Summary
Denne studien introduserer en metode for samtidig opptak av lokale feltet potensialer i hjernen, elektrokardiogram, electromyograms, og puste signaler av rotte fritt bevegelige. Denne teknikken, som reduserer eksperimentelle kostnader og forenkler dataanalyse, vil bidra til forståelsen av samspillet mellom hjernen og eksterne organer.
Abstract
Overvåking fysiologiske dynamikken i hjernen og perifere vev er nødvendig for å løse en rekke spørsmål om hvordan hjernen kontrollene body funksjoner og indre organ rytmer når dyrene er utsatt for emosjonelle utfordringer og endringer i deres levende miljøer. Generelt registreres eksperimenter, signaler fra ulike organer, som hjernen og hjertet, av uavhengig opptak systemer som krever flere innspillingsenheter og ulike prosedyrer for behandling av datafilene. Denne studien beskriver en ny metode som kan samtidig overvåke elektriske biosignals, inkludert flere titalls lokale feltet potensialer i flere områder av hjernen, elektrokardiogram som representerer cardiac rytmen, electromyograms som representerer våken / søvn-relaterte muskel sammentrekning, og puster signaler, i en fritt flyttende rotte. Innspillingen konfigurasjonen av denne metoden er basert på en tradisjonell mikro-Disks matrise kortikale lokale feltet potensielle opptak der titalls elektroder innkvarteres, og signaler fra disse elektrodene er integrert i én elektrisk styret montert på at dyret. Her var dette innspillingssystem forbedret slik at signaler fra eksterne organer er overført til en elektrisk grensesnitt bord. I en enkelt operasjon, er elektrodene først separat implantert inn riktig kroppsdeler og hjernen målområder. De åpne endene av alle disse elektrodene er så loddet til individuelle kanaler av elektriske styret over dyrets hodet slik at alle signaler kan integreres enkelt elektrisk styret. Koble dette forumet til en opptaksenhet tillater samlingen av alle signaler i en enkelt enhet, som reduserer eksperimentelle kostnader og forenkler databehandling fordi alle data kan håndteres i samme datafilen. Denne teknikken vil hjelpe forståelsen av nevrofysiologiske korrelerer tilknytningene mellom sentrale og perifere organer.
Introduction
Sentralnervesystemet styrer kroppen stater som svar på ulike miljømessige endringer, og denne kontrollen er representert som endringer i hjertefrekvensen, pustefrekvens og muskelsammentrekninger. Imidlertid har få studier testet hvor slike eksterne fysiologiske faktorene er assosiert med kortikale aktivitet. For å løse dette problemet, kreves en storstilt innspillingen metoden for overvåking elektriske biosignals fra både sentrale og perifere vev. I hjernebarken registrert lokale feltet potensielle (LFP) signaler extracellularly av elektroder som settes inn i kortikale vev1,2,3. Å samtidig spille inn flere LFP signaler fra kortikale regioner av små pattedyr, som rotter og mus, har en rekke studier utviklet ulike typer skreddersydd elektrode samlinger som kalles mikro-stasjoner. En vanlig micro-stasjonen består av metall skruer knyttet til midtre deler av elektrodene (som vanligvis tetrodes), en kjerne kropp som skruer og elektroder og en elektrisk grensesnitt bord (EIB) som passer metall hull koble de åpne endene av elektrodene (figur 1, figur 2og Figur 3). Denne elektrode samlingen gir operatøren å kontrollere dybden av mange elektroder inn hjernen i løpet av dager til uker, og kan gjennomføre langsiktige kronisk opptak neuronal aktivitet som dyret er utfordret med forskjellige atferdsmessige oppgaver. I de eksterne organene, hjerterytme signaler registreres som elektrokardiogram (EKG) av et par elektroder som er implantert på eller rundt hjertet området4,5,6, og skjelettlidelser muskel signaler registreres som electromyograms (EMGs) med elektroder som settes inn i muskel vev7,8,9. Forholdet mellom elektriske signaler av olfactory pære og puste (BR) rytme har studert med enkeltenhet opptak10,11. I konvensjonell opptak systemer, disse signalene fra ulike vev har blitt fanget av uavhengige innspillingsenheter, som betyr at det kreves en eksperimentell tilleggssystemet nettopp synkronisere disse enhetene for samtidig opptak av hjernen-kropp signaler. Dette systemet ble utviklet for å overvinne problemet. I dette systemet, er alle elektriske signaler innspilt fra eksterne organer, inkludert EKG, EMGs og elektriske signaler fra olfactory pære som gjenspeiler puste rytme, integrert i en enkelt mikro-Disks matrise1,2 ,3her kalles en integrerende mikro-Disks matrise. Dette systemet krever bare en flerkanals opptaksenhet, og gjelder for alle konvensjonelle mikro-Disks matrise. Fordelene med denne teknikken er at den ikke krever noen spesielle enheter eller utløse signaler å matche opptakstiden for flere enheter, og det gir for enklere databehandling, siden alle signaler er registrert som tilsvarende datatyper. Denne teknikken vil hjelpe forståelsen av nevrofysiologiske korrelerer tilknytningene mellom sentrale og perifere organer. Dette dokumentet beskriver fremgangsmåtene forbundet med teknikken og presenterer representant datasett fra rotte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr fag ble utført i henhold til NIH retningslinjer og bruk av dyr.
1. utarbeidelse av integrerende mikro-Disks matrise
- Opprette en mikro-Disks matrise kortikale LFP opptak som beskrevet andre steder1,2,3. La minst 6 metall hull åpner på en elektrode grensesnittet styret (EIB) for bruk som ECG/EMG/BR kanaler som er koblet til bioflex ledninger som beskrevet i 1.2.
- Skjær en bioflex ledning i 6 stykker med lengder på 5.0 cm. skallet av polytetrafluoroethylene (PTFE) belegg på begge ender av alle wire bitene med lengder på ~5.0 mm. Koble den ene enden av wire bitene til en av åpne metallisk hullene (ECG/EMG/BR kanaler) på den EIB med en gullnål.
- Skjær en emalje ledning i to 5.0-cm biter. Lodde en ende av hver av disse trådene til bakken/referanse (g/r) kanal på EIB (Figur 3, se også tidligere papirer12,13).
- For utarbeidelse av ECG elektroder, kuttet en bioflex wire i to 16 cm biter. Løsner PTFE belegget av brikkene wire lengder ~5.0 mm på den ene enden (Kortside) og ~ 15 mm på den andre enden (lange enden).
- Danne en wire ring med en diameter på 2.0 mm ved å bøye den lange enden av ledningen, og bestemmer formen på ringen av lodding.
- For utarbeidelse av EMG elektroder, kuttet en bioflex wire i 2 deler med lengder på 8 cm. skallet av PTFE belegget fra begge ender av brikkene wire med lengder ~5.0 mm.
- For utarbeidelse av BR elektroder, kuttet en bioflex wire i 2 deler med lengder på 6.0 cm. skallet av emalje belegget på begge ender av brikkene wire med lengder på ~5.0 loddetinn mm. en ende av hver av disse wire brikkene i hodet av en rustfritt stål skrue (stem dia meter: 1.0 mm, stamme lengde: 4.0 mm).
- For utarbeidelse av bakken/referanse (gr) elektroder, kuttet en emalje wire i 2 deler med lengder på 6.0 cm. skallet av emalje belegget på begge ender av brikkene wire med lengder ~5.0 mm. loddetinn en slutten av brikkene wire til hodet av rustfritt-m ål skruen (stem diameter: 1,4 mm, stamme lengde: 3.0 mm).
- Gass sterilisere alle elektroder og rustfritt skruer og holde disse i ren plass.
2. implantering av EKG/EMG elektrodene
Merk: Utfør alle kirurgiske trinnene med steril teknikk bruke steriliserte hansker og autoklaveres instrumenter. Sterilisere huden med 70% etanol før alle trinnene med etableringen av et snitt, og dekke i snitt med kirurgisk gardiner.
- Fikse en bedøvet (1.0-3.0% isoflurane gass) rotte på ryggen på en flat heten pute. Gi buprenorfin som en analgesic. Plasser veterinær salve på rat's øyne å hindre tørrhet. Bruk betadine for å rengjøre overflaten av huden.
- Gjør en snitt på ~2.0 cm i mediale brystkassen. Utsett interkostalrom musklene ved å skille brystmusklene. Sutur ringene av ECG elektrodene til interkostalrom muskler.
- Fastsette magen på dyret på heten pute. Gjør en snitt på ~1.0 cm i rygg nakke-området.
- Sett inn ECG elektrodene subcutaneously gjennom brystet snittet. Skyv endene til rygg nakke-området, og dra dem ut fra halsen innsnitt. Sutur av brystet såret.
- Sett inn en slutten av EMG elektrodene subcutaneously til en lengde på ~2.0 cm gjennom halsen snittet. Fastsette EMG elektrodene til hals muskelen av suturing.
3. implantering av integrerende Micro-stasjonen matrisen og BR elektrodene
- Fastsette rotta på en stereotaxic enhet. Gjør en snitt på ~3.0 cm på hodet langs midtlinjen fra punktet mellom øynene til nakke-området. Utsett skallen.
- Gjøre to runde craniotomies med diameter på 0,7-1.0 mm over olfactory pære 11.0 mm fremre og 1 mm bilaterale bregma med en høyhastighets drill. Implantatet to BR elektrodene i skallen til tips av skruen stilkene er knyttet til hjernen overflaten.
- Gjøre to runde craniotomies med diameter på 0,7-1.0 mm over frontal cortex 2,7 mm fremre og 2,7 mm bilaterale bregma. Implantatet to g/r elektrodene i skallen til spissen av skruen stammen er knyttet til hjernen overflaten.
- Gjøre seks til åtte hull med diameter på 1.0 mm i området rundt den store craniotomy. Implantatet anker skruene (stem diameter: 1,4 mm, stamme lengde: 3.0 mm) i skallen.
- Gjør en stor sirkulær craniotomy med en diameter på ~2.0 mm over hippocampus 3,8 mm bakre og 2,5 bilaterale bregma. Plass den integrerende mikro-Disks matrisen slik at kanyle spissen av stasjonskjede ligger ovenfor den store craniotomy
- Tomrommet gapet mellom kanyle spissen og hjernen overflaten med ~ 100 µL av to løsninger, dvs., 0,5% (av massen) natrium alginate og 10% (av massen) veisalt.
Merk: Denne prosessen danner en gjennomsiktig gel på ~ 5 min, etter de to løsningene er blandet på skallen. - Dekke kanyle, BR elektroder, g/r elektroder og anker skruene med dental sement med en tykkelse på 0,5 cm. være forsiktig ikke å dekke de åpne endene av BR og g/r elektroder med sement på dette trinnet.
- Lodde de åpne endene av ECG, EMG, BR og g/r elektrodene til personlige wire tips som er tidligere koblet til EIB (se trinnene 1.2 og 1.3).
- Dekke den nederste delen av integrerende mikro-Disks matrise og alle elektrode ledninger, med dental sement. Kontroller at alle elektrode ledningene er fullstendig dekket slik at rotta ikke klø dem ut når implantation.
- Etter gjenvinne tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency, tilbake dyret til sin gjennomsiktig PLEXIGLASS hjem cag, og holde det på egen hånd med gratis tilgang til vann og mat. Etter operasjonen, infiserer dyret med antibiotika (gentamicin).
- Etter operasjonen, overvåke dyrene med daglige observasjon. Kontroller at de går riktig, og at de ikke pip når eksperimentator berører mikro-Disks matrise.
4. i Vivo opptak
Merk: Alle signaler er forsterket, samplet på 2 kHz, og båndpass filtrerte (0.1 - 500 Hz) unntatt enhet aktiviteter (samplet på 30 kHz og båndpass filtrerte (500-6 kHz)).
- Koble EIB i integrerende micro-stasjonen matrisen til headstage av en opptaksenhet.
- Gå til tetrodes ved å dreie skruene for et par uker etter operasjonen. Når tetrodes er tilstøtende hjernen målområder, bosette seg i tetrodes i områdene over flere dager for stabil innspillinger.
- Overvåk de elektriske signalene mens dyret fritt beveger seg i en innspilling kammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden kan samtidig ta bioelektrisk signaler fra flere organer som representerer neuronal aktiviteten til hjernen, hjertefrekvens, rytme, og skjelettlidelser muskelsammentrekninger (figur 1). Figur 4 gir representant registrering av data fra en fritt flyttende rotte som var fritt beite i en rektangulær boks (25 × 40 cm2). Eksempel datasettet inkluderer typisk opptreden overganger mellom bevegelse og hvile stater. En makt spektrum var beregnet fra hippocampus LFP spor av wavelet analyse. BR signalet innspilt fra areal på olfactory pære ble brukt til å beregne omtrent relative endringene puste frekvenser, slik som de som oppstår under utforskende sniffing atferd.
Figur 1 : Illustrasjon av innspillingssystem for overvåking flere hjernen-kropp signaler fra en fritt flyttende rotte. Alle bioelektrisk signaler (LFP, EKG, EEG, BR signaler) fra en fritt flyttende rotte er samlet i integrerende microdrive matrisen montert på hodet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : En integrerende mikro-Disks matrise. Alle LFP, ECG, EEG og BR signaler overføres i hullene på EIB som angis av pilene. Prikket området er forstørret i panelet til høyre, og viser noen av tetrodes stikker fra mikro-Disks matrise som settes inn i hjernevevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : En ovenifra EIB. EIB inkluderer 24 kortikale LFP (LFP) kanaler som er koblet til tetrodes, 2 ECG kanaler, 2 EMG kanaler, 2 BR kanaler og 2 bakken (Gr) kanaler. Alle stasjonene bortsett fra LFP kanalene var koblet til isolert ledninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Et eksempel på samtidige flerkanals innspillingen av bioelektrisk signaler.
(Fra topp til bunn) LFP signaler i somatosensory cortex (skala bar: 250 µV). LFP signaler i hippocampus CA1 regionen (skala bar: 500 µV). Et fargekodet makt spekter av hippocampus LFP sporingen. Et EKG-signal (båndpass filtrert på 20-200 Hz, skala bar: 500 µV). Et EMG signal (båndpass filtrert på 100-500 Hz, skala bar: 100 µV). Et BR signal (skala bar: 500 µV). Et fargekodet makt spekter av BR signalet som indikerer sniffing atferd som definert av en forbigående økning puste rate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å forstå hvordan hjernen modulerer perifere aktivitetsnivå, og vice versa, store opptak metoder å samtidig fange elektriske biosignals fra flere områder i kroppen er nødvendig. Denne studien beskrevet en kirurgisk prosedyre og en innspillingssystem for overvåking av cerebral lokale feltet potensialene, hjerte priser, omfanget av muskel bygging og respiratoriske priser, som er blitt bedre på et opptak-system som brukes til ekstracellulære opptakene i hjernevev. Dette systemet samler elektriske signaler fra både hjernen og eksterne organer i en enkelt EIB på en integrerende mikro-Disks matrise. Utarbeidelse av integrerende micro-stasjonen matrisen skal startes flere timer før operasjonen, som det tar litt tid. Her, stasjonskjede inkluderer tetrodes for opptak hjernen lokale feltet potensialene, men andre typer metall elektroder, som platina og tungsten elektroder, kan knyttes til EIB hvis endene av disse elektrodene er riktig loddet. Når du følger de kirurgiske prosedyrene i protokollen, har erfarne forskere kunnet fullføre alle prosedyrene innen 2-3 timer.
Et viktig skritt i denne protokollen er plasseringen av elektrodene på vev, spesielt for EKG-en og EMG elektrodene. Flere trening gjentakelser kan bli pålagt å få stabile innspillinger. Hittil, vært alle opptak stabil minst en måned etter operasjonen. Forskere bør merke seg at hvis signal-til-støy-forhold av de innspilte dataene blir lav, problemet skyldes ofte løs fixations av bakken/referanse elektrodene eller utilstrekkelig lodding av ledningene mellom EIBs eller andre endene av ledninger. Sammenlignet med en konvensjonell elektrofysiologiske innspilling med noen uavhengige enheter, er fordelene ved denne metoden at (1) det er teknisk enkelt å gjennomføre, hvis trent flere ganger, (2) den ikke krever et kommunikasjonssystem synkronisere flere enheter, (3) det reduserer samlede eksperimentelle kostnader, bare en innspillingsenhet er nødvendig, og (4) alle registrert data filer kan håndteres av samme behandlingsmetode og program, som øker effektiviteten av dataanalyse. Videre gjelder metodologiske konseptet for mange kombinasjoner av flere områder av hjernen og eksterne organer, inkludert luftveiene, sirkulasjonssystemet og autonome nervesystemet. Det er også gjelder for alle kommersielt tilgjengelige elektrisk innspillingsenhet. Samtidig overvåking av systemisk fysiologisk aktivitet mønstre ved hjelp av denne metoden vil være nyttig i Klargjørende neuronal aktivitet mønstre i ulike fysiologiske stater mot emosjonelle utfordringer, eksterne sensoriske modulasjon, og patologiske sykdommer, fører til økt forståelse av biologiske mekanismene bak tilknytningen hjernen-kropp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Kak-Hei (17 H 05939, 17 H 05551), Nakatomi Foundation, og Suzuken Memorial Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FEP Hookup Wire Stranded Stainless Steel | Cooner Wire Company, Chatsworth, CA | AS 633 | Bioflex wire |
| EIB-36-PTB | Neuralynx, Inc., Bozeman, MT | EIB-36-PTB | EIB |
| Cereplex M | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Digital headstage | |
| Cereplex Direct | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Data acquisition system | |
| UEW polyurethane magnet wire | Oyaide.com, Tokyo, Japan | UEW 0.14mm 20m | Enamel wire |
| SD-102 | Narishige, Tokyo, Japan | SD-102 | High-speed drill |
| Minimo ONE SERIES ver.2 | Minitor Co.,Ltd, Tokyo, Japan | C2012 | High-peed drill Power Supply |
| Provinice 250 mL | Shofu Inc., Kyoto, Japan | 213620136 | Dental cement |
| Small Animal Anesthetizer | Biomachinery, Chiba, Japan | TK-7 | Anesthetizer |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B7536-1ML | Analgesic |
| Isoflurane | DS Pharma Animal Health, Osaka, Japan | Isoflu 250mL | |
| Vaseline, White | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 224-00165 | Vet ointment |
| Sodium alginate | Nacalai tesque, Kyoto, Japan | 31131-85 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 031-00435 | |
| Stainless steel screw M1.0×4.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617504 | Stainless steel screw for BR electrodes |
| Stainless steel screw M1.4×3.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617687 | Stainless steel screw for g/r electrodes and anchors |
References
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication. JoVE. (26), e1094 (2009).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (26), e1098 (2009).
- Jog, M. S., et al. Tetrode technology: advances in implantable hardware, neuroimaging, and data analysis techniques. J Neurosci Methods. 117 (2), 141-152 (2002).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nat Protoc. 11 (1), 61-86 (2016).
- Rossi, S., et al. The effect of aging on the specialized conducting system: a telemetry ECG study in rats over a 6 month period. PLoS One. 9 (11), 112697 (2014).
- Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory mice. JoVE. (57), (2011).
- Zeredo, J. L., Kumei, Y., Shibazaki, T., Yoshida, N., Toda, K. Measuring biting behavior induced by acute stress in the rat. Behav Res Methods. 41 (3), 761-764 (2009).
- Young, G. A., Khazan, N. Electromyographic power spectral changes associated with the sleep-awake cycle and with diazepam treatment in the rat. Pharmacol Biochem Be. 19 (4), 715-718 (1983).
- Oishi, Y., et al. Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice. JoVE. (107), e53678 (2016).
- Chaput, M. A. Respiratory-phase-related coding of olfactory information in the olfactory bulb of awake freely-breathing rabbits. Physiol Behav. 36 (2), 319-324 (1986).
- Ravel, N., Pager, J. Respiratory patterning of the rat olfactory bulb unit activity: Nasal versus tracheal breathing. Neurosci Lett. 115 (2-3), 213-218 (1990).
- Okada, S., Igata, H., Sakaguchi, T., Sasaki, T., Ikegaya, Y. A new device for the simultaneous recording of cerebral, cardiac, and muscular electrical activity in freely moving rodents. J Pharmacol Sci. 132 (1), 105-108 (2016).
- Sasaki, T., Nishimura, Y., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Central and Peripheral Bioelectrical Signals in a Freely Moving Rodent. Biol Pharm Bull. 40 (5), 711-715 (2017).
