Summary
Este estudio presenta un método para la grabación simultánea de potenciales de campo local en el cerebro, electrocardiogramas, electromyograms y respirar las señales de una rata libremente móvil. Esta técnica, que reduce los costos experimentales y simplifica el análisis de datos, contribuye a la comprensión de las interacciones entre el cerebro y órganos periféricos.
Abstract
Monitoreo de la dinámica fisiológica del cerebro y tejidos periféricos es necesario para abordar una serie de preguntas acerca de cómo los controles del cerebro cuerpo funciones y órganos internos ritmos cuando los animales están expuestos a desafíos emocionales y cambios en su condiciones de vida. En general los experimentos, las señales de diferentes órganos, como el cerebro y el corazón, son registrados por sistemas de grabación independientes que requieren múltiples dispositivos de grabación y diferentes procedimientos para el procesamiento de los archivos de datos. Este estudio describe un nuevo método que puede controlar simultáneamente Bioseñales eléctricas, incluyendo decenas de potenciales de campo locales en varias regiones del cerebro, electrocardiogramas que representan el ritmo cardíaco, electromyograms que representan despierto / contracción muscular relacionados con el sueño y señales, en una rata libremente móvil de respiración. La configuración de la grabación de este método se basa en una matriz de micro-unidades convencional para grabaciones potencial del campo local cortical en el que se acomodan decenas de electrodos, y las señales obtenidas de estos electrodos están integradas en un solo cuadro eléctrico montado en la cabeza del animal. Aquí, este sistema de grabación fue mejorado para que las señales de los órganos periféricos también se transfieren a una placa de interfaz eléctrico. En una sola cirugía, electrodos por separado primero se implantan en las partes apropiadas del cuerpo y las zonas cerebrales. Los extremos abiertos de todos los electrodos entonces se sueldan a los canales individuales de la Junta eléctrica encima de la cabeza del animal para que todas las señales pueden ser integrados en la placa eléctrica única. La colección de todas las señales en un solo dispositivo, que reduce los costos experimentales y simplifica el procesamiento de datos, porque todos los datos pueden ser manejados en el mismo archivo de datos permite conectar esta tarjeta a un dispositivo de grabación. Esta técnica ayudará a la comprensión de los correlatos neurofisiológicos de las asociaciones entre órganos centrales y periféricos.
Introduction
El sistema nervioso central controla Estados del cuerpo en respuesta a cambios ambientales varios, y este control se representa típicamente como cambios en la frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria y contracciones musculares. Sin embargo, pocos estudios han probado cómo tales factores fisiológicos periféricos están asociados con la actividad cortical. Para solucionar este problema, es necesario un método de grabación a gran escala para el monitoreo de Bioseñales eléctricas de los tejidos centrales y periféricos. En la corteza cerebral, las señales (LFP) del potencial de campo local extracelularmente son registradas por electrodos que se insertan en los tejidos corticales1,2,3. Para registrar simultáneamente varias señales de la LFP de las regiones corticales de pequeños mamíferos, como ratas y ratones, un número de estudios ha desarrollado varios tipos de montajes de electrodo a medida que se llaman micro-unidades. Una impulsión micro convencional se compone de tornillos metálicos conectados a las zonas centrales de los electrodos (que son típicamente tetrodos), un cuerpo que se adapta a los tornillos y los electrodos y una placa de interfaz eléctrico (BEI) para agujeros de metal para Conecte los extremos abiertos de los electrodos (figura 1, figura 2y figura 3). Este electrodo permite al operador controlar la profundidad de muchos electrodos insertados en el cerebro en el transcurso de días a semanas y permite la realización de grabaciones crónica a largo plazo de la actividad neuronal como el animal es desafiado con varios tareas conductuales. En los órganos periféricos, las señales de los latidos del corazón se registran como electrocardiogramas (ECGs) por un par de electrodos que se implantan en o alrededor del corazón área4,5,6, y se registran señales de músculo esquelético como los electromyograms (EMGs) con electrodos se insertan en el músculo tejido7,8,9. Se ha estudiado la relación entre las señales eléctricas del bulbo olfativo y ritmo de respiración (BR) con sola unidad grabaciones10,11. En sistemas de grabación convencional, estas señales de diferentes tejidos han sido capturadas por los dispositivos de grabación independientes, lo que significa que un sistema experimental adicional se requiere para sincronizar precisamente estos dispositivos múltiples para simultánea grabaciones de las señales del cerebro del cuerpo. Este sistema fue desarrollado para resolver este problema. En este sistema, todas las señales eléctricas grabadas desde los órganos periféricos, incluyendo ECG, EMGs y las señales eléctricas desde el bulbo olfatorio que reflejan el ritmo de la respiración, se integran en una sola unidad de micro matriz1,2 ,3, aquí denominado matriz micro unidad integradora. Este sistema requiere solamente un dispositivo de grabación de varios canales y es aplicable a cualquier matriz micro-unidades convencional. Las ventajas de esta técnica son que no requieren dispositivos especiales ni señales de disparo para que coincida con el tiempo de grabación de múltiples dispositivos, y permite más conveniente tratamiento de datos, ya que todas las señales se registran como tipos de datos similares. Esta técnica ayudará a la comprensión de los correlatos neurofisiológicos de las asociaciones entre órganos centrales y periféricos. Este artículo describe los procedimientos asociados a la técnica y presenta conjuntos de datos representativos de una rata.
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Protocol
Todos los procedimientos con sujetos animales fueron realizados según las directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales.
1. preparación de la matriz de impulsión Micro Integrativa
- Crear una matriz de micro-unidades para grabaciones de LFP corticales como se describe en otra parte1,2,3. Deja al menos 6 agujeros metálicos abiertos en un tablero del interfaz del electrodo (BEI) para uso como canales de ECG/EMG/BR que están conectados a los cables de bioflex como se describe en 1.2.
- Cortar un alambre de bioflex en 6 piezas con longitudes de 5,0 cm. cáscara de politetrafluoroetileno (PTFE) capa de ambos extremos de las piezas de alambre con longitudes de ~5.0 mm. Conecte un extremo de cada una de las piezas de alambre a uno de los orificios metálicos abiertos (canales de ECG/EMG/BR) en el BEI con un alfiler de oro.
- Cortar un alambre de esmalte en dos piezas de 5,0 cm. Soldar un extremo de cada uno de estos cables a los canales de tierra de referencia (g/r) en el BEI (figura 3, véase también anteriores papeles12,13).
- Para la preparación de los electrodos de ECG, cortar un alambre de bioflex en dos piezas de 16 cm. Pele el recubrimiento de PTFE de los extremos de estas piezas de alambre en las longitudes de ~5.0 mm en un extremo (lado corto) y ~ 15 m m en el otro extremo (extremo más largo).
- Formar un anillo de alambre con un diámetro de 2,0 mm doblando el extremo largo del cable, y la forma del anillo de fijación por soldadura.
- Para la preparación de los electrodos de EMG, corte un cable de bioflex en 2 piezas con longitudes de 8 cm. pele apagado la capa de PTFE desde ambos extremos de estas piezas de alambre con longitudes de ~5.0 mm.
- Para la preparación de los electrodos de la BR, corte un cable de bioflex en 2 piezas con longitudes de 6,0 cm. pele apagado la capa de esmalte de ambos extremos de estas piezas de alambre con longitudes de ~5.0 mm soldar un extremo de cada una de estas piezas de alambre a la cabeza de un tornillo de acero inoxidable (dia de la madre metro: 1.0 mm, la longitud del tallo: 4.0m m).
- Para la preparación de los electrodos de tierra de referencia (gr), cortar un alambre de esmalte en 2 piezas con longitudes de 6,0 cm. pele apagado la capa de esmalte de ambos extremos de estas piezas de alambre con longitudes de ~5.0 mm. soldar un extremo de cada una de estas piezas de alambre a la cabeza de un acero inoxidable-st EEl tornillo (diámetro del tallo: 1.4 mm, la longitud del tallo: 3,0 mm).
- Gas esterilizar todos los electrodos y tornillos de acero inoxidable y mantener estas en un espacio limpio.
2. implantación de los electrodos de ECG/EMG
Nota: Realice todos los pasos quirúrgicos con técnica aséptica, uso de guantes esterilizados y esterilizados instrumentos. Para todos los pasos que implica la creación de una incisión, esteriliza la piel con etanol al 70% antes y cubrir la incisión con cortinas quirúrgicas.
- Fijar un anestesiado rata (1.0-3.0% isoflurano gas) sobre su espalda sobre un cojín plano del calor. Dar la buprenorfina como analgésico. Colocar ungüento veterinario en ojos de rata para evitar la sequedad. Uso de clorhexidina para limpiar la superficie de la piel.
- Hacer una incisión de ~2.0 cm en la zona medial del tórax. Exponer los músculos intercostales separando los músculos del pecho. Los anillos de los electrodos de ECG a los músculos intercostales de la sutura.
- Fijar el estómago del animal en el cojín del calor. Hacer una incisión de ~1.0 cm en la zona dorsal del cuello.
- Inserte los electrodos de ECG por vía subcutánea a través de la incisión del pecho. Deslice los extremos a la zona dorsal del cuello y tire de ellas hacia fuera de la incisión en el cuello. Sutura de la incisión del pecho.
- Introduzca un extremo de cada uno de los electrodos de EMG por vía subcutánea a una longitud de ~2.0 cm a través de la incisión en el cuello. Fije los electrodos de EMG para el músculo del cuello por la sutura.
3. implantación de la matriz de impulsión Micro integrativa y los electrodos de BR
- Fijar la rata en un dispositivo estereotáxicas. Hacer una incisión de ~3.0 cm en la cabeza a lo largo de la línea media desde el punto entre los ojos a la zona del cuello. Exponer el cráneo.
- Realizar dos craneotomías circular con un diámetro de 0.7-1.0 mm por encima del bulbo olfatorio anterior 11,0 mm y 1 mm bilateral en vértice con un taladro de alta velocidad. Implantar dos electrodos de BR en el cráneo hasta que las puntas de los tallos de tornillo se unen a la superficie del cerebro.
- Hacer dos craneotomías circular con un diámetro de 0.7-1.0 mm por encima de la corteza frontal anterior 2,7 mm y 2,7 mm bilateral a bregma. Implantar dos electrodos g/r en el cráneo hasta la punta de la espiga del tornillo se une a la superficie del cerebro.
- Hacer seis a ocho agujeros con un diámetro de 1,0 mm en los alrededores de la craneotomía grande. Tornillos de anclaje del implante (diámetro del tallo: 1.4 mm, la longitud del tallo: 3.0m m) en el cráneo.
- Hacer una craneotomía grande circular con un diámetro de ~2.0 mm sobre el hipocampo posterior 3,8 mm y 2,5 mm bilateral a bregma. Colocar la matriz integradora de impulsión micro, tal que la punta de la cánula de la matriz de impulsión se encuentra por encima de la craneotomía grande
- Llenar el espacio vacío entre la punta de la cánula y la superficie del cerebro con ~ 100 μl de dos soluciones, es decir., 0.5% (por masa) alginato de sodio y cloruro de calcio 10% (en masa).
Nota: Este proceso forma un gel transparente en ~ 5 min, después de las dos soluciones se mezclan en el cráneo. - Cubierta de la cánula, electrodos de BR, electrodos g/r, y tornillos de anclaje con cemento dental con un espesor de 0,5 cm. ser cuidado de no cubrir los extremos abiertos de BR y g/r los electrodos con el cemento en este paso.
- La soldadura de los extremos abiertos de los electrodos de ECG, EMG, BR y g/r a las puntas de cables individuales que estaban conectados anteriormente al EIB (véase los pasos 1.2 y 1.3).
- Cubrir la parte inferior de la matriz integradora de impulsión micro y todos los cables de electrodo, con cemento dental. Asegúrese de que todos los cables de electrodo completamente cubierto para que la rata no puede rayarles hacia fuera después de la implantación.
- Después de recuperar la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal, devolver el animal a su cag Casa transparente de plexiglás y mantener por cuenta propia con acceso a agua y alimentos. Después de la cirugía, tratar al animal con antibióticos (gentamicina).
- Después de la cirugía, seguimiento de los animales con observación diaria. Compruebe que caminan correctamente, y que no crujan cuando el experimentador toca la matriz de impulsión micro.
4. grabaciones en Vivo
Nota: Todas las señales se amplifican, muestreada en 2 kHz y las banda-pass filtrada (0.1 - 500 Hz) excepto para las actividades de la unidad (band-pass filtrada (500-6 kHz) y muestra a 30 kHz).
- Conecte el BEI de la matriz de impulsión micro Integrativa a la headstage de un dispositivo de grabación.
- Avanzar los tetrodos girando los tornillos durante unas semanas después de la cirugía. Una vez que los tetrodos son adyacentes a las zonas cerebrales, se instalan los tetrodos en las áreas durante un período de varios días de grabaciones estables.
- Controlar las señales eléctricas mientras que el animal se mueve libremente en una cámara de grabación.
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Representative Results
Este método puede capturar simultáneamente señales bioeléctricas de múltiples órganos que representan la actividad neuronal del cerebro, pulso, ritmo de respiración, contracciones del músculo esquelético (figura 1). Figura 4 proporciona datos representativos de la grabación de una rata libremente móvil que fue alimentándose libremente en una caja rectangular (25 x 40 cm2). El conjunto de datos de ejemplo incluye transiciones comportamiento típico entre movimiento y descanso los Estados. Un espectro de energía se calcula de un rastro LFP hippocampal análisis wavelet. La señal de BR grabada de la superficie del bulbo olfativo se utilizó para estimar aproximadamente los cambios relativos en las frecuencias, como los que ocurren durante la conducta exploratoria de inhalación de la respiración.
Figura 1 : Ilustración del sistema de grabación para múltiples cerebro-órgano de vigilancia de las señales de una rata libremente móvil. Todas las señales bioeléctricas (LFP, las señales ECG, EEG, BR) de una rata libremente móvil se recogen en la matriz integradora microdrive montada en la cabeza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Una matriz de micro unidad Integrativa. Todos LFP, ECG, EEG y BR las señales son transmitidas a los agujeros en el BEI como indicado por las flechas. El área punteado se magnifica en el panel derecho y muestra algunos de los tetrodos que sobresalen de la matriz de impulsión micro que se insertan en el tejido cerebral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Una vista superior del BEI. El BEI incluye 24 canales corticales de LFP (LFP) que están conectados a los tetrodos, 2 canales de ECG, 2 canales de EMG, 2 canales de BR y 2 canales de suelo (Gr). Todos los canales excepto los canales de la LFP se conectaron a cables aislados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Un ejemplo de la grabación de varios canales simultáneo de señales bioeléctricas.
(De arriba a abajo) Las señales de la LFP en la corteza somatosensorial (barra de escala: 250 μV). Las señales de la LFP en la región CA1 hipocampal (barra de escala: 500 μV). Un espectro de energía color-coded de la traza hippocampal de la LFP. Una señal de ECG (band-pass filtrada a 20-200 Hz, barra de escala: 500 μV). Una señal EMG (banda-pass filtrada a 100-500 Hz, barra de escala: 100 μV). Una señal de BR (barra de escala: 500 μV). Un espectro de color-coded de la potencia de la señal de BR indica esnifar comportamiento tal como se define por un aumento transitorio en la tasa de respiración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para entender cómo el cerebro modula los niveles de actividad periférica y vice versa, métodos para capturar simultáneamente Bioseñales eléctricas en varias partes del cuerpo de grabación a gran escala son necesarios. Este estudio describe un procedimiento quirúrgico y un sistema de grabación para el monitoreo de potenciales de campo local cerebral, ritmo cardiaco, la magnitud de la construcción de músculo y tasas respiratorias, que han sido mejoradas en un sistema de grabación que se utiliza para registros extracelulares en el tejido cerebral. Este sistema recoge las señales eléctricas desde el cerebro y los órganos periféricos en un BEI solo en una matriz de micro unidad integradora. La preparación de la matriz de impulsión micro integradora debe iniciarse al menos varias horas antes de la cirugía, ya que toma algún tiempo. Aquí, la matriz de unidad incluye tetrodos para la grabación de potenciales de campo local del cerebro, pero los otros tipos de electrodos de metal, tales como electrodos de platino y tungsteno, pueden acoplarse al EIB si los extremos de estos electrodos se sueldan correctamente. Al seguir los procedimientos quirúrgicos en el protocolo, experiencia experimentadores han podido completar todos los procedimientos dentro de 2-3 h.
Un paso crítico dentro de este protocolo es la colocación de los electrodos sobre el tejido, especialmente para los electrodos de ECG y EMG. Varias repeticiones de entrenamiento podrían ser necesario obtener grabaciones estables. Hasta la fecha, todas las grabaciones han sido estables por lo menos un mes después de la cirugía. Los experimentadores deben tener en cuenta que, si los cocientes signal-to-noise de los datos grabados se convierte en baja, el problema es con frecuencia debido a fijaciones sueltas de los electrodos de tierra de referencia, o falta de soldadura de los extremos de los cables entre el EIBs o los otros extremos de cables. Comparado con una convencional grabación electrofisiológica usando algunos dispositivos independientes, las ventajas de este método son que (1) es técnicamente fácil de realizar, si entrena varias veces, (2) no requiere un sistema de comunicación para sincronizar múltiples dispositivos, (3) reduce los costos en general experimentales, como sólo un dispositivo de grabación, y (4) todo grabado archivos pueden ser manejados por el programa, que aumenta la eficacia del análisis de datos y el mismo método de procesamiento de datos. Además, el concepto metodológico es aplicable a muchas combinaciones de múltiples regiones del cerebro y de órganos periféricos, incluyendo el sistema respiratorio, sistema circulatorio y sistema nervioso autónomo. También es aplicable a cualquier aparato eléctrico disponible en el mercado de la grabación. Seguimiento de patrones de actividad fisiológica sistémica simultánea utilizando este método será útil en la aclaración de los patrones de actividad neuronal en diversos estados fisiológicos contra desafíos emocionales, modulación sensorial externa y patológicas enfermedades, que llevan a una mayor comprensión de los mecanismos biológicos subyacentes a la Asociación cerebro-cuerpo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por Kaken-Hola (17 H 05939; 17 H 05551), la Fundación de Nakatomi y la Fundación Memorial de Suzuken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FEP Hookup Wire Stranded Stainless Steel | Cooner Wire Company, Chatsworth, CA | AS 633 | Bioflex wire |
| EIB-36-PTB | Neuralynx, Inc., Bozeman, MT | EIB-36-PTB | EIB |
| Cereplex M | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Digital headstage | |
| Cereplex Direct | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Data acquisition system | |
| UEW polyurethane magnet wire | Oyaide.com, Tokyo, Japan | UEW 0.14mm 20m | Enamel wire |
| SD-102 | Narishige, Tokyo, Japan | SD-102 | High-speed drill |
| Minimo ONE SERIES ver.2 | Minitor Co.,Ltd, Tokyo, Japan | C2012 | High-peed drill Power Supply |
| Provinice 250 mL | Shofu Inc., Kyoto, Japan | 213620136 | Dental cement |
| Small Animal Anesthetizer | Biomachinery, Chiba, Japan | TK-7 | Anesthetizer |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B7536-1ML | Analgesic |
| Isoflurane | DS Pharma Animal Health, Osaka, Japan | Isoflu 250mL | |
| Vaseline, White | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 224-00165 | Vet ointment |
| Sodium alginate | Nacalai tesque, Kyoto, Japan | 31131-85 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 031-00435 | |
| Stainless steel screw M1.0×4.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617504 | Stainless steel screw for BR electrodes |
| Stainless steel screw M1.4×3.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617687 | Stainless steel screw for g/r electrodes and anchors |
References
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