Summary
Denna studie införs en metod för samtidig inspelning av lokala fältet potentialer i hjärnan, elektrokardiogram, electromyograms, och andas signaler på en fritt rörliga råtta. Denna teknik, som minskar experimentella kostnaderna och förenklar analysen av data, kommer att bidra till förståelse av samspelet mellan hjärnan och perifera organ.
Abstract
Övervakning fysiologiska dynamiken i hjärnan och perifera vävnader är nödvändig för att ta itu med ett antal frågor om hur kontrollerna hjärnan kroppen funktioner och inre organ rytmer när djur utsätts för känslomässiga utmaningar och förändringar i deras levande miljöer. I allmänhet är experiment, signaler från olika organ, exempelvis hjärnan och hjärtat, inspelade av oberoende inspelning system som kräver flera inspelningsutrustning och olika förfaranden för bearbetning av datafilerna. Denna studie beskriver en ny metod som kan samtidigt övervaka elektriska biosignaler, inklusive tiotusentals lokala fältet potentialer i flera hjärnregioner, elektrokardiogram som representerar hjärtrytmen, electromyograms som representerar vaken / sömn-relaterade muskelkontraktion, och andas signaler, ett fritt rörliga råtta. Inspelning konfigurationen av denna metod är baserad på en konventionell mikro-drive array för kortikala lokala fältet potentiella inspelningar där tiotals elektroder hysas och signalerna från dessa elektroder är integrerade i en enda elektriska styrelsen monterad på djurets huvud. Här, förbättrades denna inspelningssystem så att signaler från de perifera organ överförs också till en elektrisk gränssnittskortet. I en enda operation implanteras först separat elektroder i lämpliga kroppsdelar och hjärnan målområdena. De öppna ändarna på alla dessa elektroder sedan lödas till enskilda kanaler elektriska nämndens ovanför djurets huvud så att alla signalerna som kan integreras i den enda elektriska styrelsen. Ansluta denna styrelse till en inspelningsenhet möjliggör insamling av alla signalerna i en enda enhet, vilket minskar experimentella kostnaderna och förenklar databehandling, eftersom alla data kan hanteras i samma datafilen. Denna teknik kommer att hjälpa förståelsen av de Neurofysiologiska korrelat av anslutningarna mellan centrala och perifera organ.
Introduction
Centrala nervsystemet styr kroppen stater som svar på olika miljöförändringar, och denna kontroll är vanligtvis representeras av förändringar i hjärtfrekvens, andning och muskelsammandragningar. Få studier har dock testat hur perifera fysiologiska faktorer är associerade med kortikal aktivitet. Om du vill åtgärda det här problemet krävs en storskalig inspelning metod för elektriska biosignaler från både centrala och perifera vävnader. I hjärnbarken registreras extracellularly lokala fältet potentiella (LFP) signaler av elektroder som sätts in i det kortikala vävnader1,2,3. För att samtidigt registrera flera LFP signaler från kortikala regioner av små däggdjur, såsom råttor och möss, har ett antal studier utvecklat olika typer av skräddarsydda elektrod sammansättningar som kallas mikro-enheter. En konventionell mikro-enhet består av metall skruvar bifogas de mellersta delarna av elektroderna (som vanligtvis är tetrodes), en core kropp som rymmer skruvar och elektroder och en elektrisk gränssnittskortet (EIB) som rymmer metall hål till Anslut de öppna ändarna på elektroderna (figur 1, figur 2och figur 3). Denna elektrod församling gör att föraren styra djupet av många elektroder infogas i hjärnan under loppet av dagar eller veckor, och att genomförandet av långsiktiga kroniska inspelningar av neuronal aktivitet som djuret utmanas med olika beteendemässiga uppgifter. I perifera organ, hjärtslag signaler bokförs som elektrokardiogram (EKG) av ett par elektroder som implanteras på eller runt hjärtat område4,5,6, och skelettmuskel signaler registreras som electromyograms (EMGs) med elektroder som sätts in i den muskel vävnad7,8,9. Förhållandet mellan elektriskt signalerar av luktbulben och andning (BR) rytm har studerats med enhet recordings10,11. I konventionella inspelning system, har dessa signaler från olika vävnader fångats av oberoende inspelningsenheter, vilket innebär att ytterligare ett experimentella system krävs att just synkronisera dessa flera enheter för samtidiga inspelningar av hjärnan-kroppen signaler. Detta system utvecklades för att lösa detta problem. I detta system integreras alla elektriska signaler som spelats in från de perifera organ, inklusive EKG, EMGs och elektriska signaler från luktbulben som återspeglar andning rytmen, i en enda mikro-drive array1,2 ,3, här kallas en integrativ mikro-drive array. Detta system kräver bara en flerkanalig inspelningsenhet och är tillämplig på alla konventionella mikro-drive array. Fördelarna med denna teknik är att det inte kräver några särskilda anordningar eller utlösa signaler att matcha inspelningstiden för flera enheter, och gör det möjligt för bekvämare databehandling, eftersom alla signalerna registreras som liknande datatyper. Denna teknik kommer att hjälpa förståelsen av de Neurofysiologiska korrelat av anslutningarna mellan centrala och perifera organ. Detta dokument beskriver de förfaranden i samband med tekniken och presenterar representativa datamängder från en råtta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som berör animaliska ämnen utfördes enligt NIH riktlinjerna för skötsel och användning av djur.
1. beredning av integrativ Micro-Drive matrisen
- Skapa en mikro-drive matris för kortikala LFP inspelningar som beskrivs på andra ställen1,2,3. Lämna minst 6 metall hål öppna en elektrod gränssnitt ombord (EIB) för användning som ECG/EMG/BR kanaler som är anslutna till bioflex ledningar som beskrivs i punkt 1.2.
- Skär en bioflex tråd i 6 bitar med längder på 5,0 cm. Peel off polytetrafluoretylen (PTFE) beläggning av båda ändarna av alla tråd bitar med längder av ~5.0 mm. Anslut ena änden av varje tråd bitar till en av de öppna metalliska hål (ECG/EMG/BR kanaler) på den EIB med en guldnål.
- Skär en emalj tråd i två 5.0-cm bitar. Löd fast ena änden av varje av dessa trådar till marken/referens (g/r) kanaler på EIB (figur 3, se också tidigare papper12,13).
- För beredning av EKG-elektroderna, skär en bioflex tråd i två 16-cm bitar. Skrapa av PTFE beläggning av ändarna av dessa tråd bitar på ~5.0 mm i ena änden (korta änden) och ~ 15 mm i den andra ändan (långa änden) längd.
- Bilda en tråd ring med en diameter på 2.0 mm genom att böja den långa änden av tråden, och fastställa formen på ringen genom lödning.
- För beredning av EMG elektroder, skär en bioflex tråd i 2 bitar med längder på 8 cm. Peel off PTFE beläggning från båda ändarna av dessa tråd bitar med längder av ~5.0 mm.
- För beredning av BR elektroder, skär en bioflex tråd i 2 bitar med längder på 6,0 cm. Peel off emaljbeläggning av båda ändarna av dessa tråd bitar med längder av ~5.0 löd mm. ena änden av varje av dessa tråd bitar i huvudet av en rostfria skruv (stem dia mätare: 1,0 mm, hejda längd: 4,0 mm).
- För beredning av marken/referenselektroder (gr), skär en emalj tråd i 2 bitar med längder på 6,0 cm. Peel off emaljbeläggning av båda ändarna av dessa tråd bitar med längder av ~5.0 mm. löd ena änden av varje av dessa tråd bitar i huvudet av en rostfri-st ål skruv (hejda diameter: 1,4 mm, hejda längd: 3.0 mm).
- Gas sterilisera alla elektroder och rostfria skruvar och hålla dessa i ett rent utrymme.
2. implantation av EKG/EMG elektroderna
Obs: Att utföra alla kirurgiska åtgärder med aseptisk teknik med steriliserad handskar och autoklaveras instrument. För alla åtgärder som rör skapandet av ett snitt, sterilisera huden med 70% etanol innan och täcka snitt med operationsdukar.
- Fixa en sövda (1,0-3,0% isofluran gas) råtta på ryggen på en platt hetta madrassera. Ge buprenorfin som ett smärtstillande medel. Placera veterinärmedicinska salva på råttans ögon att förhindra torrhet. Använd betadine för att rengöra ytan av huden.
- Gör ett snitt på ~2.0 cm i mediala bröstet. Utsätta muskulaturen genom att separera bröstmusklerna. Sutur ringar av EKG-elektroderna till muskulaturen.
- Fixa magen av djuret på värme pad. Gör ett snitt på ~1.0 cm i dorsala hals området.
- Infoga EKG-elektroderna subkutant genom bröstet snittet. Skjut i ändarna till dorsala hals området och dra ut dem från hals snittet. Sutur bröstet snittet.
- Sätt i ena änden av varje av EMG elektroderna subkutant till en längd av ~2.0 cm genom halsen snittet. Fixa EMG elektroderna till halsen muskler av suturering.
3. implantation av integrativ Micro-Drive matrisen och BR elektroderna
- Fixa råtta på en stereotaxic enhet. Gör ett snitt på ~3.0 cm på huvudet längs mittlinjen från punkt mellan ögonen till nacken. Exponera skallen.
- Göra två cirkulära craniotomies med diametrar av 0,7-1,0 mm ovanför luktbulben 11,0 mm främre och 1 mm bilaterala bregma med en höghastighets borr. Implantatet två BR elektroder i skallen tills tips av skruv stjälkarna är kopplade till hjärnan ytan.
- Göra två cirkulära craniotomies med diametrar av 0,7-1,0 mm ovanför främre hjärnbarken 2,7 mm främre och 2,7 mm bilaterala bregma. Implantatet två g/r elektroder i skallen tills spetsen av skruv stammen är kopplad till hjärnan ytan.
- Gör sex till åtta hål med diametrar av 1,0 mm i området kring de stora kraniotomi. Implantatet ankare skruvar (hejda diameter: 1,4 mm, hejda längd: 3.0 mm) i skallen.
- Göra en stor cirkulär kraniotomi med en diameter av ~2.0 mm ovanför hippocampus 3,8 mm posteriort och 2,5 mm bilaterala bregma. Placera integrativ mikro-drive matrisen så att arrayen bilresa kanyl spets ligger ovanför den stora kraniotomi
- Fylla gapet utrymmet mellan kanyl och hjärnan ytan med ~ 100 µL av två lösningar, dvs., 0,5% (av massan) natriumalginat och 10% (av massan) kalciumklorid.
Obs: Denna process bildar en transparent gel i ~ 5 min, efter de två lösningarna blandas på skallen. - Täcka kanyl, BR elektroder, g/r elektroder och ankare skruvar med dentala cement med en tjocklek på 0,5 cm. vara noga med att inte täcka de öppna ändarna på BR och g/r elektroder med cement i detta steg.
- Löda de öppna ändarna på EKG, EMG, BR och g/r elektroderna till enskilda tråd tips som tidigare var anslutna till EIB (se stegen 1.2 och 1.3).
- Täcka den nedre delen av matrisen integrativ mikro-enhet och alla elektrod ståltrådar, dentala cement. Säkerställa att alla elektrod kablar är helt täckt så att råttan inte klösa dem efter implantation.
- Efter att återfå tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning, tillbaka djuret till dess transparent Plexiglas hem cag, och hålla det på egen hand med fri tillgång till vatten och mat. Behandla djur med antibiotika (gentamicin) efter operationen.
- Efter operationen, övervaka djuren med daglig observation. Kontrollera att de gå ordentligt, och att de inte gnissla när experimenter vidrör arrayen mikro-drive.
4. in Vivo Recordings
Obs: Alla signaler förstärks, på 2 kHz, och band-passera filtrerade (0,1 - 500 Hz) utom enhet aktiviteter (provtas vid 30 kHz och band-passera filtrerade (500-6 kHz)).
- Anslut EIB i integrativ mikro-drive-matrisen till headstage av en inspelningsenhet.
- Förskott på tetrodes genom att vrida skruvarna för ett par veckor efter operationen. När tetrodes angränsar till hjärnan målområdena, kvitta tetrodes in i områden under en period på flera dagar för stabil inspelningar.
- Övervaka de elektriska signalerna medan djuret rör sig fritt i en inspelning kammare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod kan samtidigt fånga bioelektriska signaler från flera organ som representerar den neuronala aktiviteten i hjärnan, puls, andning rytm och skelettmuskel sammandragningar (figur 1). Figur 4 ger representativa inspelning av data från en fritt rörliga råtta som fritt födosök i en rektangulär låda (25 × 40 cm2). Exempel datamängden innehåller typiska beteende övergångar mellan rörelse och vila stater. En kraftspektrum beräknades från Hippocampus LFP spår av wavelet analys. Den BR signal registreras från ytan av luktbulben användes för att grovt uppskatta de relativa förändringarna i andning frekvenser, till exempel de som uppstår under förberedande sniffning beteende.
Figur 1 : Illustration av inspelningen systemet för övervakning av flera hjärnan-kroppen signaler från ett fritt rörliga råttor. Alla bioelektriska signaler (LFP, EKG, EEG, BR signaler) från en fritt rörliga råtta samlas in i arrayen integrativ-microdrive monterad på huvudet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : En integrativ mikro-drive array. Alla LFP, EKG, EEG och BR signaler överförs till hålen på EIB som anges av pilarna. Det streckade området är förstorat i den högra panelen och visar några av de tetrodes som sticker ut från mikro-drive array som infogas i hjärnvävnaden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : En ovanifrån EIB. EIB har 24 kortikala LFP (LFP) kanaler som är anslutna till tetrodes, 2 ECG kanaler, 2 EMG kanaler, 2 BR kanaler och 2 marken (Gr) kanaler. Alla kanaler utom LFP kanalerna var anslutna till isolerade ledningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Ett exempel på den samtidiga flerkanalig inspelningen av bioelektriska signaler.
(Uppifrån och ner) LFP signaler i somatosensoriska cortex (skalstapeln: 250 µV). LFP signaler i regionen Hippocampus CA1 (skalstapeln: 500 µV). En färgkodad power spectrum av hippocampus LFP spårningen. En EKG-signalen (band-passera filtreras på 20-200 Hz, skalstapeln: 500 µV). En EMG-signal (band-passera filtreras på 100-500 Hz, skalstapeln: 100 µV). En BR-signal (skalstapeln: 500 µV). En färgkodad kraftspektrum av BR signalen som anger att sniffa beteende som definieras av en övergående ökning av andhämtning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att förstå hur hjärnan modulerar perifera aktivitetsnivåer, och vice versa, storskaliga inspelning metoder för att samtidigt fånga elektriska biosignaler från flera organ områden är nödvändiga. Denna studie beskrivs ett kirurgiskt ingrepp, och en inspelningssystem för övervakning av cerebral lokala fältet potentialer, hjärtfrekvens, omfattningen av muskel uppbyggnad och andningsfrekvenser, som har förbättrats på en inspelningssystem som används för extracellulära inspelningar i hjärnvävnaden. Detta system samlar in elektriska signaler från både hjärnan och de perifera organ i en enda EIB på en integrativ mikro-drive array. Beredning av integrativ mikro-drive matrisen bör inledas minst flera timmar före operation, eftersom det tar lite tid. Här arrayen bilresa inkluderar tetrodes för inspelning av hjärnan lokala fältet potential, men andra typer av metall elektroder, såsom platina och volfram elektroder, kan kopplas till EIB om ändarna av dessa elektroder är ordentligt lödda. När du följer de kirurgiska ingrepp i protokollet, har erfarna praktiker kunnat slutföra alla förfaranden inom 2-3 h.
Ett avgörande steg i detta protokoll är placering av elektroderna på vävnad, speciellt för EKG och EMG elektroderna. Flera utbildning upprepningar kan krävas för att erhålla stabil inspelningar. Hittills har har alla inspelningar varit stabil i minst en månad efter operation. Praktiker bör notera att, om de signal-brus-förhållanden av inspelade data blir låga, detta problem beror ofta lös upptagningar av marken/referens elektroderna eller otillräcklig lödning av ändarna på kablarna mellan EIBs eller andra ändar ledningar. Jämfört med en konventionell elektrofysiologiska inspelning med vissa oberoende enheter, är fördelarna med denna metod att (1) det är tekniskt enkelt att genomföra, om utbildade flera gånger, (2) det kräver inte ett kommunikationssystem för att synkronisera flera enheter, (3) det minskar övergripande experimentella kostnaderna, som krävs endast en inspelningsenhet, och (4) alla inspelade data filer kan hanteras av samma bearbetningsmetod och program, vilket ökar effektiviteten i dataanalys. Metodologiska konceptet är dessutom tillämplig på många kombinationer av flera regioner i hjärnan och perifera organ, inklusive andningsorganen, cirkulationssystemet och autonoma nervsystemet. Det är också tillämpliga på alla kommersiellt tillgängliga elektriska inspelningsenhet. Samtidig övervakning av systemisk fysiologiska aktivitetsmönster med denna metod kommer att vara hjälp att belysa neuronal aktivitetsmönster i olika fysiologiska staterna mot känslomässiga utmaningar, yttre sensoriska modulering, och patologiska sjukdomar, som leder till en ökad förståelse för de biologiska mekanismerna bakom föreningen hjärnan-kroppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Kak-Hej 17 H 05939; 17 H 05551, Nakatomi stiftelsen och stiftelsen Suzuken Memorial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FEP Hookup Wire Stranded Stainless Steel | Cooner Wire Company, Chatsworth, CA | AS 633 | Bioflex wire |
| EIB-36-PTB | Neuralynx, Inc., Bozeman, MT | EIB-36-PTB | EIB |
| Cereplex M | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Digital headstage | |
| Cereplex Direct | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Data acquisition system | |
| UEW polyurethane magnet wire | Oyaide.com, Tokyo, Japan | UEW 0.14mm 20m | Enamel wire |
| SD-102 | Narishige, Tokyo, Japan | SD-102 | High-speed drill |
| Minimo ONE SERIES ver.2 | Minitor Co.,Ltd, Tokyo, Japan | C2012 | High-peed drill Power Supply |
| Provinice 250 mL | Shofu Inc., Kyoto, Japan | 213620136 | Dental cement |
| Small Animal Anesthetizer | Biomachinery, Chiba, Japan | TK-7 | Anesthetizer |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B7536-1ML | Analgesic |
| Isoflurane | DS Pharma Animal Health, Osaka, Japan | Isoflu 250mL | |
| Vaseline, White | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 224-00165 | Vet ointment |
| Sodium alginate | Nacalai tesque, Kyoto, Japan | 31131-85 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 031-00435 | |
| Stainless steel screw M1.0×4.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617504 | Stainless steel screw for BR electrodes |
| Stainless steel screw M1.4×3.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617687 | Stainless steel screw for g/r electrodes and anchors |
References
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication. JoVE. (26), e1094 (2009).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (26), e1098 (2009).
- Jog, M. S., et al. Tetrode technology: advances in implantable hardware, neuroimaging, and data analysis techniques. J Neurosci Methods. 117 (2), 141-152 (2002).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nat Protoc. 11 (1), 61-86 (2016).
- Rossi, S., et al. The effect of aging on the specialized conducting system: a telemetry ECG study in rats over a 6 month period. PLoS One. 9 (11), 112697 (2014).
- Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory mice. JoVE. (57), (2011).
- Zeredo, J. L., Kumei, Y., Shibazaki, T., Yoshida, N., Toda, K. Measuring biting behavior induced by acute stress in the rat. Behav Res Methods. 41 (3), 761-764 (2009).
- Young, G. A., Khazan, N. Electromyographic power spectral changes associated with the sleep-awake cycle and with diazepam treatment in the rat. Pharmacol Biochem Be. 19 (4), 715-718 (1983).
- Oishi, Y., et al. Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice. JoVE. (107), e53678 (2016).
- Chaput, M. A. Respiratory-phase-related coding of olfactory information in the olfactory bulb of awake freely-breathing rabbits. Physiol Behav. 36 (2), 319-324 (1986).
- Ravel, N., Pager, J. Respiratory patterning of the rat olfactory bulb unit activity: Nasal versus tracheal breathing. Neurosci Lett. 115 (2-3), 213-218 (1990).
- Okada, S., Igata, H., Sakaguchi, T., Sasaki, T., Ikegaya, Y. A new device for the simultaneous recording of cerebral, cardiac, and muscular electrical activity in freely moving rodents. J Pharmacol Sci. 132 (1), 105-108 (2016).
- Sasaki, T., Nishimura, Y., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Central and Peripheral Bioelectrical Signals in a Freely Moving Rodent. Biol Pharm Bull. 40 (5), 711-715 (2017).
