Summary
Это исследование вводит метод для одновременной записи местных потенциалов поля в мозг, электрокардиограммы, электромиограммы и дыхание сигналы свободно движущихся крысы. Это техника, которая снижает затраты на экспериментальной и упрощает анализ данных, будет способствовать пониманию взаимодействия между мозгом и периферийных органов.
Abstract
Мониторинга физиологических динамика головного мозга и периферических тканях необходима для решения ряда вопросов о как мозг контроль тела функции и ритмы, внутренний орган когда животные подвергаются эмоциональные проблемы и изменения в их условий жизни. В целом эксперименты, сигналы от различных органов, таких как мозг и сердце, записываются в системах независимые записи, которые требуется несколько устройств записи и различные процедуры для обработки файлов данных. Это исследование описывает новый метод, который может одновременно контролировать электрические биосигналов, включая десятки местных потенциалов поля в нескольких областях мозга, электрокардиограммы, которые представляют сердечного ритма, электромиограммы, которые представляют проснулся / связанных с сна мышц и дыхание сигналов, свободно движущихся крыс. Запись конфигурации этот метод основан на обычных микро дисковый массив для корковых местах потенциальных записей, в которых размещаются десятки электродов, и сигналы, полученные из этих электродов интегрированы в единый Шкафы электрические монтируется на голову животного. Здесь эта система записи была улучшена, так что сигналы от периферических органов также передаются электрические интерфейсная плата. В одной операции электроды сначала отдельно имплантируется в целевых областях мозга и соответствующие части. Открытые концы всех этих электродов затем припаиваются к отдельным каналам электрической платы выше головы животного так, что все сигналы могут быть интегрированы в одноплатный электрические. Подключение к устройству записи этот Совет позволяет осуществлять сбор всех сигналов в единое устройство, которое уменьшает экспериментальной расходы и упрощает обработку данных, поскольку все данные могут быть обработаны в один и тот же файл данных. Эта техника будет способствовать пониманию нейрофизиологических коррелятов ассоциаций между органами Центральной и периферической.
Introduction
Центральной нервной системы контролирует орган государства в ответ на различные экологические изменения, и этот элемент управления обычно представлены как изменения в пульс, частоту дыхания и сокращения мышц. Однако несколько исследований проверили, как такие периферийные физиологические факторы связаны с корковой активности. Для решения этой проблемы, необходимо крупномасштабных записи метод для контроля электрических биосигналов из центральных и периферических тканей. В коре местах потенциал (LFP) сигналы записываются внеклеточно электродов, которые вставляются в кортикальной тканей1,2,3. Одновременно записать несколько LFP сигналы из коркового регионов мелких млекопитающих, таких как крыс и мышей, ряд исследований были разработаны различные типы сборок на заказ электрода, которые называются микро диски. Обычные микро привод состоит из металлических винтов придает средней части электродов (которые обычно tetrodes), основного органа, который вмещает винты и электродов и электрические интерфейсная плата (ЕИБ) которая приспосабливает металла отверстия для Соедините открытые концы электродов (рис. 1, рис. 2и рис. 3). Эта Ассамблея электрода позволяет оператору контролировать глубину многих электродов, вставляется в мозге в течение дней до нескольких недель и позволяет проводить долгосрочный хронический записи активности нейронов, как животное оспаривается с различными поведенческих задач. В периферических органах сердцебиение сигналы регистрируются как электрокардиограммы (ЭКГ) с помощью пары электродов, которые имплантированы на или вокруг сердца район4,5,6, и скелетных мышц сигналы записываются как электромиограммы (EMGs) с электродами, которые вставляются в мышечной ткани7,8,9. Отношения между электрических сигналов обонятельные луковицы и ритм дыхания (BR) была изучена с единицей записи10,11. В записи обычных систем, эти сигналы от различных тканей были захвачены независимых записывающих устройств, это означает, что дополнительные экспериментальные системы требуется точно синхронизировать эти несколько устройств для одновременного записи сигналов мозга и тела. Эта система была разработана для преодоления этой проблемы. В этой системе все электрические сигналы, записанных из периферийных органов, включая ЭКГ, EMGs и электрические сигналы от обонятельные луковицы, которые отражают ритм дыхания, интегрированы в единый массив микро привод1,2 ,3, здесь называют массив интегративной микро привод. Эта система требует только одно устройство записи многоканальных и применима для любого обычного массива микро привод. Преимущества этой методики, что она не требует каких-либо специальных устройств или триггера сигналов соответствует время записи нескольких устройств, и это позволяет для более удобной обработки данных, так как все сигналы записываются как одинаковые типы данных. Эта техника будет способствовать пониманию нейрофизиологических коррелятов ассоциаций между органами Центральной и периферической. В этом документе описываются процедуры, связанные с техникой и представляет представитель наборы данных, полученные из крыса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием животных темы были выполнены согласно NIH руководящие принципы для ухода и использования животных.
1. Подготовка интегративной массива, микро привода
- Создайте массив микро привода для корковой LFP записей, как описано в других местах1,2,3. Оставить по крайней мере 6 металлических отверстия открыть на электрод интерфейсная плата (ЕИБ) для использования как ЭКГ/ГРП/BR каналы, которые подключены к bioflex провода, как описано в 1.2.
- Вырезать bioflex проволока на 6 частей с длиной от 5.0 см. пилинг покинуть политетрафторэтилена (ПТФЭ) покрытия обоих концах кусочков проволоку длиной ~5.0 мм. Подключите один конец каждого из проволоки штук одного из открытых металлических отверстий (ЭКГ/ГРП/BR каналов) на ЕИБ с золото pin.
- Вырежьте эмаль провод на две части 5.0-см. Припой один конец каждого из этих провода на землю/ссылка (g/r) каналы на ЕИБ (рис. 3, см. также предыдущие документы12,13).
- Для подготовки электроды ЭКГ вырежьте bioflex проволока на две части 16-см. Отделите PTFE покрытие заканчивается эти куски проволоки в длину ~5.0 мм на одном конце (короткий конец) и ~ 15 мм на другом конце (длинный конец).
- Форма кольца провод с диаметром 2,0 мм, сгибая длинный конец проволоки и крепление форму кольца с помощью пайки.
- Для подготовки ГРП электродов вырежьте bioflex проволока на 2 куски длиной в 8 см. пил с PTFE покрытием с обеих сторон эти куски проволоки длиной ~5.0 мм.
- Для подготовки BR электродов, вырезать bioflex проволока на 2 куски длиной от 6.0 см. кожуру от эмалевого покрытия обоих концах эти куски проволоки длиной ~5.0 мм. припой один конец каждого из этих частей проволоки в голову из нержавеющей стали винт (стволовых dia метр: 1.0 мм, длина стебля: 4,0 мм).
- Для подготовки земли/ссылка (gr) электродов вырезать эмаль провод на 2 куски длиной от 6.0 см. пилинг от эмалевого покрытия обоих концах эти куски проволоки длиной ~5.0 мм. припой один конец каждого из этих частей проволоки в голову-нерж угорь винт (диаметр штока: 1.4 мм, длина стебля: 3,0 мм).
- Газовой стерилизации всех электродов и винты из нержавеющей и держать их в чистое пространство.
2. Имплантация электродов ЭКГ/ГРП
Примечание: Выполните все хирургические с асептической техники, использованием стерилизованное Перчатки и автоклавного инструментов. Для всех шагов, предполагающие создание разреза стерилизовать кожи с 70% этанол до и охватывать разрез с хирургической драпировкой.
- Исправить наркотизированных крыс (1,0-3,0% изофлюрановая газ) на задней панели плоские тепла. Дать бупренорфина как анальгетик. Место Ветеринарные мази на глаза крыс для предотвращения сухости. Используйте Бетадин для очистки поверхности кожи.
- Надрезать ~2.0 см в области медиальной груди. Разоблачить межреберные мышцы, разделяя мышцы груди. Шовные кольца электроды ЭКГ на межреберные мышцы.
- Исправьте в желудке животного на площадку тепла. Надрезать ~1.0 см в области спины шеи.
- Вставьте электроды ЭКГ подкожно через груди разрез. Вставьте концы в области шеи, спины и вытащить их из разрез шеи. Шовные груди разрез.
- Вставьте один конец каждого из ГРП электродов подкожно длиной ~2.0 см через разрез шеи. Исправьте ГРП электродов в мышцы шеи путем наложения швов.
3. Имплантация электродов BR и интегративной микро дисковый массив
- Fix крысу на стереотаксического устройства. Сделайте надрез см ~3.0 на голову вдоль средней точки между глазами в области шеи. Разоблачить черепа.
- Сделать два craniotomies круговой с диаметром 0,7-1,0 мм выше обонятельные луковицы 11.0 мм передней и 1 мм двусторонних bregma с помощью высокоскоростных дрели. Имплантата двух электродов BR в череп, до тех пор, пока кончики стеблей винт прикреплены к поверхности мозга.
- Сделать два craniotomies круговой с диаметром 0,7-1,0 мм выше лобной коры 2,7 мм передней и 2,7 мм двустороннего bregma. Имплантата 2 g/r электроды в череп, до тех пор, пока кончик стержня винта крепится к поверхности мозга.
- В окрестностях больших краниотомии сделайте шесть-восемь отверстий диаметром 1,0 мм. Имплантат якорь винты (диаметр штока: 1.4 мм, длина стебля: 3,0 мм) в черепе.
- Сделать большой краниотомии круговой с диаметром ~2.0 мм над гиппокампа 3,8 мм задняя и 2,5 мм двустороннего bregma. Место интегративной микро дисковый массив, таким образом, чтобы кончик канюли в массив диск расположен над большой краниотомии
- Заполните пространство разрыв между кончиком канюли и поверхности мозга с ~ 100 мкл двух решений, т.е., 0,5% (по массе) альгината натрия и хлорида кальция 10% (по массе).
Примечание: Этот процесс образует прозрачный гель в ~ 5 мин, после того, как два решения смешиваются на черепе. - Обложка канюля, BR электродов, электроды g/r, и якорь винты с стоматологического цемента толщиной 0,5 см. быть осторожным не закрыть открытые концы BR и g/r электродов с цементом на этот шаг.
- Припой открытыми концами электродов ЭКГ, ГРП, BR и g/r советы отдельных проводов, которые ранее были связаны с ЕИБ (см. шаги 1.2 и 1.3).
- Покрытие нижней части интегративной массив микро привод и все провода электрод, с стоматологического цемента. Обеспечить все провода электрода полностью покрыты так, что крысы не поцарапать их после имплантации.
- После восстановления достаточно сознания для поддержания грудной recumbency, вернуть его прозрачный Plexiglas дома cag животное и держать его на свой собственный бесплатный доступ к воде и продовольствию. После операции лечить животных антибиотиками (гентамицин).
- После операции контролировать животных с ежедневные наблюдения. Проверьте, что они ходить правильно, и что они не скрипят, когда экспериментатор касается микро дисковый массив.
4. в естественных условиях записи
Примечание: Все сигналы усиливаются, отведать в 2 кГц и полосовые отфильтрованных (0.1 - 500 Гц) за исключением деятельности единицы (пробы на 30 кГц и полосовые отфильтрованных (500-6 кГц)).
- Подключите ЕИБ интегративной массива микро привод к headstage устройство записи.
- Заранее tetrodes, поворачивая винты на несколько недель после операции. После tetrodes рядом целевых областей мозга, решить tetrodes в области в течение нескольких дней для стабильной записей.
- Контролировать электрические сигналы, в то время как животное свободно перемещается в камере записи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод может одновременно захватить биоэлектрические сигналы от нескольких органов, которые представляют активность нейронов мозга, частота сердечных сокращений, дыхания, ритм и сокращения скелетных мышц (рис. 1). Рисунок 4 обеспечивает представитель запись данных из свободно движущихся крысу, которая свободно нагула в прямоугольной коробке (25 × 40 см2). Пример набора данных включает в себя типичные поведенческих переходы между перемещение и отдыха государств. Мощность спектра был вычислен из гиппокампа трассировки LFP вейвлет-анализа. BR сигнал записан с площади поверхности обонятельные луковицы был использован для примерно оценить относительные изменения в дыхательном частот, например те, которые происходят во время исследовательской нюхают поведение.
Рисунок 1 : Иллюстрация записи системы для мониторинга нескольких мозга и тела сигналы от свободно движущихся крыса. Все биоэлектрические сигналы (LFP, ЭКГ, ЭЭГ, BR сигналы) от свободно движущихся крыса собираются в массив интегративной microdrive, монтируется на голове. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Массив микро привод интегративной. Все LFP, ЭКГ, ЭЭГ и BR сигналы передаются с отверстиями на ЕИБ, как показано стрелочками. Пунктирной области усиливается в правой панели и показывает некоторые из tetrodes, торчащий из массива микро привода, которые вставляются в ткани мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Вид сверху ЕИБ. ЕИБ включает в себя 24 корковых LFP (LFP) каналы, которые подключены к tetrodes, 2 канала ЭКГ, 2 каналов ЭМГ, 2 BR каналов и 2 наземные (Gr) каналы. Все каналы за исключением LFP каналы были подключены к изолированные провода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Пример одновременной записи многоканального биоэлектрических сигналов.
(Сверху вниз) LFP сигналы в соматосенсорной коры (шкалы бар: 250 МКВ). LFP сигналы в регионе СА1 гиппокампа (шкалы бар: 500 МКВ). Цветную мощность спектра гиппокампа LFP трассировки. ЭКГ сигнала (полосовая фильтрация 20-200 Гц, шкалы бар: 500 МКВ). В ГРП сигнал (полосовая фильтрация на 100-500 Гц, шкалы бар: 100 мкВ). BR сигнал (шкалы бар: 500 МКВ). Цветную мощность спектра сигнала BR указывает нюхают поведение, как это определено преходящее повышение дыхания ставки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для понимания того, как мозг модулирует уровни периферической активности и наоборот, крупномасштабные запись методы одновременно захватить электрические биосигналов из нескольких областей тела являются необходимыми. Это исследование описал хирургическая процедура и записи системы для мониторинга мозгового местных потенциалов поля, ЧСС, масштабы строительства мышц и органов дыхания ставки, которые были улучшены на систему записи, которая используется для Внеклеточные записи в ткани мозга. Эта система собирает электрические сигналы от мозга и периферических органов в единого EIB на массив интегративной микро привод. Начата подготовка интегративной микро привод массива должен быть по крайней мере несколько часов до операции, как это занимает некоторое время. Здесь в массив диск включает tetrodes для записи мозга местных потенциалов поля, но другие типы металлических электродов, таких как платина и Вольфрам электроды, может быть присоединен к ЕИБ, если правильно припаяны концы этих электродов. Когда после хирургических процедур в протоколе, опытные экспериментаторы имели возможность завершить все процедуры в течение 2-3 ч.
Важным шагом в рамках этого протокола является позиционирование электродов на ткани, особенно для электродов ЭКГ и ГРП. Несколько повторений подготовки может потребоваться для получения стабильной записи. На сегодняшний день, все записи были стабильными по крайней мере один месяц после операции. Экспериментаторы следует отметить, что, если соотношения сигнал шум записанных данных становится низким, эта проблема обусловлена часто свободные фиксаций земли/Справочник электродов, или недостаточно пайки концы проводов между EIBs или другие концы провода. По сравнению с обычными электрофизиологических записи с помощью некоторых независимых устройств, преимущества этого метода, что (1) это технически просто провести, если обучение несколько раз, (2) не требует системы связи для синхронизации несколько устройств, (3) она уменьшает общей экспериментальной расходы, как только одно устройство записи не требуется, и (4) всех записанных данных, которые могут обрабатываться файлы же метод обработки и программа, которая увеличивает эффективность анализа данных. Кроме того методологическая концепция применима для многих комбинаций нескольких регионов мозга и периферических органов, в том числе дыхательной системы, системы кровообращения и вегетативной нервной системы. Это также применимо к любой коммерчески доступных электрические устройства записи. Одновременный мониторинг системных физиологической активности шаблонов с помощью этого метода будет полезным в изучение моделей нейронной активности в различных физиологических состояний против эмоциональные проблемы, внешних чувств модуляции и патологических заболевания, привело к более глубокому пониманию биологических механизмов, лежащих в основе ассоциации мозга и тела.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Какен Привет (17 H 05939; 17 H 05551), Фонд Накатоми и Suzuken Мемориальный фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FEP Hookup Wire Stranded Stainless Steel | Cooner Wire Company, Chatsworth, CA | AS 633 | Bioflex wire |
| EIB-36-PTB | Neuralynx, Inc., Bozeman, MT | EIB-36-PTB | EIB |
| Cereplex M | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Digital headstage | |
| Cereplex Direct | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Data acquisition system | |
| UEW polyurethane magnet wire | Oyaide.com, Tokyo, Japan | UEW 0.14mm 20m | Enamel wire |
| SD-102 | Narishige, Tokyo, Japan | SD-102 | High-speed drill |
| Minimo ONE SERIES ver.2 | Minitor Co.,Ltd, Tokyo, Japan | C2012 | High-peed drill Power Supply |
| Provinice 250 mL | Shofu Inc., Kyoto, Japan | 213620136 | Dental cement |
| Small Animal Anesthetizer | Biomachinery, Chiba, Japan | TK-7 | Anesthetizer |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B7536-1ML | Analgesic |
| Isoflurane | DS Pharma Animal Health, Osaka, Japan | Isoflu 250mL | |
| Vaseline, White | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 224-00165 | Vet ointment |
| Sodium alginate | Nacalai tesque, Kyoto, Japan | 31131-85 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 031-00435 | |
| Stainless steel screw M1.0×4.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617504 | Stainless steel screw for BR electrodes |
| Stainless steel screw M1.4×3.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617687 | Stainless steel screw for g/r electrodes and anchors |
References
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication. JoVE. (26), e1094 (2009).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (26), e1098 (2009).
- Jog, M. S., et al. Tetrode technology: advances in implantable hardware, neuroimaging, and data analysis techniques. J Neurosci Methods. 117 (2), 141-152 (2002).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nat Protoc. 11 (1), 61-86 (2016).
- Rossi, S., et al. The effect of aging on the specialized conducting system: a telemetry ECG study in rats over a 6 month period. PLoS One. 9 (11), 112697 (2014).
- Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory mice. JoVE. (57), (2011).
- Zeredo, J. L., Kumei, Y., Shibazaki, T., Yoshida, N., Toda, K. Measuring biting behavior induced by acute stress in the rat. Behav Res Methods. 41 (3), 761-764 (2009).
- Young, G. A., Khazan, N. Electromyographic power spectral changes associated with the sleep-awake cycle and with diazepam treatment in the rat. Pharmacol Biochem Be. 19 (4), 715-718 (1983).
- Oishi, Y., et al. Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice. JoVE. (107), e53678 (2016).
- Chaput, M. A. Respiratory-phase-related coding of olfactory information in the olfactory bulb of awake freely-breathing rabbits. Physiol Behav. 36 (2), 319-324 (1986).
- Ravel, N., Pager, J. Respiratory patterning of the rat olfactory bulb unit activity: Nasal versus tracheal breathing. Neurosci Lett. 115 (2-3), 213-218 (1990).
- Okada, S., Igata, H., Sakaguchi, T., Sasaki, T., Ikegaya, Y. A new device for the simultaneous recording of cerebral, cardiac, and muscular electrical activity in freely moving rodents. J Pharmacol Sci. 132 (1), 105-108 (2016).
- Sasaki, T., Nishimura, Y., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Central and Peripheral Bioelectrical Signals in a Freely Moving Rodent. Biol Pharm Bull. 40 (5), 711-715 (2017).
