Summary
Cette étude présente une méthode pour l’enregistrement simultané des potentiels de champs locaux dans le cerveau, les électrocardiogrammes, les électromyogrammes et respiration des signaux d’un rat librement mobile. Cette technique, ce qui réduit les coûts de l’expérimentales et simplifie l’analyse des données, contribuera à la compréhension des interactions entre le cerveau et les organes périphériques.
Abstract
Suivi de la dynamique physiologique du cerveau et des tissus périphériques est nécessaire pour aborder un certain nombre de questions sur comment les contrôles cerveau corps des fonctions et des rythmes de l’organe interne lorsque les animaux sont exposés à des défis émotionnels et des changements dans leur milieux de vie. En général, des expériences et des signaux provenant de différents organes comme le cerveau et le coeur, sont enregistrées par les systèmes d’enregistrement indépendant qui nécessitent de multiples dispositifs d’enregistrement et des procédures différentes pour le traitement des fichiers de données. Cette étude décrit une nouvelle méthode qui peut surveiller simultanément une unité électrique, dont des dizaines de potentiels de champs locaux dans plusieurs régions du cerveau, électrocardiogrammes qui représentent le rythme cardiaque, les électromyogrammes qui représentent éveillé / la contraction des muscles liés au sommeil et respiration des signaux, chez un rat librement mobile. La configuration de l’enregistrement de cette méthode est basée sur un tableau de micro-lecteur conventionnel pour enregistrements potentiels corticaux champ local dans lequel des dizaines d’électrodes sont hébergés, et les signaux provenant de ces électrodes sont intégrés dans un seul Tableau ELECTRIQUE monté sur la tête de l’animal. Ici, ce système d’enregistrement a été amélioré afin que les signaux émis par les organes périphériques sont également transférés à une carte d’interface électrique. En une seule chirurgie, électrodes sont implantées tout d’abord séparément dans les parties du corps approprié et les zones de cerveau de cibles. Les extrémités ouvertes de l’ensemble de ces électrodes sont ensuite soudées aux canaux individuels du Conseil électrique au-dessus de la tête de l’animal afin que tous les signaux peuvent être intégrés dans le tableau ELECTRIQUE seul. Brancher cette carte à un appareil d’enregistrement permet la collecte de tous les signaux dans un seul appareil, ce qui réduit les coûts de l’expérimentales et simplifie le traitement des données, car toutes les données peuvent être traitées dans le même fichier de données. Cette technique facilitera la compréhension des corrélats neurophysiologiques des associations entre les organes centraux et périphériques.
Introduction
Le système nerveux central contrôle des États de corps en réponse à divers changements environnementaux, et ce contrôle est généralement représenté comme des variations de fréquence cardiaque, le rythme respiratoire et contractions musculaires. Cependant, peu d’études ont testé comment ces facteurs physiologiques périphériques sont associés à l’activité corticale. Pour résoudre ce problème, une méthode d’enregistrement à grande échelle pour une unité électrique des tissus périphériques et centraux de surveillance est nécessaire. Dans le cortex cérébral, les signaux (LFP) potentiels de champ local sont extracellulaire enregistrés par électrodes insérées dans les tissus corticaux1,2,3. Pour enregistrer simultanément plusieurs signaux LFP des régions corticales de petits mammifères, tels que les rats et les souris, un certain nombre d’études ont mis au point différents types d’ensembles d’électrodes sur mesure qui sont appelés micro-disques. Un micro-commande conventionnelle est composé de vis métalliques pour les parties du milieu des électrodes (qui sont généralement des tétrodes), un organisme de base pouvant accueillir des vis et des électrodes et une carte d’interface électrique (BEI) qui accueille des trous métalliques à Raccordez les extrémités ouvertes des électrodes (Figure 1, Figure 2et Figure 3). Cette électrode permet au conducteur de contrôler la profondeur de nombreuses électrodes insérées dans le cerveau au cours de quelques jours ou semaines et permet la réalisation des enregistrements chronique à long terme de l’activité neuronale que l’animal est remise en question avec divers tâches comportementales. Dans les organes périphériques, signaux de battement de coeur sont comptabilisés comme électrocardiogrammes (ECG) par une paire d’électrodes qui sont implantés sur ou autour du coeur zone4,5,6, et les signaux de muscle squelettique sont enregistrés comme les électromyogrammes (EMG) avec électrodes insérées dans le muscle tissu7,8,9. Seule unité enregistrements10,11a étudié la relation entre les signaux électriques du bulbe olfactif et le rythme de la respiration (BR). Dans les systèmes d’enregistrement classiques, ces signaux de différents tissus ont été capturées par des appareils d’enregistrement indépendant, qui signifie qu’un système d’expérimentation supplémentaire est nécessaire pour synchroniser avec précision ces dispositifs multiples pour simultanée enregistrements de signaux du cerveau-corps. Ce système a été développé pour régler ce problème. Dans ce système, tous les signaux électriques dans les organes périphériques, y compris les ECG, EMG et les signaux électriques du bulbe olfactif qui reflètent le rythme de la respiration, sont intégrés dans un seul micro-disque matrice1,2 ,3, appelé ici un tableau de micro-lecteur intégratif. Ce système exige qu’un dispositif d’enregistrement multicanal et s’applique à n’importe quel tableau de micro-lecteur conventionnel. Les avantages de cette technique sont qu’il ne nécessite pas des dispositifs spéciaux ou des signaux de déclenchement pour correspondre à la durée d’enregistrement de plusieurs appareils, et qu’il permet plus pratique informatique, étant donné que tous les signaux sont enregistrés comme des types de données similaires. Cette technique facilitera la compréhension des corrélats neurophysiologiques des associations entre les organes centraux et périphériques. Cet article présente les procédures associées à la technique et des ensembles de données représentatives provenant d’un rat.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été effectuées selon les directives des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux.
1. préparation du tableau Micro-Drive intégrative
- Créer un tableau de micro-lecteur pour des enregistrements de LFP corticales décrites ailleurs1,2,3. Congé au moins 6 trous métalliques ouvrir sur une carte d’interface électrode (BEI) pour une utilisation comme canaux d’ECG/EMG/BR qui sont connectés aux fils de bioflex comme décrit dans 1.2.
- Couper un fil bioflex en 6 morceaux avec des longueurs de 5,0 cm. Peel off le polytétrafluoroéthylène (PTFE) enduit des deux extrémités de tous les morceaux de fil avec des longueurs de ~5.0 mm. Connectez une extrémité de chacune des pièces fil à l’un des trous métalliques ouverts (canaux ECG/EMG/BR) sur la BEI avec une épingle d’or.
- Couper un fil d’émail en deux morceaux de 5,0 cm. Soudez une extrémité de chacun de ces fils pour les canaux sol/référence (v/r) de la BEI (Figure 3, voir aussi précédents documents12,13).
- Pour la préparation des électrodes ECG, coupez un fil bioflex en deux morceaux de 16 cm. Décoller le revêtement PTFE des extrémités de ces morceaux de fil d’une longueur de ~5.0 mm à une extrémité (l’extrémité courte) et environ 15 mm sur l’autre extrémité (partie longue).
- Forment un anneau de fil d’un diamètre de 2,0 mm en pliant le long bout du fil et la forme de l’anneau de fixation par soudure.
- Pour la préparation des électrodes EMG, couper un fil bioflex en 2 morceaux avec des longueurs de 8 cm. Peel off le revêtement PTFE par les deux bouts de ces morceaux de fil avec des longueurs de ~5.0 mm.
- Pour la préparation des électrodes de BR, couper un fil bioflex en 2 morceaux avec des longueurs de 6,0 cm. Peel off l’émail des deux extrémités de ces morceaux de fil avec des longueurs de ~5.0 mm. souder une extrémité de chacun de ces morceaux de fil à la tête d’une vis en acier inoxydable (diamètre de tige compteur : 1,0 mm, longueur de la tige : 4. 0 mm).
- Pour la préparation des électrodes de référence/sol (gr), couper un câble émail en 2 morceaux avec des longueurs de 6,0 cm. Peel off l’émail des deux extrémités de ces morceaux de fil avec des longueurs de ~5.0 mm. Soudez une extrémité de chacun de ces morceaux de fil à la tête d’un st-acier inoxydable anguille vis (diamètre de la tige : 1,4 mm, longueur de la tige : 3. 0 mm).
- Gaz stériliser tous les électrodes et les vis en acier inoxydable et gardez ces dans un espace propre.
2. l’implantation des électrodes ECG/EMG
Remarque : Effectuez toutes les étapes chirurgicales avec une technique aseptique à l’aide de gants stérilisés et des instruments stérilisés à l’autoclave. Pour toutes les étapes, impliquant la création d’une incision, stériliser la peau avec l’éthanol à 70 % avant et couvrir l’incision avec draps chirurgicaux.
- Difficulté une anesthésié rat (1,0 à 3,0 % isoflurane gaz) sur le dos sur une bouillote plat. Donner la buprénorphine comme analgésique. Placer la pommade vétérinaire sur yeux de rat pour prévenir le dessèchement. Utilisez betadine pour nettoyer la surface de la peau.
- Faire une incision de ~2.0 cm dans la région de la poitrine médial. Exposer les muscles intercostaux en séparant les muscles de la poitrine. Suturer les anneaux des électrodes ECG aux muscles intercostaux.
- Fixer l’estomac de l’animal sur la bouillote. Faire une incision de ~1.0 cm dans la région du cou dorsale.
- Insérer les électrodes ECG par voie sous-cutanée dans l’incision de la poitrine. Faites glisser les extrémités de la région du cou dorsale et les enlèvent de l’incision de cou. Suture de l’incision de la poitrine.
- Insérez une extrémité de chacune des électrodes EMG par voie sous-cutanée à une longueur de ~2.0 cm dans l’incision de cou. Fixer les électrodes EMG pour le muscle du cou rejoignant par suture.
3. implantation du tableau Micro-Drive intégratif et les électrodes de BR
- Difficulté le rat sur un appareil stéréotaxique. Faire une incision de ~3.0 cm sur la tête le long de la ligne médiane du point entre les yeux à la région du cou. Exposer le crâne.
- Faire deux craniotomies circulaires avec un diamètre de 0,7 à 1,0 mm au-dessus du bulbe olfactif antérieur 11,0 mm et 1 mm bilatéraux à bregma avec une perceuse à haute vitesse. Implanter deux électrodes BR dans le crâne jusqu'à l’extrémité de la tige de vis est attachées à la surface du cerveau.
- Faire deux craniotomies circulaires avec un diamètre de 0,7 à 1,0 mm au-dessus du cortex frontal 2,7 antérieur et 2,7 mm bilatéral au bregma. Implanter deux électrodes g/r dans le crâne jusqu'à l’extrémité de la tige de la vis est attachée à la surface du cerveau.
- Faire six à huit trous d’un diamètre de 1,0 mm dans la zone entourant la grande craniotomie. Vis d’ancrage de l’implant (diamètre de la tige : 1,4 mm, longueur de la tige : 3. 0 mm) dans le crâne.
- Faire une grande craniotomie circulaire d’un diamètre ~2.0 mm au-dessus de l’hippocampe postérieure 3,8 mm et 2,5 mm bilatéraux au bregma. Place le tableau de micro-lecteur intégratif telle que l’extrémité de la canule de la baie se trouve au-dessus de la grande craniotomie
- Remplir l’espace vide entre l’extrémité de la canule et la surface du cerveau de ~ 100 µL de deux solutions, c'est-à-dire., alginate de sodium 0,5 % (en masse) et le chlorure de calcium 10 % (en masse).
Remarque : Ce processus forme un gel transparent en ~ 5 min, après que les deux solutions sont mélangées sur le crâne. - Couvrir la canule, les électrodes de BR, les électrodes g/r, et vis d’ancrage avec un ciment dentaire avec une épaisseur de 0,5 cm. être attentif pas pour couvrir les extrémités ouvertes des électrodes BR et g/r avec le ciment à cette étape.
- Souder les extrémités ouvertes des électrodes ECG, EMG, BR et g/r pour les bouts de fil qui ont été précédemment connectés à la BEI (voir les étapes 1.2 et 1.3).
- Recouvrir la partie inférieure de la micro-disque matrice intégrative et tous les fils de l’électrode, avec du ciment dentaire. Veiller à ce que tous les câbles d’électrode sont entièrement recouvert de sorte que le rat ne peut pas les rayer après l’implantation.
- Après avoir repris conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal, retourner l’animal à sa cag de maison en Plexiglas transparent et garder sur ses propres avec un accès gratuit à l’eau et de nourriture. Après la chirurgie, traiter l’animal avec des antibiotiques (gentamicine).
- Après la chirurgie, surveiller les animaux avec observation quotidienne. Vérifiez qu’ils marchent correctement, et qu’ils grincer pas lorsque l’expérimentateur touche le micro-multidisque.
4. in Vivo Recordings
Remarque : Tous les signaux sont amplifiés, échantillonné à 2 kHz et passe-bande filtré (0,1 - 500Hz) à l’exception des activités de l’unité (échantillonnés à 30kHz et passe-bande filtré (500 à 6 kHz)).
- Connecter la BEI du tableau micro-lecteur intégrative à la tête d’un appareil d’enregistrement.
- Faire progresser les tétrodes en tournant les vis pendant quelques semaines après la chirurgie. Une fois les tétrodes sont adjacentes aux zones cible de cerveau, régler les tétrodes dans les zones sur une période de plusieurs jours pour des enregistrements stables.
- Surveiller les signaux électriques tandis que l’animal se déplace librement dans une chambre d’enregistrement.
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Representative Results
Cette méthode peut capturer simultanément des signaux bioélectriques de plusieurs organes et qui représentent l’activité neuronale du cerveau, du rythme cardiaque, respiration rythmique et des contractions de muscle squelettique (Figure 1). Figure 4 fournit des données d’enregistrement représentant un rat librement mobile qui a été librement chercher leur nourriture dans une boîte rectangulaire (25 x 40 cm2). L’exemple dataset inclut typiques transitions comportementales entre mouvement et de repos des États. Un spectre de puissance a été calculé d’une trace LFP hippocampe par analyse par ondelettes. Le signal de BR enregistré de la surface du bulbe olfactif a servi à estimer grossièrement les variations relatives de fréquences, comme celles qui se produisent pendant le comportement exploratoire de reniflement de respiration.
Figure 1 : Illustration du système d’enregistrement pour plusieurs cerveau-organe de surveillance des signaux de rat librement mobile. Tous les signaux bioélectriques (LFP, ECG, EEG, BR signaux) d’un rat librement mobile sont rassemblés dans le tableau intégrative-microdrive monté sur la tête. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Un tableau de micro-lecteur intégratif. LFP, ECG, EEG et BR tous les signaux sont transmis aux trous de la BEI comme indiqué par les flèches. La zone en pointillés est amplifiée dans le panneau de droite et affiche certaines des tétrodes qui dépassent de la micro-multidisque insérées dans le tissu cérébral. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Une vue de dessus de la BEI. La BEI comprend 24 canaux corticale de LFP (LFP) qui sont connectés aux tétrodes, 2 ECG canaux, 2 canaux EMG, 2 canaux de BR et 2 canaux de sol (Gr). Toutes les chaînes sauf les canaux LFP étaient reliés à des fils isolant. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Un exemple de l’enregistrement simultané de plusieurs canaux de signaux bioélectriques.
(De haut en bas) Signaux LFP dans le cortex somatosensoriel (barre d’échelle : 250 µV). Signaux LFP dans la région de l’hippocampe CA1 (barre d’échelle : 500 µV). Un spectre de puissance code couleur de la trace LFP hippocampe. Un signal ECG (passe-bande filtré à 20-200 Hz, barre d’échelle : 500 µV). Un signal EMG (passe-bande filtré à 100-500 Hz, barre d’échelle : 100 µV). Un signal de BR (barre d’échelle : 500 µV). Un spectre de couleur de puissance du signal BR qui indique reniflant comportement tel que défini par une augmentation transitoire du taux de respiration. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Pour comprendre comment le cerveau module les niveaux d’activité périphérique et vice versa, à grande échelle, enregistrement des méthodes pour capturer simultanément une unité électrique de plusieurs parties du corps sont nécessaires. Cette étude décrit une intervention chirurgicale et un système d’enregistrement pour la surveillance des potentiels de champs locaux cérébrale, rythme cardiaque, l’ampleur de la construction musculaire et des taux respiratoires, qui ont été améliorées sur un système d’enregistrement qui est utilisé pour enregistrements extracellulaires dans le tissu cérébral. Ce système recueille les signaux électriques à la fois le cerveau et les organes périphériques dans un seul BEI sur une baie de lecteur de micro intégrative. La préparation de la micro-disque matrice intégrative doit commencer au moins plusieurs heures avant la chirurgie, car il faut un certain temps. Ici, le tableau de commande comprend des tétrodes pour l’enregistrement des potentiels de champs locaux de cerveau, mais les autres types d’électrodes métalliques, tels que les électrodes de platine et de tungstène, peuvent être attachés à la BEI si les extrémités de ces électrodes sont correctement soudées. Si vous suivez les procédures chirurgicales dans le protocole, expérimentateurs chevronnés ont été en mesure d’effectuer toutes les procédures dans les 2-3 h.
Une étape cruciale dans le présent protocole est le positionnement des électrodes sur les tissus, surtout pour les électrodes ECG et EMG. Plusieurs répétitions de formation pourraient être tenues d’obtenir enregistrements stables. A ce jour, tous les enregistrements ont été stables au moins un mois après la chirurgie. Expérimentateurs doivent noter que, si les rapports signal-bruit des données enregistrées faiblissent, ce problème est fréquemment en raison de fixations desserrées des électrodes/repérage au sol, ou soudure insuffisante des extrémités des fils entre le ce ou les autres extrémités des fils. Par rapport à un enregistrement électrophysiologique conventionnel à l’aide de certains appareils indépendants, les avantages de cette méthode sont que (1) il est techniquement simple à effectuer, si formé plusieurs fois, (2) il ne nécessite pas un système de communication pour synchroniser plusieurs périphériques, (3), il réduit les coûts dans l’ensemble expérimentales, qu’un appareil d’enregistrement est requis, et (4) toutes les données fichiers peuvent être gérés par le programme, qui augmente l’efficacité de l’analyse des données et la même méthode de traitement enregistrement. En outre, le concept méthodologique s’applique à beaucoup de combinaisons de plusieurs régions du cerveau et les organes périphériques, y compris le système respiratoire, circulatoire et système nerveux. Il est également applicable à n’importe quel appareil d’enregistrement électrique disponible dans le commerce. Simultanée de suivi d’activité physiologique systémique à l’aide de cette méthode sera utile dans l’élucidation des patterns d’activité neuronale dans différents États physiologiques contre défis émotionnels, modulation sensorielle externe et pathologique maladies, menant à une meilleure compréhension des mécanismes biologiques qui sous-tendent l’association cerveau-corps.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par ismael-Salut (17 H 05939 ; 17 H 05551), la Fondation Nakatomi et la Suzuken Memorial Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FEP Hookup Wire Stranded Stainless Steel | Cooner Wire Company, Chatsworth, CA | AS 633 | Bioflex wire |
| EIB-36-PTB | Neuralynx, Inc., Bozeman, MT | EIB-36-PTB | EIB |
| Cereplex M | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Digital headstage | |
| Cereplex Direct | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Data acquisition system | |
| UEW polyurethane magnet wire | Oyaide.com, Tokyo, Japan | UEW 0.14mm 20m | Enamel wire |
| SD-102 | Narishige, Tokyo, Japan | SD-102 | High-speed drill |
| Minimo ONE SERIES ver.2 | Minitor Co.,Ltd, Tokyo, Japan | C2012 | High-peed drill Power Supply |
| Provinice 250 mL | Shofu Inc., Kyoto, Japan | 213620136 | Dental cement |
| Small Animal Anesthetizer | Biomachinery, Chiba, Japan | TK-7 | Anesthetizer |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B7536-1ML | Analgesic |
| Isoflurane | DS Pharma Animal Health, Osaka, Japan | Isoflu 250mL | |
| Vaseline, White | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 224-00165 | Vet ointment |
| Sodium alginate | Nacalai tesque, Kyoto, Japan | 31131-85 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 031-00435 | |
| Stainless steel screw M1.0×4.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617504 | Stainless steel screw for BR electrodes |
| Stainless steel screw M1.4×3.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617687 | Stainless steel screw for g/r electrodes and anchors |
References
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