Summary
Este estudo apresenta um método para a gravação simultânea dos potenciais do campo local no cérebro, eletrocardiogramas, electromyograms e respirando os sinais de um rato andando livremente. Esta técnica, o que reduz custos experimentais e simplifica a análise de dados, irá contribuir para a compreensão das interacções entre o cérebro e os órgãos periféricos.
Abstract
Monitoramento da dinâmica fisiológica do cérebro e tecidos periféricos é necessária para abordar uma série de perguntas sobre como o cérebro controla corpo funções e ritmos do órgão interno, quando os animais são expostos aos desafios emocionais e alterações em seus ambientes de vida. Em geral, experimentos, os sinais de diferentes órgãos, como o cérebro e o coração, registam-se por sistemas de gravação independente que requerem vários dispositivos de gravação e diferentes procedimentos para processamento de arquivos de dados. Este estudo descreve um novo método que pode monitorar simultaneamente bio-sinais elétricos, incluindo dezenas de potenciais locais de campo em várias regiões do cérebro, eletrocardiogramas que representam o ritmo cardíaco, electromyograms que representam acordado / contração muscular com o sono e respirando os sinais, em um rato andando livremente. A configuração de gravação desse método é baseada em uma matriz de microunidade convencional para gravações de potenciais corticais campo local na qual dezenas de eletrodos são acomodadas, e os sinais obtidos esses eletrodos são integrados em um único quadro eléctrico montado na cabeça do animal. Aqui, este sistema de gravação foi melhorado para que os sinais de órgãos periféricos também são transferidos para uma placa de interface elétrica. Em uma única cirurgia, eletrodos primeiro são implantados separadamente em partes do corpo apropriado e as áreas do cérebro de alvo. As extremidades abertas de todos estes eletrodos são então soldadas para canais individuais da placa elétrica acima da cabeça do animal para que todos os sinais podem ser integrados a única placa eléctrica. Esta placa de ligação a um dispositivo de gravação permite para a coleção de todos os sinais em um único dispositivo, o que reduz custos experimentais e simplifica o processamento de dados, pois todos os dados podem ser tratados no mesmo arquivo de dados. Esta técnica ajudará a compreensão dos neurofisiológicos das associações entre órgãos centrais e periféricos.
Introduction
O sistema nervoso central controla Estados de corpo em resposta às mudanças ambientais diferentes, e este controle é tipicamente representado como alterações no ritmo cardíaco, ritmo respiratório e contrações musculares. No entanto, poucos estudos têm testado como fatores fisiológicos periféricos estão associados com atividade cortical. Para resolver esse problema, um método de gravação em grande escala para monitoramento bio-sinais elétrica de tecidos centrais e periféricos é necessário. No córtex cerebral, os sinais do campo local potenciais (LFP) registam-se extracelularmente por eletrodos que são inseridos os tecidos corticais1,2,3. Para gravar simultaneamente múltiplos sinais LFP das regiões corticais de pequenos mamíferos, como ratos e camundongos, vários estudos têm desenvolvido vários tipos de assemblies de eletrodo sob medida que são denominados unidades de micro. A microcarro convencional é composta de anexado às partes médios dos eletrodos (que são tipicamente tetrodes), um corpo de núcleo que acomoda os parafusos e eletrodos e uma placa de interface elétrica (BEI) que acomoda metais furos para parafusos de metal Ligue as extremidades abertas dos eletrodos (Figura 1, Figura 2e Figura 3). Este conjunto de eléctrodo permite ao operador controlar a profundidade de muitos eletrodos inseridos no cérebro ao longo de dias ou semanas e permite a realização de gravações crônicas a longo prazo da atividade neuronal como o animal é desafiado com vários tarefas comportamentais. Nos órgãos periféricos, sinais de batimentos cardíacos são registrados como eletrocardiogramas (ECGs) por um par de eletrodos que são implantados ou em torno do coração área4,5,6, e sinais de músculo esquelético como electromyograms (EMGs) com eletrodos que são inseridos o músculo tecido7,8,9. A relação entre os sinais elétricos do bulbo olfatório e o ritmo respiratório (BR) tem sido estudada com única unidade gravações10,11. Em sistemas de gravação convencional, estes sinais de diferentes tecidos foram capturados por dispositivos de gravação independente, o que significa que um sistema experimental adicional é necessário para sincronizar precisamente estes dispositivos múltiplos para simultânea gravações de sinais do cérebro e corpo. Este sistema foi desenvolvido para superar este problema. Neste sistema, todos os sinais elétricos, gravados a partir de órgãos periféricos, incluindo ECGs EMGs e sinais elétricos do bulbo olfatório que refletem o ritmo de respiração, são integrados em uma única matriz micro drive-1,2 ,3, aqui denominado de uma matriz de microunidade integrativa. Este sistema requer apenas um dispositivo de gravação multi-canal e é aplicável para qualquer matriz de micro-drive convencional. As vantagens desta técnica são que não exige qualquer dispositivos especiais ou sinais de gatilho para coincidir com o tempo de gravação de múltiplos dispositivos, e permite o processamento de dados mais conveniente, desde que todos os sinais são registrados como tipos de dados similares. Esta técnica ajudará a compreensão dos neurofisiológicos das associações entre órgãos centrais e periféricos. Este documento descreve os procedimentos associados com a técnica e apresenta representativos conjuntos de dados obtidos de um rato.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo assuntos animais foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH para o cuidado e o uso de animais.
1. preparação da matriz de Microunidade Integrativa
- Crie uma matriz de micro-drive para gravações de LFP corticais como descrito em outra parte1,2,3. Deixe pelo menos 6 furos metais abertos sobre uma placa de interface de eletrodo (BEI) para uso como canais de ECG/EMG/BR que estão ligados a fios bioflex, conforme descrito no ponto 1.2.
- Cortar um fio de bioflex para 6 peças com comprimentos de 5,0 cm. descasque fora o politetrafluoroetileno (PTFE) revestimento de ambas as extremidades de todos os pedaços de arame com comprimentos de ~5.0 mm. Conecte uma extremidade de cada uma das peças para um dos buracos metálicos abertos (canais de ECG/EMG/BR) fio sobre o BEI com um pin de ouro.
- Corte um fio de esmalte em dois pedaços de 5,0 cm. Solde uma extremidade de cada um destes fios para os canais de terra/referência (g/r), o BEI (Figura 3, ver também anterior papéis12,13).
- Para a preparação de eletrodos de ECG, cortar um fio de bioflex em dois pedaços de 16 cm. Retire o revestimento de PTFE das extremidades destes pedaços de arame em comprimentos de ~5.0 mm em uma extremidade (extremidade curta) e ~ 15mm na outra extremidade (extremidade longa).
- Forma um anel de arame com diâmetro de 2,0 mm, dobrando o final longo do fio e a forma do anel de fixação por solda.
- Para a preparação de eletrodos de EMG, corte um fio de bioflex em 2 pedaços, com comprimentos de 8 cm. descasque fora o revestimento de PTFE, de ambos os lados destes pedaços de arame com comprimentos de ~5.0 mm.
- Para a preparação de eletrodos de BR, cortar um fio de bioflex em 2 pedaços, com comprimentos de 6,0 cm. descasque fora o revestimento de esmalte de ambas as extremidades destes pedaços de arame com comprimentos de ~5.0 mm. Solde uma extremidade de cada um destes pedaços de arame na cabeça de um parafuso de aço inoxidável (diâmetro de haste medidor: 1.0 mm, comprimento da haste: 4.0 mm).
- Para a preparação de eletrodos de terra/referência (gr), corte um fio de esmalte em 2 pedaços, com comprimentos de 6,0 cm. descasque fora o revestimento de esmalte de ambas as extremidades destes pedaços de arame com comprimentos de ~5.0 mm. Solde uma extremidade de cada um destes pedaços de arame na cabeça de um aço inoxidável-st parafuso de enguia (diâmetro da haste: 1.4 mm, comprimento da haste: 3,0 mm).
- Gás esterilizar todos os eléctrodos e parafusos de aço inoxidáveis e mantê-los em um espaço limpo.
2. a implantação dos eléctrodos ECG/EMG
Nota: Execute todas as etapas cirúrgicas com técnica asséptica, usando luvas esterilizadas e instrumentos esterilizados em autoclave. Para todas as etapas que envolvem a criação de uma incisão, esterilizar a pele com álcool 70% antes e cobrir a incisão com cirúrgicos.
- Consertar um anestesiados rato (1,0-3,0% isoflurano gás) de costas sobre uma almofada de calor plana. Dar a buprenorfina como um analgésico. Coloque pomada veterinária sobre os olhos do rato para evitar ressecamento. Use betadine para limpar a superfície da pele.
- Fazer uma incisão de ~2.0 cm na área medial no peito. Expor os músculos intercostais, separando os músculos do peito. Suture os anéis dos eléctrodos ECG para os músculos intercostais.
- Corrigi o estômago do animal na rampa de calor. Fazer uma incisão de ~1.0 cm na área do pescoço dorsal.
- Introduza os eletrodos de ECG por via subcutânea através da incisão no peito. Deslize as pontas para a área do pescoço dorsal e retirá-los da incisão no pescoço. Sutura da incisão no peito.
- Insira uma extremidade de cada um dos eletrodos EMG por via subcutânea para um comprimento de ~2.0 cm através da incisão de pescoço. Fixe os eletrodos de EMG para o músculo do pescoço por sutura.
3. a implantação de matriz de Microunidade integrativa e os eletrodos de BR
- Corrigi o rato em um dispositivo estereotáxica. Fazer uma incisão de ~3.0 cm na cabeça ao longo da linha mediana desde o ponto entre os olhos para a área do pescoço. Expor o crânio.
- Faça duas craniotomias circulares com diâmetros de 0,7-1,0 mm acima do bulbo olfatório anterior 11,0 mm e 1 mm bilateral bregma com uma broca de alta velocidade. Dois eletrodos de BR no crânio do implante até que as pontas das hastes parafuso estão ligadas à superfície do cérebro.
- Fazer duas craniotomias circulares com diâmetros de 0,7-1,0 mm acima do córtex frontal anterior 2,7 mm e 2,7 mm bilateral de bregma. Implante de dois eletrodos g/r no crânio até a ponta da haste parafuso é anexada à superfície do cérebro.
- Faça seis a oito furos com diâmetros de 1,0 mm na área circundante a craniotomia grande. Parafusos de ancoragem do implante (diâmetro da haste: 1.4 mm, comprimento da haste: 3,0 mm) no crânio.
- Fazer uma craniotomia grande circular com um diâmetro de ~2.0 mm acima do hipocampo posterior 3,8 mm e 2,5 mm bilateral de bregma. Coloque a matriz de microunidade Integrativa, tal que a ponta da cânula da matriz unidade situa-se acima a craniotomia grande
- Preencher o espaço de abertura entre a ponta da cânula e a superfície do cérebro com ~ 100 µ l de duas soluções, i. e., alginato de sódio 0,5% (em massa) e cloreto de cálcio 10% (em massa).
Nota: Este processo forma um gel transparente em ~ 5 min, depois que as duas soluções são misturadas no crânio. - Cobrir a cânula, eletrodos de BR, eletrodos g/r, e parafusos de ancoragem com cimento dental com uma espessura de 0,5 cm... ser cuidadoso não para cobrir as extremidades abertas dos eléctrodos BR e g/r com o cimento para esta etapa.
- Solde as extremidades abertas dos eléctrodos de ECG, EMG, BR e g/r para as pontas de fio individual que anteriormente estavam ligadas ao BEI (consulte as etapas 1.2 e 1.3).
- Cobrir a parte inferior da matriz de microunidade integrativa e todos os fios de eletrodo, com cimento dental. Certifique-se de que todos os fios de eletrodo são completamente coberto para que o rato não pode coçá-los após a implantação.
- Depois de recuperar a consciência suficiente para manter a prostração esternal, retornar o animal ao seu cag em casa de acrílico transparente e mantê-lo por conta própria, com livre acesso à água e comida. Após a cirurgia, trate o animal com antibióticos (gentamicina).
- Após a cirurgia, monitore os animais com observação diária. Verifique que andam corretamente, e que eles não rangem quando o experimentador toca a matriz micro drive.
4. in Vivo gravações
Nota: Todos os sinais são amplificados, amostragem de 2 kHz e passa-banda filtrada (0.1 - 500 Hz) exceto para atividades de unidade (band-pass filtrado (500-6 kHz) e amostrados a 30 kHz).
- O BEI da matriz de microunidade Integrativa Conecte o headstage de um dispositivo de gravação.
- Avança os tetrodes girando os parafusos por algumas semanas após a cirurgia. Uma vez que o tetrodes são adjacentes às áreas alvo cérebro, firmar os tetrodes áreas durante um período de vários dias para gravações estáveis.
- Monitore os sinais elétricos, enquanto o animal se move livremente em uma câmara de gravação.
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Representative Results
Esse método pode capturar simultaneamente sinais bioelétricos de múltiplos órgãos que representam a atividade neuronal do cérebro, frequência cardíaca, respiração, ritmo e contrações do músculo esquelético (Figura 1). Figura 4 fornece dados de gravação representativo de um rato livremente movente que foi livremente forrageamento em uma caixa retangular (25 × 40 cm2). O conjunto de dados de exemplo inclui transições comportamentais típicas entre em movimento e Estados de repouso. Um espectro de energia foi computado de um rastreamento LFP hippocampal por análise de wavelet. O sinal de BR, gravado a partir de área da superfície do bulbo olfatório foi usado para estimar aproximadamente as alterações relativas em frequências, tais como aqueles que ocorrem durante o comportamento exploratório de cheirar a respirar.
Figura 1 : Ilustração do sistema de gravação para monitorar o cérebro-corpo múltiplos sinais de um rato andando livremente. Todos os sinais bioelétricos (LFP, sinais de ECG, EEG, BR) de um rato andando livremente são coletados na matriz Integrativa-microdrive montado na cabeça. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Uma matriz de microunidade integrativa. LFP, ECG, EEG e BR todos os sinais são transmitidos para os buracos o BEI como indicado pelas setas. A área pontilhada é ampliada no painel direito e exibe alguns das tetrodes salientes da matriz micro-drive que são inseridos no tecido cerebral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Uma vista superior do BEI. O BEI inclui 24 canais LFP (LFP) cortical que estão conectados para os tetrodes, 2 canais de ECG, 2 canais de EMG, 2 canais de BR e 2 canais de chão (Gr). Todos os canais, exceto os canais LFP foram conectados a fios isolados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Um exemplo da gravação simultânea de múltiplos canal de sinais bioelétricos.
(De cima para baixo) LFP sinais no córtex somatossensorial (barra de escala: 250 MV). LFP sinais na região CA1 hippocampal (barra de escala: 500 mV). Um espectro de potência com codificação de cores do rastreamento LFP hippocampal. Um sinal de ECG (band-pass filtrado a 20-200 Hz, barra de escala: 500 mV). Um sinal de EMG (band-pass filtrado a 100-500 Hz, barra de escala: 100 µV). Um sinal de BR (barra de escala: 500 mV). Um espectro de potência com codificação de cores do sinal BR que indica cheirando comportamento conforme definido por um aumento transitório na taxa de respiração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para entender como o cérebro modula os níveis de atividade periférica e vice versa, em grande escala gravação métodos para capturar simultaneamente bio-sinais elétrica de várias áreas do corpo são necessárias. Este estudo descreveu um procedimento cirúrgico e um sistema de gravação para monitoramento de potenciais de campo local cerebral, cardíaca, a magnitude da construção muscular e as taxas respiratórias, que foram melhoradas em um sistema de gravação que é usado para gravações extracelulares no tecido cerebral. Este sistema recolhe sinais elétricos do cérebro e os órgãos em um único BEI em uma matriz de microunidade integrativa. A preparação da matriz de microunidade Integrativa deve ser iniciada pelo menos várias horas antes da cirurgia, como demora algum tempo. Aqui, a matriz unidade inclui tetrodes para gravação de potenciais de campo local do cérebro, mas os outros tipos de eletrodos de metal, tais como os eléctrodos de platina e tungstênio, podem ser ligados ao BEI se as extremidades destes eletrodos são devidamente soldadas. Quando após os procedimentos cirúrgicos no protocolo, experimentadores experientes foram capazes de completar todos os procedimentos dentro de 2-3 h.
Um passo crítico no âmbito do presente protocolo é o posicionamento dos eletrodos sobre o tecido, especialmente para os eletrodos de ECG e EMG. Várias repetições de treinamento podem ser necessário obter gravações estáveis. Até à data, todas as gravações foram estáveis pelo menos um mês após a cirurgia. Experimentadores devem notar que, se os rácios de sinal-ruído de dados registados, tornar-se baixo, este problema é frequentemente devido a fixações soltas dos eléctrodos de terra/referência ou insuficiente de solda das extremidades dos fios entre o BEI ou as outras pontas do fios. Comparado com uma gravação eletrofisiológica convencional usando alguns dispositivos independentes, as vantagens desse método são que (1) é tecnicamente simples de realizar, se treinou várias vezes, (2) não exige um sistema de comunicação para sincronizar vários dispositivos, (3) reduz os custos em geral experimentais, pois apenas um dispositivo de gravação é necessário, e (4) todos gravados arquivos podem ser manipulados pelo programa, o que aumenta a eficiência da análise de dados e mesmo método de processamento de dados. Além disso, o conceito metodológico é aplicável a muitas combinações de várias regiões do cérebro e órgãos periféricos, incluindo o sistema respiratório, sistema circulatório e sistema nervoso autônomo. Também é aplicável a qualquer dispositivo de gravação elétrica comercialmente disponível. Simultânea de monitoramento de padrões de atividade fisiológica sistêmica usar este método será útil na elucidação de padrões de atividade neuronal em vários Estados fisiológicos contra desafios emocionais, modulação sensorial externo e patológica doenças, levando a uma maior compreensão dos mecanismos biológicos subjacentes a associação do cérebro e corpo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Kaken-Oi (17 H 05939; 17 H 05551), a Fundação Nakatomi e o Suzuken Memorial Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FEP Hookup Wire Stranded Stainless Steel | Cooner Wire Company, Chatsworth, CA | AS 633 | Bioflex wire |
| EIB-36-PTB | Neuralynx, Inc., Bozeman, MT | EIB-36-PTB | EIB |
| Cereplex M | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Digital headstage | |
| Cereplex Direct | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Data acquisition system | |
| UEW polyurethane magnet wire | Oyaide.com, Tokyo, Japan | UEW 0.14mm 20m | Enamel wire |
| SD-102 | Narishige, Tokyo, Japan | SD-102 | High-speed drill |
| Minimo ONE SERIES ver.2 | Minitor Co.,Ltd, Tokyo, Japan | C2012 | High-peed drill Power Supply |
| Provinice 250 mL | Shofu Inc., Kyoto, Japan | 213620136 | Dental cement |
| Small Animal Anesthetizer | Biomachinery, Chiba, Japan | TK-7 | Anesthetizer |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B7536-1ML | Analgesic |
| Isoflurane | DS Pharma Animal Health, Osaka, Japan | Isoflu 250mL | |
| Vaseline, White | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 224-00165 | Vet ointment |
| Sodium alginate | Nacalai tesque, Kyoto, Japan | 31131-85 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 031-00435 | |
| Stainless steel screw M1.0×4.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617504 | Stainless steel screw for BR electrodes |
| Stainless steel screw M1.4×3.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617687 | Stainless steel screw for g/r electrodes and anchors |
References
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