的典型行为转换。用小波分析方法从海马 LFP 跟踪计算出功率谱。从嗅球的表面积记录的 BR 信号用于粗略估计呼吸频率的相对变化, 例如在探索性嗅探行为过程中发生的。
图 1: 用于监视来自自由移动的大鼠的多个脑体信号的记录系统的说明.所有的生物电信号 (LFP, 心电图, 脑电图, BR 信号) 从一个自由移动的鼠被收集到集成 microdrive 阵列安装在头部。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 集成的微驱动器阵列.所有的 LFP, 心电图, 脑电图和 BR 信号都被传送到欧洲投资银行的孔上, 如箭头所示。在右面板中, 虚线区域被放大, 显示了插入到脑组织中的微驱动器阵列中突出的 tetrodes。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 欧洲投资银行的顶级视图.欧洲投资银行包括24个皮质 LFP (LFP) 通道, 连接到 tetrodes、2心电图通道、2个肌电信号通道、2 BR 通道和2地面 (Gr) 通道。除 LFP 通道外的所有通道都连接到绝缘导线上。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 生物电信号同时多通道记录的一个例子.
(从上到下)LFP 信号在体感皮层 (鳞片杆: 250 µV)。LFP 信号在海马 CA1 区域 (鳞片酒吧: 500 µV)。海马 LFP 迹的彩色编码功率谱。心电图信号 (带通滤波在 20-200 Hz, 刻度条: 500 µV)。肌电信号 (带通滤波在 100-500 Hz, 刻度条: 100 µV)。BR 信号 (刻度条: 500 µV)。BR 信号的一种颜色编码的功率谱, 它指示呼吸速率的瞬态增加所定义的嗅探行为。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
为了了解大脑如何调节外围活动水平, 反之亦然, 大规模的记录方法同时捕获多体区域的电 biosignals 是必要的。这项研究描述了一个手术程序, 一个记录系统, 监测大脑局部磁场电位, 心率, 肌肉结构的大小和呼吸率, 已经改善了记录系统, 用于脑组织中的细胞外记录。该系统在集成的微驱动器阵列上收集来自大脑和外围器官的电信号到单一的 EIB 上。综合微驱动器阵列的制备应在手术前至少几个小时启动, 因为需要一段时间。在这里, 驱动器阵列包括用于记录大脑局部场电位的 tetrodes, 但如果这些电极的两端经过适当的焊接, 则可以将其他类型的金属电极 (如铂和钨电极) 连接到欧洲投资银行。在《议定书》的手术过程中, 经验丰富的实验者能够在2-3 小时内完成所有程序。
这个协议中的一个关键步骤是电极在组织上的定位, 特别是心电图和肌电图电极。为了获得稳定的记录, 可能需要多次训练重复。到目前为止, 所有录音都在手术后至少一个月内稳定下来。实验者应该注意到, 如果记录数据的信噪比变得很低, 这个问题经常是由于地面/参考电极的松散固定, 或者 EIBs 或另一端的电线两端的焊接不足。电线.与传统的电生理记录相比, 使用一些独立的装置, 这种方法的优点是 (1) 它是技术上简单的行为, 如果训练多次, (2) 它不需要通信系统同步多个设备 (3) 它降低了总体实验成本, 因为只需要一个记录设备, (4) 所有记录的数据文件都可以通过相同的处理方法和程序进行处理, 从而提高了数据分析的效率。此外, 方法学概念适用于多种脑区和外围器官的多种组合, 包括呼吸系统、循环系统和自主神经系统。它也适用于任何商业上可用的电子记录装置。使用这种方法同时监测系统生理活动模式将有助于阐明各种生理状态下的神经元活动模式, 以应对情绪挑战、外在感官调节和病理疾病, 导致更多的理解的生物机制的基础上的大脑-身体协会。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 Kaken (17H05939; 17H05551)、臣基金会和 Suzuken 纪念基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FEP Hookup Wire Stranded Stainless Steel | Cooner Wire Company, Chatsworth, CA | AS 633 | Bioflex wire |
| EIB-36-PTB | Neuralynx, Inc., Bozeman, MT | EIB-36-PTB | EIB |
| Cereplex M | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Digital headstage | |
| Cereplex Direct | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Data acquisition system | |
| UEW polyurethane magnet wire | Oyaide.com, Tokyo, Japan | UEW 0.14mm 20m | Enamel wire |
| SD-102 | Narishige, Tokyo, Japan | SD-102 | High-speed drill |
| Minimo ONE SERIES ver.2 | Minitor Co.,Ltd, Tokyo, Japan | C2012 | High-peed drill Power Supply |
| Provinice 250 mL | Shofu Inc., Kyoto, Japan | 213620136 | Dental cement |
| Small Animal Anesthetizer | Biomachinery, Chiba, Japan | TK-7 | Anesthetizer |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B7536-1ML | Analgesic |
| Isoflurane | DS Pharma Animal Health, Osaka, Japan | Isoflu 250mL | |
| Vaseline, White | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 224-00165 | Vet ointment |
| Sodium alginate | Nacalai tesque, Kyoto, Japan | 31131-85 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 031-00435 | |
| Stainless steel screw M1.0×4.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617504 | Stainless steel screw for BR electrodes |
| Stainless steel screw M1.4×3.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617687 | Stainless steel screw for g/r electrodes and anchors |
References
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